专利名称：诺如病毒环介导等温扩增快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法， 具体是一种GII型诺如病毒环介导等温扩增快速检测方法。
技术背景诺如病毒(Norovirus,NV)是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺 瓦克病毒是这个属的原型代表株，最早是从1968年在美国诺瓦克巿暴发的一次急 性腹泻的患者粪便中分离的病原，此后，世界各地陆续自胃肠炎患者粪便中分离 出多种形态与之相似但抗原性略异的病毒样颗粒，均以发现地点命名，如Hawaii Virus (HV)、 Snow Mountain Virus (SMV)、 Mexico Wrus (MxV) Southampton Virus(SOV)等，2002年8月第八届国际病毒命名委员会批准名称为诺如病毒。诺如 病毒的主要传播方式是粪一口途径，也可以通过污染的水源、食物、物品、空气 等传播。由于病人的呕吐物和粪便可形成气溶胶，与病人接触可传染。隐性感染 者及健康携带者均可为传染源，病人的呕吐物和粪便在自然界中污染水或间接污 染食品，很容易造成暴发。其主要症状为恶心、呕吐、腹痛和腹泻，儿童患者呕 吐普遍，成人患者腹泻为多，24h内腹泻4 8次，粪便为稀水便或水样便，无粘液 脓血，粪检白细胞阴性。此外，头痛、轻度发热、寒颤和肌肉痛也是常见症状， 严重者出现脱水。NV成员庞杂，目前已对其100多个分离株进行基因测序。核酸 的同源性分析表明，世界不同地区、不同时间流行的NV基因RNA多聚酶区序列相对 保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的达到90%以上。因此，根据RNA多 聚酶区核苷酸序列的相似性，将NLV分为5个基因组,其中感染人的包括基因组I 、 II和IV:基因组I ，以Norwalk virus (NV)为代表，包括Southampton (SOV)、 Desert Shield virus (DSV)等；基因组II，以Snow Mountain virus (SMV)代表， 包括Hawaii Virus (HV)、 Mexico Virus (MxV)、 Lordsdale virus (LV)等；我国 诺如病毒的感染基本上是GII型，G I型比较少见。现有诺如病毒的检测方法主要有直接电镜法、免疫电镜法、放射免疫法、酶联 免疫法和RT-PCR等，但直接电镜法灵敏度较低；免疫电镜法灵敏度高，但成本也 很高；放射免疫法所需时间长，并且需要放射性同位素标记；酶联免疫法应用范 围较窄；RT-PCR灵敏、准确，但也有成本高的问题。而环介导等温扩增方法能较 好的弥补这些不足，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测诺如病毒的报道。发明内容本发明的目的是提供一种GII型诺如病毒环介导等温扩增快速检测方法，以克 服现有技术的缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个 内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)， 内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随 后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启 动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动 的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启 动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环 DNA; (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有耙 DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。本发明涉及的GII型诺如病毒环介导等温扩增快速检测方法，其中包括的试剂 如下(1) - (5):(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液 其中包括10XThermopol反应缓冲液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4—8mmol/L 硫酸镁(MgS04)、 0.8 — 1. 6ymol/L上游引内物(FIP)、 0. 8 — 1. 6iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.2—0. 3iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3nmol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜碱； 上游内引物5- CGGGCTCCAGAGCCATAACCT-ACGCCAACCCATCTGATG -3、下游内引物5-GTGGCGGGCCAACAAAACGTA-CACTGTGAACTCTCCACCAG-3、 上游外引物5-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3、 下游外引物5國CTGGAGCGTTTCTAGGGGA國3 、其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP 二2:1:1:1。其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200 mmol pH8.8的三羟基甲基氨 基甲烷一盐酸(Tris—HC1)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、 100mmol/L硫酸铵((NH4) 2S04)、 20 mmol/L硫酸镁(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1 U/pL;(3) Bst DNA聚合酶8 U /|JL;(4) ReverTra Ace: 100 U /|jU(5) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有21iJL，其最佳组成为2. 5pLlOXThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、 4.0|JL 10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4. OpL 10iJmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5|jL 1Ojjmo]/L上游外引物(F3)、 0. 5|JL 10iJmol/L下游外引物(B3)、 1. 5|jL 100 mmol/L MgS04、 5pL 5M甜菜碱和1.6iJL ddH20 (灭菌双蒸水)。使用上述方法检测GII型诺如病毒，依次包括下列步骤(1) - (3):(1) 待检样品或病毒RNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品RNA OD26。/OD28。在1.6-2.0范围内，浓度 在10-100 ng/ijL范围内。(2) 进行GII型诺如病毒的环介导等温扩增反应-A. 在装有21口L LAMP反应液的反应管中加入2nL待检模板DNA，和O. 5pL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 在各反应管中加入llJL Bst DNA聚合醇和1ijL ReverTra Ace，并于水浴锅 中恒温水浴上60—65。C扩增反应45—90 min;C. 将水浴调到80—85'C终止反应，3—5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入lpL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品含有或为GII型诺如病毒。本发明是根据GII型诺如病毒的RNA多聚酶区序列设计了两个特异性内引物和 两个特异性外引物，该保守基因序列为GII型诺如病毒所共有，以保证检测不同来 源的GII型诺如病毒的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术 特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通 的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可， 简单而快速，特别适用于基层医疗机构。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 实施例l按下列配方制作GII型诺如病毒的环介导等温扩增反应液 (1) LAMP反应液含有2. 5|JL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25咖ol/L dNTP (四种脱氧核 糖核酸的混合物)、4.0|JL 10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4. 0yL 10jjmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5yL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5|jL 10iJmol/L下游外引物(B3)、 1.5|JL 100 mmol/L MgS04、 5|jL 5M甜菜碱和1.6iJL ddH20 (灭菌双蒸水)。 其中所述的上游内引物5-CGGGCTCCAGAGCCATAACCT誦ACGCCAACCCATCTGATG -3 、下游内引物5- GTGGCGGGCCAACAAAACGTA画CACTGTGAACTCTCCACCAG -3、 上游外引物5- GTGAATGAAGATGGCGTCGA -3 、 下游外引物5- CTGGAGCGTTTCTAGGGGA -3其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP二 2:1:1:1。(2) UNG酶1 U/|JL;(3) Bst DNA聚合酶8U /yL;(4) ReverTra Ace: 100 U /|JL;(5) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)程序进行检测(1) 样品DNA的提取检测毒株GII型诺如病毒(NV， GII),毒株来源中国疾病预防控制中心病毒预防 控制所，编号NLVSCHN4300。使用北京天根生物工程公司的TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取样 品RNA， RNA 0D湖/ OD卿能够达到l. 8，浓度达到20 ng/|jL。(2) 进行GII型诺如病毒的环介导等温扩增反应A. 在装有21ijL LAMP反应液的反应管中加入2IJL待检模板DNA，和O. 5ijL的UNG 酶，于恒温水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置5 min，立即置于冰上l min;B. 在各反应管中加入l |JL Bst DNA聚合酶和llJL ReverTra Ace，并于恒温 水浴上65 'C扩增反应1小时；C. 将水浴调到80 'C终止反应，3 min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入l IJL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品为GII型诺如病毒。 实施例2按下列配方制作GII型诺如病毒的环介导等温扩增反应液(1) LAMP反应液含有2. 5fjL lOXThermopol反应缓冲液、1. 