一种膜表面工程化NK细胞的制备方法及药物组合物与应用与流程

本发明涉及一种用于肿瘤免疫治疗的靶向性nk细胞构建，具体涉及一种膜表面工程化nk细胞的制备方法及药物组合物与应用。

背景技术：

pd-1/pd-l1免疫检查点抑制剂能够激活显著的、持久的抗肿瘤免疫反应，已经被批准用于包括晚期非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌和三阴性乳腺癌等多种肿瘤的治疗，是目前最具有前景的肿瘤治疗手段。但遗憾的是，约70%的晚期肿瘤患者对pd-1/pd-l1免疫检查点抑制剂治疗不反应，因此，探寻如何提高阻断pd-1/pd-l1通路治疗效果具有重要的研究意义，也是目前研究的热点。

nk细胞作为天然免疫的重要组成部分，对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用，并通过分泌细胞因子和趋化因子发挥免疫调节功能。与t细胞不同，nk细胞发挥杀伤活性不需要肿瘤细胞表达肿瘤抗原，并且对低表达或不表达mhc分子的肿瘤细胞杀伤活性更强；目前普遍认为pd-1/pd-l1免疫检查点诱导cd8⁺t细胞功能耗竭，免疫检查点抑制剂通过激活cd8⁺t细胞发挥抗肿瘤活性。而最近研究表明，pd-1/pd-l1通路能显著地抑制nk细胞的功能，在免疫检查点抑制剂激活的抗肿瘤免疫反应中，nk细胞同t细胞一样，发挥必不可少的作用（jclininvest2018,128(10):4654-4668.）。

过继性回输同种异体nk细胞已经在临床试验中用于血液类肿瘤（淋巴瘤、急性白血病等）和多种实体瘤（晚期胃癌和结直肠癌、胃肠部肿瘤的肝转移和儿童复发、难治性神经母细胞瘤等）的治疗，具有很好的安全性，不会引起移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease，gvhd），但是仅具中等的治疗效果。可能的原因是nk细胞缺乏靶向性以及肿瘤浸润不足（natimmunol2016,17(9):1025-1036.）；为了提高nk细胞的靶向杀伤活性，目前的研究主要通过病毒载体构建靶向肿瘤抗原的car-nk细胞，但是即使采用慢病毒感染的方法，原代nk细胞的car载体转染效率依然低下（humgenether2012,23(10):1090-1100.）。并且病毒载体具有一定的安全隐患（natmed2018,24(10):1499-1503.），car-nk制备周期较长，费用高昂；因此，开发一种非转染的方式提供nk细胞的靶向性的方法是目前的研究热点。

因此，本领域迫切需要增强靶向pd-1/pd-l1通路治疗的敏感性及nk细胞靶向性，本发明解决了该需求。

技术实现要素：

为了解决目前临床晚期肿瘤患者对阻断pd-1/pd-l1通路治疗不反应的问题，本发明建立靶向pd-l1的膜表面工程化nk细胞的制备体系，一方面增强nk细胞靶向肿瘤迁移能力和杀伤活性，另一方面阻断pd-1/pd-l1通路介导的免疫逃逸；针对外周血来源nk细胞病毒载体转染效率低下的问题，本发明采用非病毒载体的方式，利用代谢糖生物工程和无铜点击化学的方式构建将靶向pd-l1的多肽修饰到nk细胞表面，增强nk细胞的靶向性。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种膜表面工程化nk细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）所述nk细胞源自于外周血的单个核细胞；

（2）用nk细胞配制细胞浓度为1×10⁶-3×10⁶个/ml的nk细胞悬液，加入浓度为5-100μm的靶向载体溶液后孵育12-72小时，所述靶向载体为ac4mannaz或ac4mann-dbco；

（3）孵育完成后，以离心力400×g室温离心5分钟，弃上清，得到孵育细胞，使用培养基重悬孵育细胞，然后加入浓度为5-100μm的靶向pd-l1的多肽溶液进行二次孵育，靶向pd-l1的多肽为n3-p13或dbco-p13，二次孵育时间为0.5-4小时；所述孵育细胞为nk-ac4mannaz或nk-ac4mann-dbco细胞；

所述多肽n3-p13的氨基酸序列为dbco-mal-cys-peg4-nyskptdrqyhfk；多肽dbco-p13的氨基酸序列为n3-mal-cys-peg4-nyskptdrqyhfk；

（4）二次孵育结束后，以离心力400×g室温离心5分钟，弃上清，生理盐水洗两遍后得到膜表面工程化nk细胞，即nk-ac4mann-p13细胞，使用生理盐水重悬nk-ac4mann-p13细胞，使其细胞浓度为2×10⁶-80×10⁶个/ml。

其中，所述nk细胞由外周血的单个核细胞经体外扩增培养得到；

所述步骤（2）中靶向载体溶液的浓度优选为26-60μm，孵育时间优选为12-48小时；

所述步骤（3）中靶向pd-l1的多肽溶液的浓度优化为10-40μm，二次孵育时间优化为0.5-2小时；

一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-4所述膜表面工程化nk细胞以及任选的药学上可接受的辅料。

一种膜表面工程化nk细胞的应用，用于治疗或辅助治疗pd-l1阳性肿瘤；所述pd-l1阳性肿瘤为头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌或三阴性乳腺癌。

