专利名称：类诺瓦克病毒检测试剂的制作方法
技术领域：
已知类诺瓦克病毒(norovirus)是通常导致病毒性食物中毒的一种病毒。本发明涉及用于临床检查、公共健康检查、食物评价和食物中毒检查中检测类诺瓦克病毒的类诺瓦克病毒检测试剂。
现有技术类诺瓦克病毒是人杯状病毒(calicivirus)家族的一员，其基因组为由约7000个碱基的单链RNA组成。类诺瓦克病毒也被称为小圆形结构病毒(SRSV)。
估计日本报导的食物中毒中约20％的病例由病毒导致。在病毒性食物中毒的这些病例的约80％病例中检测到类诺瓦克病毒。主要的感染源是食物，并且生牡蛎通常是问题所在。此外，在婴儿的(散发性)急性肠胃炎中也检测到类诺瓦克病毒，并且已经提出可能存在从人到人的传播。因为类诺瓦克病毒的检测是公共健康和食物质量控制方面的一个重要议题，所以需要开发使用基因扩增方法，从而能够检测所有或大多数亚型的高度灵敏和快速的检测方法。但是，类诺瓦克病毒的检测现今是基于电子显微镜的观察。尽管该方法使得可能检测所有亚型，但是由于检测需要106个细胞/mL或更多的病毒量并且检验的敏感性低，所以样品局限于患者的粪便样品。
发明公开类诺瓦克病毒广义上根据其基因型分为两种类型基因类I(genogroup I；GI)和基因类II(genogroup II；GII)。此外，GI根据其基因型被分类为多种亚型，其典型代表是千叶(Chiba)亚型、Desert Shield亚型、诺沃克(Norwalk)亚型和南安普敦(Southampton)亚型，而GII基于基因型分类为多种亚型，典型代表是Camberwell亚型、夏威夷(Hawaii)亚型、墨西哥(Mexico)亚型和Snow Mountain亚型。属于GI的亚型间的和属于GII亚型间的碱基序列同源性为约70％。此外，GI和GII的碱基序列间的同源性为约40-50％。
为了提高用于基因扩增方法中的类诺瓦克病毒检测试剂的检测能力，对于用于引物结合的区域，必须有长度为至少20个碱基的至少两个区域，每个区域具有所有亚型中共同的碱基序列。然而，在研究了以GenBank中类诺瓦克病毒序列表示的下面6种序列(千叶亚型(No.AB042808)、诺沃克亚型(No.NC_001959)、南安普敦亚型(No.L07418)、Camberwell亚型(NO.AF145896)、夏威夷亚型(No.U07611)和HuCV亚型(No.AY032605))的同源性后，在所有亚型中没有20个或更多碱基相同的区域。
在这些情况下，本发明的发明人以前已经提供了类诺瓦克病毒检测方法(日本特开2002-51778、日本特开2002-153289、日本特开2002-218999)。然而，由于基于每种亚型的碱基序列设计引物碱基序列，不可能检测其他亚型。此外，日本特开2000-300297中公开的使用PCR的类诺瓦克病毒检测试剂仅仅可用于检测诺沃克亚型和Snow Mountain亚型。现今，还没有能够检测所有或大多数GI或GII亚型(例如，能够检测至少80％的亚型)的用于基因扩增方法的类诺瓦克病毒检测试剂。
为了解决该问题，本发明的发明人通过分析GenBank中登记的类诺瓦克病毒的碱基序列以及他们自己测定的类诺瓦克病毒碱基序列，并进一步由这些序列确定引物结合区，开发了检测GI的所有亚型的类诺瓦克病毒检测试剂和检测GII的所有亚型的类诺瓦克病毒检测试剂。
即，本发明提供了用于类诺瓦克病毒检测试剂的引物和使用所述引物的类诺瓦克病毒检测试剂。这样，为了实现上述目的，本发明的第一方面提供了用于检测类诺瓦克病毒基因组RNA的寡核苷酸，该寡核苷酸由SEQ.ID No.1到5和20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成并且能够结合类诺瓦克病毒的基因组RNA；能够结合类诺瓦克病毒基因组RNA的所述寡核苷酸突变体，例如，其中由SEQ.ID No.1到5和20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸中一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加所形成的寡核苷酸；在高严格条件下与由SEQ.ID No.1到5和20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸杂交的寡核苷酸，或者任一种所述寡核苷酸的互补链。
本申请的第二个发明方面提供了用于使用RNA扩增方法检测类诺瓦克病毒的检测试剂，该方法包括步骤用RNA依赖的DNA聚合酶，使用类诺瓦克病毒基因组RNA的特定序列作为模板，以及具有与所述特定序列同源的序列的第一引物，和具有与所述特定序列互补的序列的第二引物，产生cDNA，其中第一引物或者第二引物具有这样的序列，其中RNA聚合酶的启动子序列已经被添加到该引物的5’末端，从而形成双链RNA-DNA；通过核糖核酸酶H降解所述双链RNA-DNA的RNA部分，从而产生单链DNA；和使用所述单链DNA作为模板用DNA依赖的DNA聚合酶产生具有这样启动子的双链DNA，所述启动子能够转录为由所述RNA特定序列组成的RNA，或转录为与所述RNA特定序列互补的序列；其中，双链DNA在RNA聚合酶存在下产生RNA转录产物，所述RNA转录产物作为随后用RNA依赖的DNA聚合酶进行cDNA合成的模板；其中试剂含有，作为第一引物，由SEQ.ID No.1到3所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸，或者为这样的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.1到3所示序列任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸中的一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加并且能够特异结合与该特定序列互补的序列，或者为在高严格条件下与该由SEQ.ID