本发明涉及动物发酵饲料技术领域，具体涉及一种用于发酵苹果渣的复合菌剂、冻干菌剂和苹果渣蛋白饲料。
背景技术：
我国是世界上苹果种植面积和年产量最大的产地，占世界总产量的55％。目前，苹果除销往国内外市场鲜食外，苹果汁生产已成为苹果产业链延伸的主要产品之一，是苹果深加工的主要途径之一。
苹果渣是苹果榨汁后的副产品。据报道，我国苹果加工中每年用于榨汁，年产生果渣百多万吨。随着果汁加工业的快速发展，果渣的产出量也在不断增加。苹果渣是新鲜苹果在加工生产果汁的过程中产生的副产物，包括果肉果皮、果籽、果梗，含量分别占96.2％，3.1％，0.7％。苹果渣含有较高水分(约80％以上)，含有丰富的钙、磷、钾、铁、锰等矿物质和多种维生素，蛋白质含量极低，无氮浸出物含量较高，其主要成分是可溶性的碳水化合物、果胶、除脂肪酸外的有机酸和半纤维素等物质。研究发现，苹果渣是一种高纤维、低蛋白、中等能量的多水分的原料，重金属含量和农药残留量均在饲料卫生标准的范围之内。
但目前，我国的苹果渣绝大部分因无法进行综合利用而废弃，在苹果渣中微生物和环境中微生物的共同作用下，几天内就腐烂变质，发出酸臭味，造成了严重的资源浪费和环境污染。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于发酵苹果渣的复合菌剂、冻干菌剂和苹果渣蛋白饲料。利用本发明提供的复合菌剂生产的苹果渣蛋白饲料，粗蛋白含量可达20％以上，且16种氨基酸总和大于7.54g/100g，低纤维，营养全面，绿色安全，成本低、效益高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于发酵苹果渣的复合菌剂，包括以下体积份的组分：白地霉29～36份、酵母菌16～36份、枯草杆菌8～31份、根霉菌8～17份和绿色木霉8～17份；
所述白地霉、酵母菌、枯草杆菌、根霉菌和绿色木霉的有效活菌数分别独立的为≥1×109cfu/ml。
本发明还提供了一种用于发酵苹果渣的冻干菌剂，包括上述技术方案所述的复合菌剂和保护剂，所述保护剂和复合菌剂的体积比为30～50:100。
优选地，所述冻干菌剂中的有效活菌数为≥3×1010cfu/g。
优选地，所述保护剂包括含有质量分数为5％蔗糖和3％海藻糖的脱脂牛乳。
本发明还提供了一种苹果渣蛋白饲料，包括以下质量份的原料制备而成：上述技术方案所述的冻干菌剂制备得到的种子液2～15份、苹果渣80～82份、麸皮14～16份、尿素1.4～1.6份、硫酸铵1.8～2.2份、碳酸钙0.08～0.12份和磷酸氢二钾0.08～0.12份。
优选地，所述种子液的制备方法，包括：将上述技术方案所述的冻干菌剂接种于麦芽汁液体培养基进行第一培养，得到第一培养物；将第一培养物接种于苹果渣培养基进行第二培养，即得到种子液。
优选地，所述麦芽汁液体培养基以ddh2o为溶剂，每升包括麦芽汁培养基120～140g。
优选地，所述苹果渣培养基以ddh2o为溶剂，每升包括干苹果渣40～60g。
优选地，所述第一培养和第二培养的温度分别独立的为25～35℃；所述第一培养的时间为16～24h；所述第二培养的时间为48～72h。
优选地，所述种子液中的有效活菌数为≥1×1011cfu/g。
本发明提供了一种用于发酵苹果渣的复合菌剂，该复合菌剂白地霉、酵母菌、枯草杆菌、根霉菌和绿色木霉组成，发酵时可互相补偿其缺陷，协同互生发酵。
本发明将复合菌剂制备成冻干菌剂，具有活菌率高、保存时间长、保存方便的特点。
