大豆E3泛素连接酶GmNLA1编码基因的应用的制作方法

本发明涉及大豆e3泛素连接酶gmnla1编码基因的应用，属于基因工程领域，具体地讲大豆e3泛素连接酶gmnla1基因影响大豆毛状根中磷浓度，进而改变磷利用效率。

背景技术：

磷(p)是植物生长和繁殖中必不可少的矿物元素之一(lópez-arredondoetal.2014)，它参与许多代谢过程，如能量和细胞膜形成，核酸合成，光合作用和呼吸作用。此外，p含量为植物干重的0.05％-0.5％(vanceetal.2003)。从1961年到2013年，世界上使用的农肥总量为每年1750万吨。单位面积磷肥的使用量在同一时期增加了约3倍(lu&tian2017)。施用磷肥可提高作物产量，但施用于土壤的p肥80％-90％被微生物吸附，或与金属离子形成难溶性螯合物(holford1997)。只有正磷酸盐离子(h2po4^-和hpo4^2-)可被植物直接吸收和利用(hinsinger2001)，导致土壤中的高磷肥，但植物磷利用效率低。固定在土壤中的难溶性磷肥被雨水冲洗进入河流，导致水体富营养化。因此，提高磷效率是解决粮食生产和水体富营养化的有效和可持续发展方法之一。

大豆gmnla1是e3泛素连接酶。迄今为止，在拟南芥和水稻突变体中仅鉴定了属于spx-ring家族的一个e3泛素连接酶基因，即氮限制适应(nla)。发现拟南芥nla突变体在低氮条件下表现出过早衰老，是由于p中毒(kantetal.2011)。在正常p条件下，nla突变体的地上部和根中的p含量是wt的两倍(linetal.2013；parketal.2014)。并且在水稻中还鉴定到同源基因osnla1，水稻osnla1突变体中叶片p含量显著增加，并且不依赖于氮(yueetal.2017)。而在大豆中没有gmnla1基因功能的相关报道。利用基因工程技术，分别构建了过表达和rna干扰载体，转化大豆毛状根后发现gmnla1会负调控大豆毛状根中磷浓度。这些结果将有助于理解大豆磷效率的分子机制，同时可以加快大豆磷高效品种的育种进程。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开大豆gmnla1是e3泛素连接酶的抗逆性基因工程应用，该基因可作为目的基因导入大豆毛状根中，通过影响大豆毛状根中磷浓度来调控大豆的磷利用效率。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

大豆e3泛素连接酶gmnla1，其核苷酸序列为：seqidno.1。

大豆e3泛素连接酶gmnla1，其氨基酸序列为：seqidno.2。

大豆e3泛素连接酶基因gmnla1在调节大豆的磷利用效率中的应用，所述的大豆e3泛素连接酶基因gmnla1，其核苷酸序列为：seqidno.1。

所述的应用优选，在大豆毛状根中过表达gmnla1降低过表达毛状根中磷浓度；或者在大豆毛状根中利用rna干扰技术沉默gmnla1，提高干扰毛状根中磷浓度。

使用gmnla1构建植物过表达载体或干扰载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如在植物中加入选择性标记基因(gus基因、荧光素酶基因等)。从转基因植物的安全性角度考虑，可不加任何选择性标记基因，而通过逆境筛选转化植株。

本发明所述的大豆gmnla1蛋白编码基因gmnla1在通过基因工程转化大豆毛状根后，过表达该基因，降低毛状根中磷浓度；rna介导的基因干扰抑制基因表达后，增加毛状根中磷浓度。

携带有本发明gmnla1的植物过表达载体和干扰载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、dna直接转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是高粱、水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是花生、大豆、油菜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

有益效果

大豆gmnla1是一个编码e3泛素连接酶的基因，包含spx和ringdomain，属于spx-ring家族基因。spx-ring家族在拟南芥和水稻等模式作物中仅有nla和pho2被报道参与植物磷稳态。在大豆中我们发现gmnla1的表达量与大豆毛状根中磷浓度呈负相关。gmnla1在磷高效和磷敏感材料中表达量存在显著差异。同时通过对gmnla1基因过表达和rna干扰发现gmnla1通过影响大豆毛状根中的磷浓度来影响大豆中磷利用效率。因此，gmnla1可以用于大豆磷高效品种选育。

附图说明

图1gmnla1基因的pcr扩增。marker：dl5000

图2gmnla1在科丰1号和南农1138-2中的相对表达量。

图3gmnla1的亚细胞定位。

(a)：gfp；(d)：gmnla1-gfp；(b)：gfp明场图；(e)：gmnla1-gfp明场图；(c)：gfp融合图；(f)：gmnla1-gfp融合图。bars＝70μm.