No.1到3所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸杂交并且能够特异结合该特定序列的寡核苷酸；和作为第二引物，由SEQ.ID No.4或20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸，或者为这样的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.4或20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸中的一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加并且能够特异结合所述特定序列，或者为在高严格条件下与该由SEQ.ID No.4或20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸杂交并且能够特异结合与该特定序列互补的序列的寡核苷酸。
高严格杂交条件指任何杂交条件并且，例如，为下面的实例中所指的条件，由在60mM Tris、17mM氯化镁、120mM氯化钾和1mM DTT存在下在43℃的温度下进行杂交组成。
此外，对于旨在检测与来自类诺瓦克病毒的RNA互补的RNA的情况，具有与上面提到的第一引物互补的序列并且其序列从5’末端到3’末端被颠倒的寡核苷酸应该被用作第一引物，具有与上面提到的第二引物互补的序列并且其序列从5’末端到3’末端被颠倒的寡核苷酸应该被用作第二引物。
优选地，在切割用寡核苷酸的存在下进行前述RNA扩增方法，该切割用寡核苷酸在前述特定序列的5’末端切割前述目标RNA并且具有与所述特定序列的5’末端相邻并重叠的区域互补的序列。
前述第一引物优选为SEQ.ID No.1到3中所示序列之一组成的寡核苷酸。
此外，前述第二引物优选为SEQ.ID No.4或20中所示序列之一组成的寡核苷酸。
在另一优选的实施方案中，在嵌入荧光染料标记的寡核苷酸存在下进行前述RNA扩增方法，并且通过测量反应液的荧光强度进行类诺瓦克病毒的检测。这里，所述寡核苷酸的序列与前述RNA转录产物的序列的至少一部分互补，并且在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物存在互补结合的情况下，反应液的荧光特征与没有复合体形成的情况相比发生改变。
优选地，前述嵌入荧光染料标记的寡核苷酸由SEQ.ID No.5中所示序列中至少10个相邻碱基组成。下面提供了本发明的详细说明。
本发明的最佳实施模式在本发明中，由SEQ.ID No.1到5和20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸或其突变体可用作引物。这里，SEQ.ID No.1到3、4和20是相互接近的区域。从而，对于进行PCR，例如，组合的实例包括SEQ.ID No.1到3之一和SEQ.ID No.4或20的组合；SEQ.ID No.1到3之一和SEQ.ID No.5的组合，或者SEQ.ID No.5的互补链和SEQ.IDNo.4或20。这同样应用于非PCR的其他DNA扩增方法。
本发明的另一实施方案包括，例如，NASBA方法、3SR方法或TRC方法(见例如，日本特开2000-014400)，其通过反转录酶和RNA聚合酶的协同作用扩增类诺瓦克病毒RNA序列(通过在反转录酶和RNA聚合酶协同作用的条件下使它们反应)。这里，尽管对温度没有特定限制，但是优选35到50℃。
在本发明的前述实施方案中，目标RNA必须在特定序列的5’末端被切割。以这种方式切割该目标RNA的一个优选方法优选地由通过加入具有与和该特定序列的5’末端相邻并重叠的区域互补的序列的寡核苷酸(切割用寡核苷酸)，用核糖核酸酶H等切割目标RNA组成。在所述切割用寡核苷酸中，3’末端羟基优选被化学修饰并且，例如，可以被胺化，以抑制从3’末端的延伸反应。
尽管在前述核酸扩增方法中得到的扩增产物可以用公知的核酸检测方法检测，但是在优选的实施方案中，优选在嵌入荧光染料标记的寡核苷酸存在下进行前述核酸扩增，然后测定反应液的荧光特征的变化。在所述寡核苷酸中，由于嵌入荧光染料通过衔接子结合该寡核苷酸中的磷原子，与目标核酸形成双链的嵌合部分(互补核酸)嵌入到双链部分，导致荧光特征的改变，从而导致不需要分离并分析的特征(Ishiguro，T.等(1996)NucleicAcid Res.24(24)4992-4997)。
被所述寡核苷酸结合的序列可以是类诺瓦克病毒基因组RNA中被扩增的任何序列，虽然对其没有特定限制，但是优选由SEQ.ID No.5中所示序列中至少10个连续碱基组成的序列。此外，所述寡核苷酸的3’末端的羟基优选被化学修饰(如通过加入乙醇酸)以抑制通过使用所述寡核苷酸作为引物可能发生的延伸反应。
结果，可以在单个试管中，在恒温下一步快速并具有高度特异性地扩增和检测类诺瓦克病毒RNA，从而方便了自动化应用。
本发明的检测方法用于快速和高灵敏度地检测类诺瓦克病毒所有GI亚型或所有GII亚型。
尽管下面通过实施例提供了对本发明的更详细说明，但是本发明不被这些实施例所限制。
实施例1为了表明表1中所示组合(a)能够检测GI的所有亚型并且组合(b)和(c)能够检测GII的所有亚型，使用下面(1)至(8)中所示方法分别制备了相应于GI的四种亚型和GII的四种亚型的DNA(此后称为“人工标准DNA”)和RNA(此后称为“人工标准RNA”)。人工标准RNA用(9)至(12)中所示方法测定。