4jjL 25画1/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、4.0|JL 101Jmol/L上游内引物(FIP)、 4. O[jL 10iJmol/L下游内引 物(B工P)、 0.5|JL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5yL 10iJmol/L下游外引物(B3)、I. 5pL 100 mmol/L MgS04、 5pL 5M甜菜碱和1.6(jL ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。 上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP二 2:1:1:1。(2) UNG酶1 U/|JL;(3) Bst DNA聚合酶8U /|JL;(4) ReverTra Ace: 100 U /|JL;(5) 显色剂为10X的荧光染料DNAGreen。 按照以下(1) - (3)程序进行检测(1) 样品DNA的提取检测毒株GII型诺如病毒(NV, GII),毒株来源日本国家传染病研究所，编号NV-GII。使用大连宝生物工程公司的小量病毒DNA/RNA提取试剂盒提取样品RNA， RNA 0D26。/ 0D咖能够达到1.8，浓度达到20 ng/|jL。(2) 进行GII型诺如病毒的环介导等温扩增反应A. 在装有21ijL LAMP反应液的反应管中加入2iJL待检模板DNA，和O. 5ijL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95r放置5min，立即置于冰上l min;B. 在各反应管中加入liJL Bst DNA聚合酶和lnL ReverTra Ace，并于恒温水 浴上65。C扩增反应1 h;C. 将水浴调到8(TC终止反应，3 min后取出待检；(3) 显色检测；在待检的每个反应管中加入1[JL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，则待检样品也为GII型诺如病毒。<formula>formula see original document page 9</formula>〈210〉 4 <211> 19 〈212〉 ■ 〈213〉人工序列 <221〉 prim一bind 〈222〉 (1)…(19) 〈400〉 4CTGGAGCGTTTCTAGGGGA 19
权利要求
1.环介导等温扩增检测诺如病毒的试剂，其特征是该试剂包括(1)-(5)(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0-1.4mmol/L dNTP、4-8mmol/L硫酸镁、0.8-1.6μmol/L上游引内物、0.8-1.6μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中，上游内引物5-CGGGCTCCAGAGCCATAACCT-ACGCCAACCCATCTGATG-3；下游内引物5-GTGGCGGGCCAACAAAACGTA-CACTGTGAACTCTCCACCAG-3；上游外引物5-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3；下游外引物5-CTGGAGCGTTTCTAGGGGA-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)ReverTra Ace100U/μL；(5)显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 环介导等温扩增检测诺如病毒的试剂，其特征是上述的dNTP内 的四种脱氧核糖核酸的质量比为d野dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 利用权利要求1中所述的试剂进行等温快速检测诺如病毒的方 法，其特征是依次包括(1) - (3)下列步骤(1)待检样品或病毒RNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品RNA 0D26。/ 0D娜在1. 6-2. 0范围 内，浓度在10-100 ng/uL范围内；v(2) 进行GII型诺如病毒的环介导等温扩增反应A. 在装有21 u L LAMP反应液的反应管中加入2 y L待检样品模板DNA， 和O. 5uL的UNG酶，于恒温95 。C放置3 — 5min，立即置于冰上l一3min;B. 再在反应管中加入luL Bst DNA聚合酶和luLeverTra Ace，并 于恒温65 。C扩增反应45 — 90 min;C. 将温度调到80 。C终止反应，3 — 5 min后取出待检；(3) 显色检测在每个反应管中加入luL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液 颜色变为绿色，说明待检样品含有或为GII型诺如病毒。
全文摘要
本发明涉及一种G II型诺如病毒环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；所述的反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-CGGGCTCCAGAGCCATAACCT-ACGCCAACCCATCTGATG-3、下游内引物5-GTGGCGGGCCAACAAAACGTA-CACTGTGAACTCTCCACCAG-3、上游外引物5-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3、下游外引物5-CTGGAGCGTTTCTAGGGGA-3和甜菜碱；检测G II型诺如病毒的方法包括病毒RNA的提取、G II型诺如病毒的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/68GK101403014SQ20081015790
公开日2009年4月8日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者刘云国, 静 唐, 姜英辉, 健 张, 房保海, 李正义, 祝素珍, 楠 贺, 贾俊涛, 赵丽青, 雷质文, 马维兴 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心