本发明属于亚油酸的提取技术领域，具体涉及一种牛膝叶中亚油酸的提取方法。
背景技术：
多项研究数据显示，亚油酸可以显著降低血液脂肪水平、软化中小血管、缓和血压、增加血液循环、间接恢复神经功能等作用，可减少心脑血管疾病的病患率，特别是对冠心病、动脉粥样硬化、老年肥胖症等疾病的防治有积极的意义。
大量研究发现牛膝富含三萜皂苷类、多糖类、生物碱类等成分，近来又有研究表明其中富含油脂成分。牛膝属苋科，为多年生草本植物，是我国常用的大宗中药材之一，主要在河南、四川一带种植。为了进一步发掘牛膝叶的实用价值，需提供一种操作简单且效率较高的亚油酸的提取方法。
亚油酸是一种不饱和脂肪酸，其提取方法较多，其中尿素包结合法因为所需设备简易、操作简单易学、成本较低及所得不饱和脂肪酸纯度较高而受到广泛的应用。此外，尿素包合法是在低温下进行操作的，能最大程度保存亚油酸的生物活性，不会因发生异构化和聚合反应丧失亚油酸的营养和生理活性。因此，尿素包合法是用于亚油酸大规模分离纯化的理想方法。
技术实现要素：
本发明采用尿素包合法首次从牛膝叶中提取到了亚油酸，且具有操作简单、提取率好、纯度高等优点，拓宽了牛膝叶的研究范围，为其深入开发提供了新的思路。
为实现提取亚油酸的目的，本发明采用下述技术方案：牛膝叶中亚油酸的提取方法，其特征在于具体步骤为：
步骤s1：将牛膝叶晾干粉碎成牛膝叶粉，按牛膝叶粉与正己烷料液比1g:3～8ml加入正己烷浸提，浸提温度为40～60℃，浸提时间为1～5h，重复提取1～3次，滤液经减压蒸馏除去溶剂正己烷得到牛膝叶的混合油脂；
步骤s2：取步骤s1浸提的混合油脂，按混合油脂与naoh-c2h5oh溶液料液比1g:2～4ml加入naoh-c2h5oh溶液，在75～85℃水浴中反应1.5～3h，用盐酸溶液调节混合体系的ph值至1～3，搅拌均匀，分出油层，加入10倍体积油层样量的正己烷萃取，并水洗至中性，减压蒸馏除去溶剂正己烷，加入干燥剂除水干燥得到混合脂肪酸；
步骤s3：取乙醇加热至70℃，边搅拌边加入尿素，使尿素完全溶于乙醇中得到尿素-乙醇溶液；
步骤s4：取步骤s2得到的混合脂肪酸，按尿素与混合脂肪酸质量比1～3:1加入到步骤s3得到的尿素-乙醇溶液中，维持温度75～85℃，回流搅拌30～70min，待混合物变澄清透明后停止加热，继续搅拌冷却至室温；
步骤s5：在-10～5℃下包合5～25h，将所得尿素包合混合物过滤分离，用石油醚洗涤结晶物得到滤液；
步骤s6：向步骤s5得到的滤液中加入石油醚和稀碱液，萃取，得到有机相，将有机相水洗至中性，再用干燥剂干燥，旋转蒸发去除石油醚得到亚油酸。
优选的，步骤s1中所述牛膝叶粉与正己烷的料液比为1g:6ml。
优选的，步骤s1中所述浸提温度为50℃，浸提时间为2h，重复提取2次。
优选的，步骤s3中所述尿素-乙醇溶液的浓度为50～300g/l。
优选的，步骤s3中所述尿素-乙醇溶液的浓度为100g/l。
优选的，步骤s4中所述尿素-乙醇溶液中尿素与混合脂肪酸的质量比为2:1。
优选的，步骤s5中尿素包合过程是在-5℃包合24h。
优选的，步骤s2和s6中所述干燥剂均为无水硫酸钠。
优选的，步骤s6中所述滤液、石油醚与稀碱液的体积比1:1:1，其中稀碱液为氢氧化钠溶液。
本发明具有以下有益效果：
1、牛膝叶是我国的传统优势产品，全国多地均有种植且成本不高应用广泛，本发明首次提供了从牛膝叶中提取亚油酸的工艺，使牛膝叶能够得到充分再利用，为牛膝叶的研究提供了新思路；