(1)基于类诺瓦克病毒的千叶亚型的碱基序列(GenBankNo.AB042808)设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV1ART-C，SEQ.ID No.6)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μL。
(2)基于类诺瓦克病毒的Desert Shield亚型的碱基序列(GenBankNo.U04469)设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV1ART-D，SEQ.ID No.7)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μL。
(3)基于类诺瓦克病毒的诺沃克亚型的碱基序列(GenBankNo.NC001959)设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV1ART-N，SEQ.ID No.8)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μL。
(4)基于类诺瓦克病毒的南安普敦亚型的碱基序列(GenBankNo.L07418)设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV1ART-S，SEQ.ID No.9)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mMEDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μL。
(5)基于类诺瓦克病毒的Camberwell亚型的碱基序列(GenBankNo.AF145896)设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV2ART-C，SEQ.ID No.10)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μL。
(6)基于类诺瓦克病毒的夏威夷亚型的碱基序列(GenBankNo.U07611)设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV2ART-H，SEQ.ID No.11)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μL。
(7)基于类诺瓦克病毒的墨西哥亚型的碱基序列(GenBankNo.U22498)设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV2ART-M，SEQ.ID No.12)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μL。
(8)基于类诺瓦克病毒的Snow Mountain亚型的碱基序列设计人工标准DNA使得其含有用于组合(a)到(c)的寡核苷酸结合区，然后通过体外转录制备由90个碱基组成的人工标准RNA(NV2ART-S，SEQ.ID No.13)。该标准RNA用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μl RNase抑制剂)(Takara Bio))将RNA样品稀释到106个拷贝/5μl。
(9)将含有下述组分的20μL反应液置于0.5mL PCR管(IndividualDome Cap PCR管，SSI)中，然后向其中加入(1)到(8)中制备的RNA样品5μL。此外制备溶液，从而第一引物、第二引物和切割用寡核苷酸的组合为如表1中所示的组合。
反应液的组分(浓度以30μL最终反应液体积中的浓度显示)60mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)17mM氯化镁120mM氯化钾6U RNase抑制剂1mM DTT0.25mM每一种dATP、dCTP、dGTP和dTTP3.6mM ITP3.0mM每一种ATP、CTP、GTP和UTP0.16μM切割用寡核苷酸
1.0μM第一引物1.0μM第二引物25nM嵌入染料标记的寡核苷酸(YO-NV-S-G，SEQ.ID No.5，从5’末端的12位“C”和13位“A”之间用嵌入荧光染料标记，并且其3’末端的羟基被乙二醇基团标记。)13％DMSO用于调节体积的蒸馏水(10)在43℃孵育前述反应液2分钟后，加入具有下面指出的组分并在43℃预热2分钟的5μL酶溶液。
酶溶液的组分(值以30μL最终反应液体积中的浓度显示)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen)6.4U AMV反转录酶(LifeScience)用于调节体积的蒸馏水(11)随后，使用具有温度控制功能并且能够直接测量PCR管的荧光分光光度计，在激发波长470nm和荧光波长520nm下，随时间测定每个PCR管中的反应液(这些反应液在43℃孵育)。
(12)当使用每种寡核苷酸组合时类诺瓦克病毒人工标准RNA的上升时间(荧光比率增加到阴性对照样品的平均值加上3个标准误的和的1.2倍所需要的时间)的结果在表2中显示。表明用组合(a)在30分钟内检测到GI的四种标准RNA样品，而用组合(b)和(c)在30分钟内检测到GII的四种标准RNA样品。
表1
表1显示了用于该实验体系中的第一引物、第二引物和切割用寡核苷酸的组合。在用于检测类诺瓦克病毒的寡核苷酸组合中切割用寡核苷酸碱基序列的3’末端的羟基被胺化。