利用本发明提供的复合菌剂发酵苹果渣，粗蛋白含量可达20％以上，且16种氨基酸总和大于7.54g/100g，全面提高苹果渣的蛋白质含量，降低纤维素的含量，改善适口性，最大限度地提高苹果渣作为饲料的使用价值。
具体实施方式
本发明提供了一种用于发酵苹果渣的复合菌剂，包括以下体积份的组分：白地霉29～36份、酵母菌16～36份、枯草杆菌8～31份、根霉菌8～17份和绿色木霉8～17份；所述白地霉、酵母菌、枯草杆菌、根霉菌和绿色木霉的有效活菌数分别独立的为≥1×109cfu/ml。本发明对所述白地霉、酵母菌、枯草杆菌、根霉菌和绿色木霉的来源没有特殊限定，采用常规市售或常规分离方法分离得到的均可。
在本发明中，所述复合菌剂中的组分具体的体积份优选为白地霉33.3份、酵母菌33.3份、枯草杆菌8.3份、根霉菌8.3份和绿色木霉16.7份。
本发明还提供了一种用于发酵苹果渣的冻干菌剂，包括上述技术方案所述的复合菌剂和保护剂，所述保护剂和复合菌剂的体积比为30～50:100，优选为35～45:100，更优选为40:100。本发明对所述冻干菌剂的制备方法没有特殊限定，优选采用冷冻干燥或低温晾干的方法。
在本发明中，优选将冻干菌剂制备成冻干粉，所述冻干粉的制备方法优选为将冻干菌剂置于球磨机腔体中，腔体密闭下抽真空，真空度为-0.09mpa，然后喷入液氮，冻干菌剂与液氮的质量体积比例为1:1，开动球磨机进行研磨，把冻干菌剂研磨成60目的冻干粉。本发明所述的冻干粉，在常温下24～26℃保存2个月，4～8℃保存1年，-20℃保存2年。
在本发明中，所述冻干菌剂中的有效活菌数优选为≥3×1010cfu/g。
在本发明中，所述保护剂优选含有质量分数为5％蔗糖和3％海藻糖的脱脂牛乳。本发明对所述保护剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
本发明还提供了一种苹果渣蛋白饲料，包括以下质量份的原料制备而成：上述技术方案所述的冻干菌剂制备得到的种子液2～15份、苹果渣80～82份、麸皮14～16份、尿素1.4～1.6份、硫酸铵1.8～2.2份、碳酸钙0.08～0.12份和磷酸氢二钾0.08～0.12份。本发明对所述麸皮、尿素、硫酸铵、碳酸钙和磷酸氢二钾的来源没有特殊限定，采用常规市售食品级产品即可。
在本发明中，所述苹果渣蛋白饲料的原料具体的质量份优选为种子液2份、苹果渣80.5份、麸皮15.8份、尿素1.5份、硫酸铵2份、碳酸钙0.1份和磷酸氢二钾0.1份。
在本发明中，所述种子液的制备方法，优选包括：将上述技术方案所述的冻干菌剂接种于麦芽汁液体培养基进行第一培养，得到第一培养物；将第一培养物接种于苹果渣培养基进行第二培养，即得到种子液。
在本发明中，所述麦芽汁液体培养基优选以ddh2o为溶剂，每升包括麦芽汁培养基120～140g，更优选麦芽汁培养基为130.1g。本发明对所述麦芽汁液体培养基的制备方法没有特殊限定，优选将麦芽汁培养基和ddh2o溶解，121℃灭菌15min制备得到。本发明对所述麦芽汁培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
在本发明中，所述第一培养的温度优选为25～35℃，更优选为30℃；所述第一培养的时间优选为16～24h。