2、本发明提供的牛膝叶中亚油酸的提取方法，操作简单，亚油酸的提取率高且所需设备简单经济，试剂价格低廉，来源广泛，易于获得。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的具体阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
步骤s1：将牛膝叶粉碎成牛膝叶粉，精密称取50g，按料液比(w/v)1g:6ml加入300ml正己烷溶液，在50℃水浴中提取4h，重复提取2次，减压蒸馏回收溶剂正己烷后得到牛膝叶的混合油脂；
步骤s2：取步骤s1浸提的混合油脂，按料液比(w/v)1g:4ml加入naoh-c2h5oh溶液，在75～85℃水浴中反应3h，取出，加适量50～70℃温水溶解，搅拌20min，加盐酸溶液调节成ph值为2的酸性溶液，搅拌15min，分出油层，加入约10倍体积油层样量的正己烷萃取，并水洗至中性，减压蒸馏除去溶剂正己烷，加入无水硫酸钠干燥得到混合脂肪酸；
步骤s3：取500ml乙醇加热至70℃，边搅拌边加入尿素50g，使尿素完全溶于乙醇中得到尿素-乙醇溶液；
步骤s4：将步骤s3得到的尿素-乙醇溶液加入到步骤s2得到的混合脂肪酸中，维持温度70℃，回流搅拌1h，待混合物变澄清透明后停止加热，继续搅拌至冷却到室温；
步骤s5：在-5℃下包合24h，将所得尿素包合混合物过滤分离，用石油醚洗涤结晶物，洗涤2～3次，合并滤液；
步骤s6：向步骤s5得到的滤液中加入石油醚和稀碱液，其中滤液、石油醚与稀碱液的体积比为1:1:1，使用稀碱液作为萃取水相可以进一步除去提取液中的杂质成分，稀碱液为氢氧化钠溶液，萃取2～3次，收集有机相，将有机相水洗至中性，加入100g无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除石油醚得到亚油酸，取旋蒸后的亚油酸重复称重2次，取其平均值得到亚油酸质量；混合脂肪酸的质量由步骤s2可得，亚油酸收率＝(亚油酸质量/混合脂肪酸质量)×100%，经检测计算得到亚油酸的收率为18.6%。
实施例2
步骤s1：将牛膝叶粉碎成牛膝叶粉，精密称取50g，按料液比(w/v)1g:3ml加入150ml正己烷溶液，在50℃水浴中提取2h，重复提取1次，减压蒸馏回收溶剂正己烷后得到牛膝叶的混合油脂；
步骤s2：取步骤s1浸提的混合油脂，按料液比(w/v)1g:4ml加入naoh-c2h5oh溶液，在75～85℃水浴中反应3h，取出，加适量50～70℃温水溶解，搅拌20min，加盐酸溶液调节成ph值为2的酸性溶液，搅拌15min，分出油层，加入约10倍体积油层样量的正己烷萃取，并水洗至中性，减压蒸馏除去溶剂正己烷，加入无水硫酸钠干燥得到混合脂肪酸；
步骤s3：取500ml乙醇加热至70℃，边搅拌边加入尿素50g，使尿素完全溶于乙醇中得到尿素-乙醇溶液；
步骤s4：将步骤s3得到的尿素-乙醇溶液加入到步骤s2得到的混合脂肪酸中，维持温度70℃，回流搅拌1h，待混合物变澄清透明后停止加热，继续搅拌至冷却到室温；
步骤s5：在-5℃下包合24h，将所得尿素包合混合物过滤分离，用石油醚洗涤结晶物，洗涤2～3次，合并滤液；