从第一引物的碱基序列的5’末端开始的第1位“A”到22位“A”的区域是T7启动子区，随后的从23位“G”到28位“A”的区域是增强子序列。此外，主要使用GI类诺瓦克病毒作为靶标设计组合(a)，而主要使用GII类诺瓦克病毒作为靶标设计组合(b)和(c)。
切割用寡核苷酸NV1-3SM-9(SEQ.ID No.14)NV2-3SM(SEQ.ID No.15)NV2-3S20+3(SEQ.ID No.16)第一引物NV1-3FM-9(SEQ.ID No.17)NV2-3FM(SEQ.ID No.18)NV2-3F20+3(SEQ.ID No.19)第二引物NV2-7RM(SEQ.ID No.4)表2
表2显示了使用表1中所示寡核苷酸组合测定类诺瓦克病毒人工标准RNA(GI和GII每种四个样品)的结果。在表1中所示寡核苷酸组合中，组合(a)在30分钟内检测到GI的四个标准RNA样品，而组合(b)和(c)在30分钟内检测到GII的四个标准RNA样品。
实施例2为了表明本发明中寡核苷酸组合之一能够检测GI的所有亚型，根据下面的(1)到(8)所示方法测定四种GI亚型的人工标准RNA。
(1)千叶亚型的人工标准RNA(NV1ART-C，SEQ.ID No.6)以与实施例1相同的方式用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将该RNA稀释到106个拷贝/5μL。
(2)Desert Shield亚型的人工标准RNA(NV1ART-D，SEQ.ID No.7)以与实施例1相同的方式用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将该RNA稀释到106个拷贝/5μL。
(3)诺沃克亚型的人工标准RNA(NV1ART-N，SEQ.ID No.8)以与实施例1相同的方式用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将该RNA稀释到106个拷贝/5μL。
(4)南安普敦亚型的人工标准RNA(NV1ART-S，SEQ.ID No.9)以与实施例1相同的方式用作样品。通过260nm处紫外吸收对其定量后，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将该RNA稀释到106个拷贝/5μL。
(5)将含有下述组分的20μL反应液置于0.5mL PCR管(IndividualDome Cap PCR管，SSI)中然后向其中加入(1)到(4)中制备的RNA样品5μL。
反应液的组分(浓度以30μL最终反应液体积中的浓度显示)
60mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)17.2mM氯化镁120mM氯化钾6U RNase抑制剂1mM DTT0.25mM每一种dATP、dCTP、dGTP和dTTP3.6mM ITP3.0mM每一种ATP、CTP、GTP和UTP0.16μM切割用寡核苷酸(NV1-3SM-9，SEQ.ID No.14，3’末端羟基被胺化)1.0μM第一引物(NV1-3FM-9，SEQ.ID No.17)1.0μM第二引物(NV1-7RM18-1，SEQ.ID No.20)15nM嵌入染料标记的寡核苷酸(YO-NV-S-G，SEQ.ID No.5，从5’末端的12位“C”和13位“A”之间用嵌入荧光染料标记，并且其3’末端的羟基被乙二醇基团标记。)13％DMSO用于调节体积的蒸馏水(6)在43℃孵育前述反应液2分钟后，加入具有下面指出的组分并在43℃预热2分钟的5μL酶溶液。
酶溶液的组分(值以30μL最终反应液体积中的浓度显示)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen)6.4U AMV反转录酶(LifeScience)用于调节体积的蒸馏水(7)随后，使用具有温度控制功能并且能够直接测量PCR管的荧光分光光度计，在激发波长470nm和荧光波长520nm下，随时间测定每个PCR管中的反应液(这些反应液在43℃孵育)。
本发明所涉及的侧链修饰有对氨基的修饰，如通过与醛反应再用NaBH4还原而还原烷基化；用甲基乙酰亚胺(methylacetimidate)进行的脒化反应；用乙酸酐进行的酰化反应；用氰酸盐使氨基甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苯化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐使氨基酰化；和用吡哆醛-5-磷酸使赖氨酸吡哆醛化再用NaBH4还原。
精氨酸残基的胍基可通过与诸如2，3-丁二酮，苯基乙二醛和乙二醛等试剂形成杂环缩合物来修饰。
羧基可通过O-酰基异脲的形成反应激活碳二亚胺，再衍生为例如相应的酰胺而修饰。
巯基(sulphydryl)可通过下列方法修饰，如用碘乙酸或碘乙酰胺进行的羧甲基化；用过甲酸使半胱磺酸氧化；与其它硫醇类化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺，马来酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸盐，4-氯汞苯磺酸，苯基氯化汞，2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞化合物形成汞化合物的衍生物；在碱性pH下用氰酸盐进行的甲氨酰化。
色氨酸残基可通过例如用N-溴琥珀酰亚胺进行的氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴化物或烃硫基卤化物使吲哚环烷基化而修饰。另一方面，酪氨酸残基可通过用四硝基甲烷进行的硝化反应形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。