在本发明中，所述苹果渣培养基优选以ddh2o为溶剂，每升包括干苹果渣40～60g。本发明对所述苹果渣培养基的制备方法没有特殊限定，优选将经过40目筛的干苹果渣6g和ddh2o100ml，溶解，121℃高压灭菌30min制备得到。
在本发明中，所述第二培养的温度优选为25～35℃，更优选为30℃；所述第二培养的时间优选为48～72h。
在本发明中，所述种子液中的有效活菌数优选为≥1×1011cfu/g。
在本发明中，所述苹果渣蛋白饲料的制备方法优选为发酵，所述发酵的温度优选为28～30℃，所述发酵的时间优选为20～30d。
在本发明中，优选将发酵的苹果渣自然晒干或烘干，即得到苹果渣蛋白饲料。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
用于发酵苹果渣的复合菌剂菌种的筛选：
1.1菌种活化
将分别保存的冻干菌种白地霉、酵母菌、根霉菌、枯草杆菌、绿色木霉、黑曲霉和米曲霉的安瓿瓶外表消毒后，分别打开安瓿瓶，分别加入培养液消溶再移植于对应各个菌种生长的斜面培养基上，置于31℃培养24h～72h。结果显示，白地霉、酵母菌、根霉菌、枯草杆菌、绿色木霉、黑曲霉和米曲霉均能够在斜面培养基生长，且生长良好。白地霉、酵母菌、根霉菌、枯草杆菌、绿色木霉、黑曲霉和米曲霉接种的斜面培养基均为常规培养上述菌种的培养基。
1.2菌种在不同含量的苹果渣培养基上生长
将1.1不同的菌种分别划线接种在不同含量的苹果渣琼脂平板上，31℃下培养24h～72h，观察苹果渣琼脂平板上各菌种的生长情况。试验结果表明，白地霉、酵母菌、根霉菌、枯草杆菌、绿色木霉、黑曲霉和米曲霉均能在4％以上的苹果渣中生长，且生长良好。
1.3菌种的平板点种
斜面上菌种白地霉、酵母菌、根霉菌、枯草杆菌、绿色木霉、黑曲霉和米曲霉分别划线接种到6％苹果渣培养基(40目的干苹果渣6g，琼脂粉1.5g，ddh2o100ml)，121℃高压灭菌30min上，31℃下培养72h，观察苹果渣琼脂平板上各菌种的生长情况。根据上述7株菌种在6％苹果渣平板上点种的生长情况看，均能在平板上形成不同大小的菌圈，且生长良好。
1.4菌种的平板点种刺激圈
利用微生物共同生长的原理，进行平板点种刺激圈。白地霉斜面菌种用少量灭菌水洗下，接入到灭菌的6％苹果渣琼脂中，再分别点种待选菌，31℃培养72h，观察固体平板点种各菌株处白地霉的生长情况。结果证实酵母菌、根霉菌、枯草杆菌、绿色木霉、黑曲霉和米曲霉可明显刺激白地霉的生长。
1.5菌种混合比确定
1.5.1单菌种的发酵
将7株菌分别接种于6％苹果渣中，发酵72h，发酵结束后置65℃烘干，测定发酵样品的蛋白质含量。试验结果显示，这7株菌均能对苹果渣发酵，且能产生较高含量的粗蛋白。由于黑曲霉发酵苹果渣后外观易产生黑色的孢子。因此，本发明在以后的试验中剔除了黑曲霉。
1.5.2两菌种的混合比
将7株菌以2株为一组合，从中选取10对组合，分种比按体积比1:0.2、1:0.5、1:1、2:1分别接种6％苹果渣中，发酵72h，发酵结束后置65℃烘干，测定发酵样品的蛋白质含量。结果见表1。
表1两菌种的分种混合比结果
以白地霉为中心展开两菌种的分种混合比。从表1可知，白地霉+米曲霉、米曲霉+绿色木霉发酵苹果渣其产物蛋白质含量相对较低。因此，在以后的试验中剔除了米曲霉。
1.5.3五菌种的混合比
按2株菌为一组合测定样品蛋白质的结果，以白地霉为指标菌，从中选取10个组合，按不同菌种的比例分别接种于6％苹果渣中，发酵72h，发酵结束后置65℃烘干，测定发酵样品的蛋白质含量。结果见表2。