图4.gmnla1的毛状根表型及鲜重。

(a)gmnla1-oe转基因毛状根的表型及其空载对照control1在0.5mmkh2po4营养液中生长15d。(b)gmnla1-rnai转基因毛状根的表型及其空载对照control2在0.5mmkh2po4营养液中生长15d。(c)gmnla1-oe和gmnla1-rnai转基因毛状根的鲜重和其对照(control1/control2)在0.5mmkh2po4营养液中生长15天。

图5.gmnla1的相对表达量及大豆毛状根中磷浓度。

(a)gmnla1-oe和gmnla1-rnai转基因毛状根中gmnla1的相对表达量。(b)gmnla1-oe和gmnla1-rnai转基因毛状根及其非转基因地上部中的p浓度。gmnla1-oe：具有pmdc83-gmnla1的大豆毛状根，control1：具有pmdc83空载的大豆毛状根；gmnla1-rnai：具有pb7gwiwg2(ii)-gmnla1rnai的大豆毛状根，control2：具有pb7gwiwg2(ii)空载的大豆毛状根。gmnla1-oe和gmnla1-rnai毛状根及其对照在0.5mmkh2po4中生长15天。三个生物学平均值±标准误差(se)。*和**分别在0.05和0.01概率水平上显著。

图6.过表达毛状根(gmnla1-oe)pcr检测。m：markerdl2000，p：阳性质粒，h：ddh2o，c：阴性毛状根。

图7.rna干扰毛状根(gmnla1-rnai)pcr检测。m：markerdl1000，p：阳性质粒，h：ddh2o，c：阴性毛状根。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

1)大豆e3泛素连接酶gmnla1基因的克隆

以大豆栽培品种南农1138-2为取材对象，取其根，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mlep管，充分振荡后，移至1.5mlep管中，抽提总rna(totalrnakit(天根，北京，中国)。用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，分光光度计测定rna含量。以获得的总rna为模板，按照日本takara公司提供的反转录试剂盒(takaraprimerscript^tmrtreagentkit，日本)的说明书进行反转录，得到cdna第一链后，进行pcr扩增，pcr程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃保温5min，随后12℃恒温。随后进行pcr产物割胶纯化、连接及转化工作，挑取阳性单克隆测序。测序后获得具有完整编码区的长度为948bp的大豆gmnla1基因的cds序列，其中编码区序列见seqidno.1，命名为gmnla1，由948bp组成(图

1)。

2)gmnla1的亚细胞定位研究

设计包含gmnla1基因完整orf的引物(不包含终止密码子)，引物序列见seqidno.9和seqidno.10，具体的pcr过程与步骤1)相同。然后利用xbai和kpni双酶切将不包含终止密码子的gmnla1基因完整的orf同源重组到表达载体psuper1300中，这样就把gmnla1基因完整的orf与表达载体psuper1300上的报告基因gfp的3’端融合，形成一个35s-gmnla1-gfp的嵌合基因，构建了亚细胞定位载体psuper1300-gmnla1。将其和空载体分别利用农杆菌转化方法将目的基因gmnla1转入烟草叶片细胞，结果表明gmnla1蛋白定位在细胞膜上(图3)。

3)gmnla1在科丰1号和南农1138-2中的相对表达量

将大豆磷敏感品种(南农1138-2)和耐低磷品种(科丰1号)两种材料幼苗在含有0.5mmkh2po4的1/2hoagland营养液中处理3d，7d和12d取样，液氮速冻后于-80℃保存。总rna的提取同步骤1)。以大豆组成型表达的tubulin作为内部参照，引物序列见seqidno.7和seqidno.8，以来自栽培大豆磷敏感品种(南农1138-2)和耐低磷品种(科丰1号)两种材料不同处理条件下的地下部总rna为模板，反转为cdna之后进行实时荧光定量pcr反应(real-timert-pcr)，引物序列见seqidno.5和seqidno.6，检测gmnla1基因在不同品种中表达量变化。

当转移到1/2hoagland营养液中3d，7d和12d时，gmnla1的相对表达量在不同p效率的南农1138-2和科丰1号中具有显著差异(图2)。在科丰1号中gmnla1的相对表达量显著低于南农1138-2。这表明gmnla1的表达量与不同品种磷效率相关。

实施例2基因gmnla1的基因工程应用

1)大豆e3泛素连接酶gmnla1的克隆

以大豆(glycinemax)磷敏感品种南农1138-2的根总rna为模板，经反转录合成cdna第一链后，进行pcr扩增，引物序列见seqidno.3和seqidno.4，pcr程序如下：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃保温5分钟，随后12℃恒温，将pcr产物克隆至puc19-tvector，测序后获得具有完整编码区的长度为948bp的大豆gmnla1基因的cds序列，其中编码区序列见seqidno.1。