组氨酸残基的咪唑环可通过碘乙酸衍生物的烷基化或焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化来修饰。
在合成肽的过程中掺入的非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，叔丁基甘氨酸，正缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。表1示出了本文涉及的非天然氨基酸。
表1
<p>序列表<110>东曹株式会社<120>类诺瓦克病毒检测试剂<130>R002<150>JP 2004-027802<151>2004-02-04<160>20<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV1-3FM-9-T7<400>1ttgtggacag gagatcgcta tct23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV2-3FM-T7<400>2acgtgggagg gcgatcgcaa tct23<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>NV2-3F20+3-T7<400>3tgggagggcg atcgcaatct 23<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV2-7RM<400>4tctaatccag gggtctat18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>YO-NV-S-G<400>5gacgccatct tcatttac18<210>6<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>NV1ART-C<400>6gaauacaacg cuuccaugau cucggauugu ggacaggaga ucgcaaucuc cguaaaugau 60
gauggcgucu gauugauccc uggauaauca90<210>7<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>NV1ART-D<400>7gaauacaacg cuuccaugau cugagcaugu ggacagggga ucgcgaucuc uguaaaugau 60gauggcgucu gauugacccc uggauaauga 90<210>8<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>NV1ART-N<400>8gaauacaacg cuuccaugac cucggauugu ggacaggaga ucgcgaucuu cguaaaugau 60gauggcgucu uauugauccc uggauaauua 90<210>9<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>NV1ART-S<400>9gaauacaacg guuccaugac cuugguuugu ggacaggaga ucgcaaucuc uguaaaugau 60gauggcgucu gauugauccc uggauuguua 90<210>10<211>90<212>RNA
<213>人工序列<220>
<223>NV2ART-C<400>10gaauacaaag auucucagau cugagcacgu gggagggcga ucgcaaucug ugugaaugaa60gauggcgucg aauugacccc uggauuagaa 90<210>11<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>NV2ART-H<400>11gaauacaaag auucucagac cugagcacgu gggagggcga ucgcaaucug ugugaaugaa60gauggcgucg gauagacccc uggauuagaa 90<210>12<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>NV2ART-M<400>12gaauacaaag guucucagau cuaagcacau gggagggcga ucgcaaucug ugugaaugaa 60gauggcgucg aauugauccc uggauuauga90<210>13<211>90<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>NV2ART-S<400>13gaauacaaag auucucggau uugagcacgu gggagggcga ucgcaaucuu ugugaaugaa 60gauggcgucg uauagacccu uggauuagag 90<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV1-3SM-9<400>14ccacaatccg agatcatgga agcg 24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV2-3SM<400>15ccacgtgctc agatctgaga atct 24<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV2-3S20+3<400>16ctcccatgtg cttaagtccg 20
