高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法与流程

文档序号：18477181发布日期：2019-08-20 21:21阅读：706来源：国知局

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种能够高水平异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法。

背景技术：

碱性蛋白酶(alkalineprotease)，一类能够催化水解肽键的酶，其活性中心含丝氨酸，又称丝氨酸蛋白酶，在ph值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，它不但能水解肽键，还具有水解酰胺键、酯键以及转酯和转肽的功能。这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中,酶活性可受到二异丙基磷酰氟(dfp),苯甲基磺酰氟(pmsf)和马铃薯抑制剂(pi)等的专一性抑制。

碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。

并且芽孢杆菌具有以下优点：(1)在工业生产中，一般要求菌株对健康或环境无毒无害，芽孢杆菌中除了炭疽芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌的少数菌株外，几乎都没有致病性；(2)芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；(3)分子生物试验中所用的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组dna比较容易转入；(4)蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；(5)芽孢杆菌为单细胞生物，在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。

启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，通过启动子的优化，来提高外源蛋白的分泌量，从而实现外源蛋白的高效表达。信号肽也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。因此，筛选启动子和最优信号肽，是介导蛋白酶基因的表达并提高碱性蛋白酶产量非常有效的方法。专利申请cn107200772a公开了一种优化角蛋白酶高校分泌表达的信号肽及其应用，此信号肽是通过对来源于枯草芽孢杆菌的三种信号肽改造获得，通过在角蛋白酶ker的n端融合此信号肽，使重组枯草芽孢杆菌的角蛋白酶分泌效率显著提高，其胞外角蛋白酶酶活提高了3.39倍。专利申请cn104312933a公开了一种优化信号肽提高胰蛋白酶胞外分泌表达的方法，通过与胰蛋白酶融合表达8种毕赤酵母胞外分泌信号肽，甲醇诱导启动子(paox)在pichiapastorisgs115染色体上表达重组胰蛋白酶，该αmf信号肽与原始的α-factor信号肽相比，胰蛋白酶酶活提高了2.75倍，解决了胰蛋白酶胞外分泌量低的问题。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种高效表达碱性蛋白酶的基因工程菌。本发明可以有效地提高异源碱性蛋白酶的表达量，且方法简单、操作易行、表达稳定，适用于解淀粉芽孢杆菌的表达系统。

本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：

一种高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌，是利用核苷酸序列如seqidno：1所示的启动子与信号肽组合与克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因apre构建重组表达载体，并转入枯草芽孢杆菌宿主wb600中，最终电转到解淀粉芽孢杆菌cgmccno.11218中，获得重组基因工程菌。

所述克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因apre的核苷酸序列如seqidno：3所示。

所述表达载体为pwb980。

所述基因工程菌的构建步骤概述如下：

1)合成核苷酸序列如seqidno：1所示的启动子和信号肽组合ply-2+spvpr；

2)以克劳氏芽孢杆菌基因组为模板，根据genbank:fj940727.1克隆得到碱性蛋白酶基因apre；

3)ply-2+spvpr与apre片段经相同酶切后连接，连接产物纯化后克隆到pwb980表达载体上，转入枯草芽孢杆菌wb600细胞中构建重组菌；

4)提取出步骤3的重组菌的质粒，电转入解淀粉芽孢杆菌cgmccno.11218中构建重组菌。

所述基因工程菌应用于发酵生产重组碱性蛋白酶，摇瓶发酵培养48h后发酵液中重组碱性蛋白酶的活性最高为20000u/ml，是原始启动子p43和信号肽spsacb组合表达活性的2.8倍。

本发明的有益效果：

本发明通过筛选143种芽孢杆菌属来源的信号肽高效异源表达克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶，并通过与启动子ply-2组合后进一步提高蛋白酶表达量，方法简单易行，适用于枯草芽孢杆菌系统和解淀粉芽孢杆菌系统，信号肽优化后的克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性最高提高了2.8倍。为介导解淀粉芽孢杆菌表达系统中异源碱性蛋白酶基因的表达奠定基础，推动碱性蛋白酶的高效表达及工业化生产。

附图说明

图1：克劳氏碱性蛋白酶基因重组表达载体图谱。

图2：对照重组载体图谱。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所用培养基及酶活测定方法：

种子培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l；

发酵培养基：玉米粉64g/l，豆饼粉40g/l，磷酸氢二钠4g/l，磷酸二氢钾0.3g/l，高温淀粉酶0.7g/l。

枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：

sp-a盐溶液：(nh4)2so44g/l，k2hpo4·3h2o28g/l，kh2po412g/l，柠檬酸钠2g/l；

sp-b盐溶液：mgso4·7h2o0.4g/l；

100×caye溶液：酪蛋白水解物20g/l，酵母粉100g/l；

spi(200ml)：sp-a盐溶液98ml，sp-b盐溶液98ml，50％葡萄糖2ml，100×caye2ml；

spii培养基(600ml)：spi588ml，50mmol/lcacl26ml，250mmol/lmgcl26ml；

100×egta溶液：10mmol/legta溶液。

解淀粉芽孢杆菌感受态制备培养基：

lbs培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，山梨醇9.1085g/l；

复苏培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，山梨醇9.1085g/l，甘露醇6.92246g/l。

本发明所用碱性蛋白酶酶活力测定方法参照gb/t23527-2009附录b福林酚法进行，即1个酶活力单位(u/ml)定义为1ml酶液在40℃、ph10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