表2五菌种组合的分种混合比结果
从表2结果知，白地霉+酵母菌+根霉+枯草杆菌+绿色木霉的在上述10种分种比中发酵后干燥样品的蛋白质含量均能够达到12mg/g以上。
实施例2
复合菌剂发酵苹果渣的接种量
将白地霉+酵母菌+根霉+枯草杆菌+绿色木霉菌种按照2:2:0.5:0.5:1的接种比例分别接种在麦芽汁液体培养基上，培养16h，作为基础种子；再将基础种子按比例接种于干苹果渣培养基100g(料水比为10：8)中，于31℃培养48h，作为一级种子；将一级种子按不同的比例接种于灭菌的新鲜苹果渣(苹果渣干物质含量为20％，水分含量为80％)培养基100g中，31℃培养72h后，在65℃烘干发酵的苹果渣；设未发酵的同批新鲜苹果渣65℃烘干的产物为对照组。采用双缩脲法测定其发酵前后苹果渣的蛋白质含量。结果见表3。
表3复合菌剂不同接种量对发酵蛋白质含量的影响
从表3可知，将白地霉+酵母菌+根霉+枯草杆菌+绿色木霉组成的复合菌剂按2％～15％的比例接种于灭菌的新鲜苹果渣中，其产物蛋白含量能够达到6.668～8.210mg/g。
实施例3
复合菌剂：白地霉29ml、酵母菌16ml、枯草杆菌8ml、根霉菌8ml和绿色木霉8ml。其中，复合菌剂是将白地霉、酵母菌、枯草杆菌、根霉菌和绿色木霉分别按1％比例接种于麦芽汁液体培养基中，30℃180rpm摇振培养18h后，分别取白地霉菌液29ml、酵母菌菌液16ml、枯草杆菌菌液8ml、根霉菌菌液8ml和绿色木霉菌液8ml混合得到。白地霉菌液、酵母菌菌液、枯草杆菌菌液、根霉菌菌液和绿色木霉菌液的有效活菌数均为1×109cfu/ml。
实施例4
复合菌剂：白地霉36ml、酵母菌36ml、枯草杆菌31ml、根霉菌17ml和绿色木霉17ml。复合菌剂的制备方法同实施例3。白地霉菌液、酵母菌菌液、枯草杆菌菌液、根霉菌菌液和绿色木霉菌液的有效活菌数均为2×109cfu/ml。
实施例5
复合菌剂：白地霉33ml、酵母菌33ml、枯草杆菌8ml、根霉菌8ml和绿色木霉16ml。复合菌剂的制备方法同实施例3。白地霉菌液、酵母菌菌液、枯草杆菌菌液、根霉菌菌液和绿色木霉菌液的有效活菌数均为2.5×109cfu/ml。
实施例6
冻干菌剂：白地霉33.3ml、酵母菌33.3ml、枯草杆菌8.3ml、根霉菌8.3ml、绿色木霉16.8ml和含质量份数为5％蔗糖和3％海藻糖的脱脂牛乳30ml。
冻干菌剂的制备方法：将白地霉、酵母菌、枯草杆菌、根霉菌和绿色木霉分别按1％比例接种于麦芽汁液体培养基中，30℃180rpm摇振培养18h；培养结束后，按白地霉33.3ml、酵母菌33.3ml、枯草杆菌8.3ml、根霉菌8.3ml、绿色木霉16.8ml(培养物中的有效活菌数分别达109cfu/ml以上)比例混合，4000rpm离心30min，弃离心上清液；菌泥中加入经37℃预热的灭菌的冻干保护剂5％蔗糖和3％海藻糖的脱脂牛乳30ml，充分混匀后，分装在灭菌的平盘中。分装过程应注意保温振摇均匀，并迅速冷冻真空干燥，本发明提供的菌种冻干曲线(冻干曲线：降温至-25～-40℃开始抽真空，经过20～30h，升温至15～25℃，维持4～6h)。冷冻真空干燥结束后，经真空-充氮研磨粉碎成粉末，并迅速地分装于灭菌的瓶或铝箔袋内，并封口。本发明制备得到的冻干粉白色海绵状疏松粉末，有效活菌数为3×1010cfu/g。
实施例7
发酵苹果渣工艺条件：
1不同接种量对苹果渣中粗蛋白含量的影响