本发明相比现有技术具有以下优点：首先，通过非病毒载体即靶向载体，增强nk细胞的靶向性，消除采用病毒载体转染引发的潜在危险；其次，同种异体nk-ac4mann-p13细胞不会引起gvhd，解决目前car-t细胞个体化和制作过程繁琐的问题；针对于目前阻断pd-1/pd-l1通路治疗不反应的pd-l1阳性肿瘤，nk-ac4mann-p13细胞通过结合肿瘤细胞表面的pd-l1蛋白，在增强nk细胞的肿瘤浸润能力和靶向杀伤活性的同时，能有效阻断pd-1/pd-l1通路介导的免疫逃逸；nk-ac4mann-p13细胞将显著增强阻断pd-1/pd-l1通路的治疗效果，具有潜在的临床应用前景。

附图说明

图1是体外扩增nk细胞（cd3^-cd56⁺）纯度检测图。

图2是nk-ac4mann-p13-fitc细胞比例检测图。

图3是体外杀伤头颈部鳞状细胞癌细胞系fadu活性检测图。

图4是体内杀伤头颈部鳞状细胞癌细胞系fadu移植瘤活性检测。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加更加清楚、明白，对本发明进一步说明。下述实施例仅用于例示本发明，并不用于限定本发明。如无特殊说明，实施例中所述方法均为常规方法，如无特殊说明所述仪器、材料和试剂等，均2可通过商业途径获得。

实施例1制备nk-ac4mann-p13细胞包括以下步骤

1.1由外周血的单个核细胞经体外扩增培养得到nk细胞，如图1中所示，所述nk细胞（cd3^-cd56⁺）纯度可达95%；

1.2使用l500培养基调整nk细胞浓度至1×10⁶-3×10⁶个/ml；

1.3加入终浓度为26-60μm的靶向载体ac4mannaz或ac4mann-dbco，在设定条件为温度37℃含5%co2的培养箱中孵育12-48小时；

1.4孵育结束后，以离心力400×g室温离心5分钟，弃上清，使用l500培养基重悬细胞，加入终浓度为10-40μm的靶向pd-l1的多肽n3-p13或dbco-p13多肽，在设定条件为温度37℃含5%co2的培养箱中二次孵育0.5-2小时；

1.5二次孵育结束后，以离心力400×g室温离心5分钟，弃上清，用生理盐水洗两遍后，使用生理盐水重悬nk-ac4mann-p13细胞，待用。

实施例2nk-ac4mann-p13细胞阳性检测

2.1按照实施例1制备方法制备nk-ac4mann-p13细胞，将步骤1.4中靶向pd-l1的多肽n3-p13或dbco-p13多肽替换为n3-p13-fitc或dbco-p13-fitc多肽，制备nk-ac4mann-p13-fitc细胞；

2.2通过共聚焦荧光显微镜检测nk-ac4mann-p13-fitc细胞比例的结果如图2-a中所示，通过流式细胞仪检测nk-ac4mann-p13-fitc细胞比例的结果如图2-b中所示，nk-ac4mann-p13-fitc细胞比例达到100%。

实施例3nk-ac4mann-p13细胞体外杀伤活性检测

对实施例1中制备的nk-ac4mann-p13细胞的杀伤活性进行检测

使用艾森生物的实时无标记细胞功能分析仪检测不同效靶比的nk-ac4mann-p13细胞及对照细胞对头颈部鳞状细胞癌fadu细胞的杀伤活性。

具体操作步骤如下：

3.1取对数生长期的fadu细胞，常规消化成浓度至2.67×10⁵个/ml的细胞悬液；

3.2将步骤3.1所得细胞悬液加至实时无标记细胞功能分析仪e-plate8检测板上，每孔加入300μl，置入37℃含5%co2培养箱中静置培养18-24小时；

3.3将100μl的nk-ac4mann-p13细胞及对照组nk细胞悬液以不同的效靶比(e:t=0:1，2.5:1，5:1，10:1)加入e-plate8检测板内；

3.4将上述e-plate8检测板置于实时无标记细胞功能分析仪检测台上实时监测，观察nk-ac4mann-p13细胞及对照组nk细胞对fadu细胞的影响；

3.5图3为体外杀伤头颈部鳞状细胞癌细胞系fadu活性检测图，分析实验结果，在加入nk-ac4mann-p13细胞及对照组nk细胞的时间点，如图3-a中所示，均一化细胞指数值，获得均一化细胞指数（nci），统计加入nk-ac4mann-p13细胞及对照组nk细胞4小时后的nci值，计算不同效靶比nk-ac4mann-p13细胞及对照细胞对fadu细胞杀伤活性，得到在不同效靶比的杀伤百分比如图3-b所示，与nk细胞相比，nk-ac4mann-p13细胞的杀伤活性显著提高。

实施例4nk-ac4mann-p13细胞体内抗肿瘤活性检测

balb/c裸鼠接种fadu细胞构建荷瘤小鼠模型，待肿瘤体积长至50mm³时，通过尾静脉分别回输nk-ac4mann-p13细胞、nk-ac4mann细胞、nk+p13细胞和nk细胞，每周回输两次，每次回输2×10⁷个细胞/ml，观测肿瘤生长情况，其结果如图4所示，图4-a为各组的肿瘤体积变化情况，图4-b中为各组肿瘤照片，可以明显的看出nk-ac4mann-p13细胞组的肿瘤体积最小，说明与其他对照组相比对体内杀伤头颈部鳞状细胞癌细胞系fadu移植瘤活性显著提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。