实施例1：

信号肽的筛选与组合。

利用ncbi数据库并通过在线分析软件signalp5.0server和tatp1.0server预测获得芽孢杆菌来源的143种信号肽，分别与启动子ply-2(核苷酸序列如seqidno：2所示)组合合成。根据genbank:fj940727.1的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列设计引物，以克劳氏芽孢杆菌基因组为模板，pcr扩增碱性蛋白酶基因apre，纯化回收，测序，测序结果经过在ncbi上比对与genbank:fj940727.1的碱性蛋白酶基因同源性为100％。以碱性蛋白酶基因为报告基因，筛选获得一种最优的启动子与信号肽组合ply-2+spvpr(核苷酸序列如seqidno：1所示)，并实现了克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶在解淀粉芽孢杆菌宿主中的高效异源表达。

所用引物序列及酶切位点如下表：

扩增目的基因时所用的反应体系为50μl，如下所示：

apre的退火温度是58℃，延伸时间与基因长度对应，反应程序如下：

实施例2：

重组碱性蛋白酶基因工程菌的构建。

含启动子和信号肽组合片段ply-2+spvpr的质粒被试剂盒回收后，双酶切(ecorⅰ-hindⅲ)回收片段。碱性蛋白酶apre基因经pcr扩增纯化后经双酶切(hindⅲ-sphⅰ)回收。将启动子和信号肽组合片段ply-2+spvpr、碱性蛋白酶基因apre通过连接酶连接到经双酶切(ecorⅰ-sphⅰ)的pwb980表达载体上(如图1所示)，转化枯草芽孢杆菌wb600。此外，将纯化后的碱性蛋白酶基因片段克隆到双酶切(hindⅲ-sphⅰ)pwb980表达载体上，利用其原始启动子p43和信号肽spsacb构建重组质粒作为对照(如图2所示)，后续构建相同宿主的表达。

酶切体系如下：

pwb980表达载体的酶切及与目的基因的连接：

(1)提取pwb980质粒，然后根据所需要的限制性内切酶双酶切质粒，酶切条件37℃、2h；

(2)对酶切目的片段进行胶回收纯化；

(3)将回收好的目的片段和pwb980片段连接，连接条件：16℃，6h或过夜连接，连接体系如下：

目的片段4.5μl

线性pwb980片段0.5μl

solutioni5.0μl

枯草芽孢杆菌wb600化转方法：

(1)挑取新活化的枯草芽孢杆菌wb600单菌落于5mllb液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养；

(2)取100μl培养液转接至5mlspi培养基中，37℃，220r/min培养至对数生长末期od600＝1.2(约3–4h)；

(3)取200μl生长至对数期末的培养液至2mlspii培养基中，37℃，100r/min培养1.5h；

(4)在上述spii培养基的菌体中加入20μl10mmol/legta，37℃，100r/min培养10min；

(5)加入连接产物，37℃，100r/min培养30min；

(6)调节转速至220r/min，继续培养1.5h，取菌液涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb筛选平板，37℃培养12h，筛选阳性转化子进行验证。

实施例3：

重组碱性蛋白酶基因工程菌在解淀粉芽孢杆菌的构建。

提取在wb600中的重组质粒。

解淀粉芽孢杆菌cgmccno.11218电转方法：

(1)75％酒精清洗电转杯，在紫外下照射20min以上，并在冰上预冷。

(2)将100μl感受态和10ng质粒dna混合加入电转杯，冰上放置2min。

(3)2500v电击，电击时间一般为4-6ms.

(4)电击后立即加入1ml复苏培养基，37℃，复苏3h。涂板，37℃培养箱培养。

实施例4：

重组碱性蛋白酶基因工程菌的表达及分析。

将新鲜平板上的重组基因工程菌(ply-2+spvpr和p43+spsacb)的单菌落分别接入50ml卡那霉素抗性种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h，以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

按照国家标准gb/t23527-2009附录b福林酚法测定重组基因工程菌发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，经测定48h各重组菌发酵上清液中重组碱性蛋白酶活力达到最高。测定重组碱性蛋白酶的酶活，与对照组p43和spsacb组合的重组菌株酶活(7154u/ml)相比，本发明构建的ply-2+spvpr重组菌株表达碱性蛋白酶的活性最高达到20000u/ml，是对照重组菌的2.8倍。

实施例5：

重组碱性蛋白酶基因工程菌的放大实验。

挑取平板上的重组菌(ply-2+spvpr)单菌落接入100ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，220r/min。培养4h后，以2％的接种量转接到100ml的发酵培养基中，37℃，220r/min，培养8h后，以2％的接种量转接到装液量为3l的5l发酵罐进行放大实验。发酵培养过程中控制发酵罐中溶氧量为40％以上，搅拌速度为600rpm-700rpm，温度为37℃；当ph＝7的时候开始补料(补料培养基：棉籽蛋白50g/l，糊精300g/l)，初始补料量为100g/h，整个发酵期间通过补料来控制de值为15mg/ml-18mg/ml。发酵前期适当添加消泡剂来控制发酵过程中泡沫的产生。每隔两个小时取样，福林酚法测酶活。测得重组菌株(ply-2+spvpr)中碱性蛋白酶酶活在发酵56h后酶活达到最大为60000u/ml。

序列表

<110>天津科技大学

<120>高效异源表达碱性蛋白酶的基因工程菌及其构建方法

<141>2019-04-24

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>689

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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<211>596

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2