将实施例6制备的冻干粉复合菌剂按质量比2％、3％、5％、8％、10％、15％接入100g苹果渣发酵培养基，混匀，30℃培养3d，65℃烘干，测定其粗蛋白质含量。结果见表4。
表4菌种的不同接种量对苹果渣中粗蛋白含量的影响
注：干菌种的粗蛋白含量13.414mg/g
从表4可知，在干苹果渣中接种2％～15％的固态菌种，在新鲜苹果渣中接种2％～15％的固态菌种，均能很好地发酵苹果渣，能提高发酵苹果渣产物中蛋白质含量。
2料水比对发酵苹果渣粗蛋白含量的影响
在干苹果渣发酵培养基中，料水比分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，均按2％接种活化实施例6制备的冻干粉复合菌剂，30℃发酵72h，65℃烘干，测定产品粗蛋白含量。结果见表5。
表5料水比对发酵苹果渣粗蛋白含量的影响
从结果可知，料水比控制在10:5～10:10之间，菌种均能很好地在苹果渣培养基上生长，能利用苹果渣而发酵产生较高含量的蛋白质产物。
3发酵时间和发酵料层厚度对发酵苹果渣粗蛋白含量的影响
按2％接种活化的实施例6制备的冻干粉复合菌剂于100g苹果渣发酵培养基中，30℃发酵，在不同的发酵时间和不同的发酵料层厚度采集样品；样品65℃烘干，测定其样品中粗蛋白含量。结果见表6。
表6发酵时间对发酵产物粗蛋白含量的影响
从表6可知，在料层厚度为2～20cm，发酵时间在24～120h进行发酵，均能产生较高含量的蛋白质产物。
5发酵工艺及对比对发酵苹果渣粗蛋白含量的影响
分别以本发明筛选出复合菌剂、宁夏牧光用菌种和天宝ⅱ号为菌种，按接种量10％、料水比10:7、发酵时间72h和料层厚度为5cm发酵干苹果渣培养基，进行烘干后样品粗蛋白含量。结果见表7，这三种菌种按相同的发酵工艺对干苹果渣发酵，均能提高苹果渣发酵产物中粗蛋白的含量。而试验证实，本发明复合菌剂能显著提高发酵产物中粗蛋白的含量且优于宁夏牧光和天宝ⅱ号。
表7发酵工艺及对比对发酵苹果渣粗蛋白含量的影响
实施例8
苹果渣蛋白饲料
1.生产用种子液
将实施例6制备的冻干菌剂接种于麦芽汁液体培养基30℃培养24h，得到第一培养物；再将第一培养物接种于苹果渣培养基(由苹果渣80.5g、麸皮15.8g、磷酸氢二钾(k2hpo4.3h2o)0.1g、无水碳酸钙0.1g、尿素1.5g、硫酸铵2.0g组成的发酵培养基中，料水比10:8)，经30℃培养72h，得到第二培养物，即为发酵苹果渣的生产用种子液。
2.发酵苹果渣的生产
将发酵好的生产用种子液以质量比2％接入由苹果渣80.5g、麸皮15.8g、磷酸氢二钾(k2hpo4.3h2o)0.1g、无水碳酸钙0.1g、尿素1.5g、硫酸铵2.0g组成的发酵培养基中，料水比10:8，搅拌均匀后，装入发酵池，外加塑料棚膜进行发酵30天，并每日观察发酵情况。待发酵完成后，随机采样进行质检。并采集中宁瑞恒科技产业有限公司、牧光和泰丰发酵苹果渣为对照样品，送谱尼测试集团上海有限公司检测，检测结果见表8。
表8不同发酵苹果渣检测结果
从表8可知，本发明的苹果渣蛋白饲料在粗蛋白和16种氨基酸总和上均高于苹果渣、瑞恒、牧光和泰丰样品，其粗蛋白含量提高9～20个百分点，显著地提高了发酵苹果渣中蛋白的含量和16种氨基酸总和；本发明的苹果渣蛋白饲料在粗蛋白和16种氨基酸总和上比苹果渣中分别提高了15个百分点和6个点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。