2)植物表达载体的构建

将gmnla1基因序列与invitrogen公司的technologywithclonase^tmii试剂盒中的pdonr221载体进行bp反应，并进行菌液pcr测序验证，引物序列见seqidno.11和seqidno.12，具体的pcr过程与步骤1)相同，获得入门克隆；将得到的入门克隆与invitrogen公司开发的目的表达载体pmdc83进行重组交换，得到pmdc83-gmnla1植物过表达载体，植物转化载体pmdc83含有2x35s强启动子，可强烈诱导目的基因gmnla1在受体中表达。然后通过冻融法将载体转入发根农杆菌菌株k599中，同时将空载pmdc83也转化到k599中去，作为空载对照。

构建rna干扰载体时，首先利用特异引物来扩增一段干扰片段，引物序列见seqidno.13和seqidno.14，pcr产物序列见seqidno.15，接下来的步骤与构建过表达载体一样，只是将pmdc83载体换成pb7gwiwg2(ii)载体，将构建好的载体gmnla1-rnai同样转化到k599中。同时将空载pb7gwiwg2(ii)也转化到k599中去，作为空载对照。

3)转基因根毛的获得

利用kereszt等人(2007)提出的大豆毛状根转化方法，将步骤2)获得的分别含pmdc83-gmnla1和gmnla1-rnai载体以及相应空载对照的发根农杆菌菌株k599菌液注射到7天大豆幼苗的子叶节下方，置于恒温光照培养箱中，12h光照，12h黑暗培养，并保持高湿度，2-3周后毛状根会从注射部位长出，当有5-10cm时，减掉幼苗主根，并置于1/2hoagland营养液中培养15天，获得大豆幼苗嵌合体，包括非转基因地上部和转基因毛状根。将具有过表达毛状根的嵌合体称之为gmnla1-oe，其空载对照为control1；将具有干扰毛状根的嵌合体称之为gmnla1-rnai，其空载对照为control2。为检测是否为阳性毛状根，利用特异性引物对提取的dna片段进行pcr检测。过表达毛状根检测引物序列见seqidno.16和seqidno.17，pcr阳性毛状根检测胶图见图6。rna干扰毛状根检测bar引物，是seqidno.18和seqidno.19，pcr阳性毛状根检测见图7。实时荧光定量qpcr发现在过表达毛状根(gmnla1-oe)中gmnla1基因表达量要显著高于control1的(图5a)。而在rna干扰的毛状根中(gmnla1-rnai)中gmnla1基因表达量要显著低于control2的(图5a)。

在大豆毛状根长到合适大小时，用1/2hoagland处理15d后测量gmnla1-oe和gmnla1-rnai转基因毛状根中的p浓度。结果表明，在gmnla1-oe转基因毛状根中，gmnla1-oe中p浓度是control1的0.77倍，表明gmnla1-oe转基因毛状根中的p浓度在+p条件下显著降低。但是gmnla1-oe非转基因地上部没有显著差异(图5b)。相反，gmnla1-rnai中的p浓度是转基因根control2的1.66倍，表明在+p条件下gmnla1-rnai转基因毛状根中的p浓度显著增加。与gmnla1-oe转基因毛状一样，gmnla1-rnai非转基因地上部也没有显著差异(图5b)。这些结果表明gmnla1在+p条件下负调节大豆转基因毛状根中的p浓度。

序列表

<110>南京农业大学

<120>大豆e3泛素连接酶gmnla1编码基因的应用

<160>19

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>948

<212>dna

<213>大豆(glycinemax)

<400>1

atgaagttctgcaagacctaccagcagtacatgcaaggacatggccacaacaagctccct60

tctgttggcttcaagaacctaaaaaagatcattaaaagctgcaggagagcctccactcaa120

cctacctgccctgatcattgcccagtgtgcgatgggacctttttcccttcccttctcaat180

gaaatgtcagatatagtagggtgctttaatcagcgcgcgcagcaattgctggaactacat240

cttgcttctggcttcagaaagtactttctcatgttgaaaggaaaattacacaagaatcat300

actgctctaatcgaagaaggaaaagatctagtcatatatgcactcataaattccatcgca360

attcgaaaaatcttgaagaaatatgataagattcattattccaagcaaggccaattattc420

aagtcgaaagtccagaccatgcacaaggaaattcttcaaagtccctggctttgtgagctt480

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<213>大豆(glycinemax)

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