步骤s6：向步骤s5得到的滤液中加入石油醚和稀碱液，其中滤液、石油醚与稀碱液的体积比为1:1:1，使用稀碱液作为萃取水相可以进一步除去提取液中的杂质成分，稀碱液为氢氧化钠溶液，萃取2～3次，收集有机相，将有机相水洗至中性，加入100g无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除石油醚得到亚油酸；亚油酸的收率计算方法同实施例1，经计算得到收率为17.3%。
实施例3
步骤s1：将牛膝叶粉碎成牛膝叶粉，精密称取50g，按料液比(w/v)1g:6ml加入300ml正己烷溶液，在50℃水浴中提取4h，重复提取2次，减压蒸馏回收溶剂正己烷后得到牛膝叶的混合油脂；
步骤s2：取步骤s1浸提的混合油脂，按料液比(w/v)1g:2ml加入naoh-c2h5oh溶液，在75～85℃水浴中反应3h，取出，加适量50～70℃温水溶解，搅拌20min，加盐酸溶液调节成ph值为2的酸性溶液，搅拌15min，分出油层，加入约10倍体积油层样量的正己烷萃取，并水洗至中性，减压蒸馏除去溶剂正己烷，加入无水硫酸钠干燥得到混合脂肪酸；
步骤s3：取500ml乙醇加热至70℃，边搅拌边加入尿素50g，使尿素完全溶于乙醇中得到尿素-乙醇溶液；
步骤s4：将步骤s3得到的尿素-乙醇溶液加入到步骤s2得到的混合脂肪酸中，维持温度70℃，回流搅拌1h，待混合物变澄清透明后停止加热，继续搅拌至冷却到室温；
步骤s5：在-5℃下包合24h，将所得尿素包合混合物过滤分离，用石油醚洗涤结晶物，洗涤2～3次，合并滤液；
步骤s6：向步骤s5得到的滤液中加入石油醚和稀碱液，其中滤液、石油醚与稀碱液的体积比为1:1:1，使用稀碱液作为萃取水相可以进一步除去提取液中的杂质成分，稀碱液为氢氧化钠溶液，萃取2～3次，收集有机相，将有机相水洗至中性，加入100g无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除石油醚得到亚油酸；亚油酸的收率计算方法同实施例1，经计算得到收率为15.6%。
实施例4
步骤s1：将牛膝叶粉碎成牛膝叶粉，精密称取50g，按料液比(w/v)1g:6ml加入300ml正己烷溶液，在50℃水浴中浸提4h，重复提取2次，减压蒸馏回收溶剂正己烷后得到牛膝叶的混合油脂；
步骤s2：取步骤s1浸提的混合油脂，按料液比(w/v)1g:4ml加入naoh-c2h5oh溶液，在75～85℃水浴中反应3h，取出，加适量50～70℃温水溶解，搅拌20min，加盐酸溶液调节成ph值为2的酸性溶液，搅拌15min，分出油层，加入约10倍体积油层样量的正己烷萃取，并水洗至中性，减压蒸馏除去溶剂正己烷，加入无水硫酸钠干燥得到混合脂肪酸；
步骤s3：取500ml乙醇加热至70℃，边搅拌边加入尿素5g，使尿素完全溶于乙醇中得到尿素-乙醇溶液；
步骤s4：将步骤s3得到的尿素-乙醇溶液加入到步骤s2得到的混合脂肪酸中，维持温度70℃，回流搅拌1h，待混合物变澄清透明后停止加热，继续搅拌至冷却到室温；
步骤s5：在-5℃下包合24h，将所得尿素包合混合物过滤分离，用石油醚洗涤结晶物，洗涤2～3次，合并滤液；
步骤s6：向步骤s5得到的滤液中加入石油醚和稀碱液，其中滤液、石油醚与稀碱液的体积比为1:1:1，使用稀碱液作为萃取水相可以进一步除去提取液中的杂质成分，稀碱液为氢氧化钠溶液，萃取2～3次，收集有机相，将有机相水洗至中性，加入100g无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除石油醚得到亚油酸；亚油酸的收率计算方法同实施例1，经计算得到收率为14.4%。