<210>17<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV1-3FM-9<400>17aattctaata cgactcacta tagggagatt gtggacagga gatcgctatc t 51<210>18<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV2-3FM<400>18aattctaata cgactcacta tagggagaac gtgggagggc gatcgcaatc t 51<210>19<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NV2-3F20+3<400>19aattctaata cgactcacta tagggagatg ggagggcgat cgcaatct48<210>20<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>NV1-7RM18-1<400>20gattatccag ggatcaat18
权利要求
1.用于检测类诺瓦克病毒基因组RNA和能够结合类诺瓦克病毒基因组RNA的寡核苷酸，其中该寡核苷酸为由SEQ.ID No.1到5和20所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的序列、为其中SEQ.ID No.1到5和20中的一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加而形成的序列、或者为SEQ.ID No.1到5和20所示任一序列的互补链。
2.用于使用RNA扩增方法检测类诺瓦克病毒的检测试剂，该方法包括步骤使用类诺瓦克病毒基因组RNA的特定序列作为模板，以及具有与所述特定序列同源的序列的第一引物，和具有与所述特定序列互补的序列的第二引物，用RNA依赖的DNA聚合酶产生cDNA，从而形成双链RNA-DNA，其中第一引物或者第二引物具有这样的序列，其中RNA聚合酶的启动子序列已经被添加到该引物的5’末端；通过核糖核酸酶H降解所述双链RNA-DNA的RNA部分，从而产生单链DNA；和使用所述单链DNA作为模板用DNA依赖的DNA聚合酶产生具有所述启动子的双链DNA，其中所述启动子能够转录为由所述RNA特定序列组成的RNA，或转录为与所述RNA特定序列互补的序列；其中，双链DNA在RNA聚合酶存在下产生RNA转录产物，所述RNA转录产物作为随后用RNA依赖的DNA聚合酶进行cDNA合成的模板；所述试剂包含第一引物和第二引物，其中第一引物为由SEQ.ID No.1到3所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸，或者为这样的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.1到3所示序列的任一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸中的一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加并且能够特异结合与该特定序列互补的序列；其中第二引物为由SEQ.IDNo.4或20所示序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸，或者为这样的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.4或20所示序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸中的一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加并且能够特异结合所述特定序列。
3.根据权利要求2的检测试剂，其中第一引物为由SEQ.ID No.1到3中所示任一序列组成的寡核苷酸。
4.根据权利要求2的检测试剂，其中第二引物为由SEQ.ID No.4或20中所示序列组成的寡核苷酸。
5.根据权利要求2到4任一项的检测试剂，其中在嵌入荧光染料标记的寡核苷酸存在下进行RNA扩增方法，并且通过测定反应液的荧光强度检测类诺瓦克病毒；其中所述寡核苷酸的序列与RNA转录产物序列的至少一部分互补，并且在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物发生互补结合的情况下，反应液的荧光特征与没有复合体形成的情况相比发生改变。
6.根据权利要求5的检测试剂，其中嵌入荧光染料标记的寡核苷酸由SEQ.ID No.5所示序列中至少10个相邻碱基组成。
全文摘要
本发明提供了优选用于组成能够快速并且高度灵敏地检测类诺瓦克病毒的所有亚型的基因检测试剂的寡核苷酸组合。更具体地，本发明提供了这样的检测方法，其中通过使用具有与类诺瓦克病毒的特定碱基序列同源或互补并且位于亚型最小突变的位置处的序列的引物，使得仅仅类诺瓦克病毒被特异扩增，还提供了结合类诺瓦克病毒的特定位点的寡核苷酸。
文档编号C12Q1/68GK1680593SQ200510007360
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月4日 优先权日2004年2月4日
发明者益田昇佳, 保川清, 堀江隆一 申请人:东曹株式会社