实施例5
步骤s1：将牛膝叶粉碎成牛膝叶粉，精密称取50g，按料液比(w/v)1g:6ml加入300ml正己烷溶液，在50℃水浴中提取4h，重复提取2次，减压蒸馏回收溶剂后得到牛膝叶的混合油脂；
步骤s2：取步骤s1浸提的混合油脂，按料液比(w/v)1g:4ml加入naoh-c2h5oh溶液，在75～85℃水浴中反应3h，取出，加适量50～70℃温水溶解，搅拌20min，加盐酸溶液调节成ph值为2的酸性溶液，搅拌15min，分出油层，加入约10倍体积油层样量的正己烷萃取，并水洗至中性，减压蒸馏除去溶剂正己烷，加入无水硫酸钠干燥得到混合脂肪酸；
步骤s3：取500ml乙醇加热至70℃，边搅拌边加入尿素5g，使尿素完全溶于乙醇中得到尿素-乙醇溶液；
步骤s4：将步骤s3得到的尿素-乙醇溶液加入到步骤s2得到的混合脂肪酸中，维持温度70℃，回流搅拌1h，待混合物变澄清透明后停止加热，继续搅拌至冷却到室温；
步骤s5：在5℃下包合24h，将所得尿素包合混合物过滤分离，用石油醚洗涤结晶物，洗涤2～3次，合并滤液；
步骤s6：向步骤s5得到的滤液中加入石油醚和稀碱液，其中滤液、石油醚与稀碱液的体积比为1:1:1，使用稀碱液作为萃取水相可以进一步除去提取液中的杂质成分，稀碱液为氢氧化钠溶液，萃取2～3次，收集有机相，将有机相水洗至中性，加入100g无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除石油醚得到亚油酸；亚油酸的收率计算方法同实施例1，经计算得到收率为15.1%。
实施例6
步骤s1：将牛膝叶粉碎成牛膝叶粉，精密称取50g，按料液比(w/v)1g:6ml加入300ml正己烷溶液，在50℃水浴中提取4h，重复提取2次，减压蒸馏回收溶剂正己烷后得到牛膝叶的混合油脂；
步骤s2：取步骤s1浸提的混合油脂，按料液比(w/v)1g:4ml加入naoh-c2h5oh溶液，在75～85℃水浴中反应3h，取出，加适量50～70℃温水溶解，搅拌20min，加盐酸溶液调节成ph值为2的酸性溶液，搅拌15min，分出油层，加入约10倍体积油层样量的正己烷萃取，并水洗至中性，减压蒸馏除去溶剂正己烷，加入无水硫酸钠干燥得到混合脂肪酸；
步骤s3：取500ml乙醇加热至70℃，边搅拌边加入尿素5g，使尿素完全溶于乙醇中得到尿素-乙醇溶液；
步骤s4：将步骤s3得到的尿素-乙醇溶液加入到步骤s2得到的混合脂肪酸中，维持温度70℃，回流搅拌1h，混合物变澄清透明后停止加热，继续搅拌至冷却到室温；
步骤s5：在-5℃下包合10h，将所得尿素包合混合物过滤分离，用石油醚洗涤结晶物，洗涤2～3次，合并滤液；
步骤s6：向步骤s5得到的滤液中加入石油醚和稀碱液，其中滤液、石油醚与稀碱液的体积比为1:1:1，使用稀碱液作为萃取水相可以进一步除去提取液中的杂质成分，稀碱液为氢氧化钠溶液，萃取2～3次，收集有机相，将有机相水洗至中性，加入100g无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除石油醚得到亚油酸；亚油酸的收率计算方法同实施例1，经计算得到收率为13.2%。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。