本发明属于生物工程技术领域,尤其涉及转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法。
背景技术:
在缺血相关疾病(如缺血性卒中)基因治疗的过程中,作为一种外源基因,如果治疗基因不加以调控,过表达的话可能会引起不良副作用,如肿瘤、癫痫等。在缺血相关疾病发生的病理生理过程中存在局部缺血/低氧微环境,针对这一特点,我们可以利用缺血/低氧靶向调控系统来实现对治疗基因表达的缺血/低氧靶向调控,使其在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达,而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调,进而在实现有效的治疗的同时,避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。
基因表达是指细胞在生命过程中,把储存在dna顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。因此我们可以从转录前、转录后、翻译后水平对基因的表达进行缺血/低氧靶向调控,如图1所示。
在转录水平的调控主要是通过其中低氧诱导因子-1(hypoxiainduciblefactor-1,hif-1)和低氧反应元件(hypoxiaresponsiveelement,hre)低氧特异性结合后启动下游基因转录的机制来实现的。在常氧条件下,hif-1α表达水平较低,而且极不稳定,迅速被降解;但在低氧/低氧环境下,hif-1α表达水平上调、稳定性增强,与hif-1β形成二聚体后,结合于相关基因的hre,启动下游基因的转录。在我们前期的研究中已经通过5个拷贝的hre在转录水平实现了对治疗基因nt-3的缺血/低氧靶向调控表达,但是在常氧条件下5hre还是会启动下游基因的表达,尽管表达量很少。这就需要联合转录后和翻译后水平的低氧靶向调控,以降低或者消除转录水平低氧靶向调控遗漏的基因表达。
在转录后水平可以通过低氧相关基因5'-端或3'-端一段非翻译区(untranslatedregions,utr)控制mrna的稳定性来调节基因的转录后水平(图1)。在常氧条件下含有epo3'-的utr的mrna的不稳定,迅速被降解;而在低氧条件下epo3'-端utr可以增强mrna的稳定性,进而使相关基因表达增多。
在翻译后水平主要通过针对蛋白的稳定性来进行调节,在此过程中hif-1α中部的氧依赖的降解(oxygen-dependentdegradation,odd)结构域起着重要作用(图1)。在低氧条件下,在常氧条件下,含有odd结构域的融合蛋白稳定性差,会迅速被降解;而在低氧条件下,含有odd结构域的融合蛋白的稳定性增强,进而使其维持在一定的表达水平。因此,在低氧靶向性调控表达过程中,utr和odd结构域可以降低或消除转录水平低氧靶向调控遗漏的蛋白表达,可以进一步增强对治疗基因的低氧靶向调控。
技术实现要素:
本发明的目的是提供转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法,以解决在转录、转录后和翻译后多水平调控低氧调控基因的表达问题。
本发明采用以下技术方案:转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因,其核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示。
转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因的用途,用于低氧靶向调控治疗基因的表达。
一种转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法,由以下步骤组成:
用低氧调控基因构建重组质粒;
将低氧调控基因通过重组质粒转入真核细胞中;
控制环境中氧气含量,使得环境中氧气含量在小于1.5%,低氧调控基因开始调控治疗基因的表达。
进一步地,重组质粒为plncx载体重组质粒。
进一步地,在获得有人odd基因的重组质粒时,将连接反应体系转化至大肠杆菌jm109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人odd基因的重组质粒pt-odd。
进一步地,在获得有人utr基因的重组质粒时,将连接反应体系转化至大肠杆菌jm109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人utr基因的重组质粒pt-utr。
进一步地,环境中氧气含量在为0.3%。
本发明的有益效果是:本发明可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达,而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调,进而在实现有效的治疗的同时,避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。
【附图说明】
图1为本发明的基因表达的转录、转录后和翻译后低氧靶向调节示意图;
图2为本发明中质粒pt-nt3的酶切和pcr鉴定结果;
图3为本发明中质粒pt-utr的酶切和pcr鉴定结果;
图4为本发明实施例1反转录pcr和westernblot分别检测nt-3mrna和蛋白的表达情况。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了转录、转录后和翻译后水平低氧调控基因,其核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示。
seqidno:1:
ggtaccccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctttgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatcgctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttacgcgtcggtgatgtccatcttgttttatgtgatatttctcgcttatctccgtggcatccaaggtaacaacatggatcaaaggagtttgccagaagactcgctcaattccctcattattaagctgatccaggcagatattttgaaaaacaagctctccaagcagatggtggacgttaaggaaaattaccagagcaccctgcccaaagctgaggctccccgagagccggagcggggagggcccgccaagtcagcattccagccggtgattgcaatggacaccgaactgctgcgacaacagagacgctacaactcaccgcgggtcctgctgagcgacagcacccccttggagcccccgcccttgtatctcatggaggattacgtgggcagccccgtggtggcgaacagaacatcacggcggaaacggtacgcggagcataagagtcaccgaggggagtactcggtatgtgacagtgagagtctgtgggtgaccgacaagtcatcggccatcgacattcggggacaccaggtcacggtgctgggggagatcaaaacgggcaactctcccgtcaaacaatatttttatgaaacgcgatgtaaggaagccaggccggtcaaaaacggttgcaggggtattgatgataaacactggaactctcagtgcaaaacatcccaaacctacgtccgagcactgacttcagagaacaataaactcgtgggctggcggtggatacggatagacacgtcctgtgtgtgtgccttgtcgagaaaaatcggaagaacagctagccccagccgctggagacacaatcatatctttagattttggcagcaacgacacagaaactgatgaccagcaacttgaggaagtaccattatataatgatgtaatgctcccctcacccaacgaaaaattacagaatataaatttggcaatgtctccattacccaccgctgaaacgccaaagccacttcgaagtagtgctgaccctgcactcaatcaagaagttgcattaaaattagaaccaaatccagagtcactggaactttcttttaccatgccccagattcaggatcagacacctagtccttccgatggaagcactagacaaagttcacctgagcctaatagtcccagtgaatattgtttttatgtggatagtgatatggtcaatgaattcaagttggaattggtagaaaaactttttgctgaagacacagaagcaaagaacccattttctactcaggacacagatttagacttggagatgttagctccctatatcccaatggatgatgacttccagttacgttccttcgatcagttgtcaccattagaaagcagttccgcaagccctgaaagcgcaagtcctcaaagcacagttacagtattccagtgactcgagccaggtgtgtccacctgggcatatccaccacctccctcaccaacattgcttgtgccacaccctcccccgccactcctgaaccccgtcgaggggctctcagctcagcgccagcctgtcccatggacactccagtgccagcaatgacatctcaggggccagaggaactgtccagagagcaactctgagatctaaggatgtcacagggccaacttgagggcccagagcaggaagcattcagagagcagctttaaactcagggacagagccatgctgggaagacgcctgagctcactcggcaccctgcaaaatttgatgccaggacacgctttggaggcgatttacctgttttcgcacctaccatcagggacaggatgacctggagaacttaggtggcaagctgtgacttctccaggtctcacgggcatgggcactcccttggtggcaagagcccccttgacaccggggtggtgggaaccatgaagacaggatgggggctggcctctggctctcatggggtccaagttttgtgtattcttcaacctcattgacaagaactgaaaccaccaatatgactcttggcttttctgttttctgggaacctccaaatcccctggctctgtcccactcctggcagcagtgcagcaggtccaggtccgggaaatgaggggtggagggggctgggccctacgtgctgtctcacacagcctgtctgacctctcgacctaccggcctaggccacaagctctgcctacgctggtcaataaggtgtctccattcaaggcctcaccgcagtaaggcagctgccaaccctgcccagggcaaggctgcagtctagagc
本发明公开的转录、转录后和翻译后水平低氧调控基因用于低氧靶向调控治疗基因的表达。
本发明还公开了一种采用转录、转录后和翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法,由以下步骤组成:
用所述低氧调控基因构建重组质粒;
将低氧调控基因通过重组质粒转入真核细胞中;
控制环境中氧气含量,使得环境中氧气含量在小于1.5%,所述低氧调控基因开始调控治疗基因的表达。
实施例1
载体质粒的构建方法如下:
步骤1:5hre-sv40mp基因的克隆和鉴定
hre为人来源血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)中一段序列:ccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctt,5个拷贝hre,即5hre则为175bp:
ccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctt-ccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctt-ccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctt-ccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctt-ccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctt-
sv40minimalpromoter,203bp
5hre-sv40mp
在5hre前方和sv40mp后方分别插入酶切位点kpni、mlui,序列为
将5hre-sv40mp连接于pmd18-t载体,将连接反应体系转化至大肠杆菌jm109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有5hre-sv40mp基因的重组质粒pt-5hre-sv40m。利用对5hre-sv40mp基因的pcr扩增和kpni/mlui的双酶切对重组质粒pt-5hre-sv40mp进行初步鉴定,再筛选出可能的阳性克隆进行测序鉴定,进而筛选出含有完全正确序列的5hre-sv40mp基因的克隆。
步骤2:人nt-3基因的克隆和鉴定
用chelex-100从人外周血中抽提人基因组dna作为模板,根据genebank中人nt-3序列(nm_002527)设计nt-3上、下游引物,在上、下游引物中分别插入酶切位点mlui、nhei,扩增nt-3全长序列,序列如下:
forwardprimer:5'ggcgacgcgtcggtgatgtccatcttc3'
reverseprimer:5'gcggctagctgttcttccgatttttc3'
进行pcr扩增反应后,用凝胶回收试剂盒,将nt-3片段回收、纯化、连接于pmd18-t载体,将连接反应体系转化至大肠杆菌jm109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人nt-3基因的重组质粒pt-nt3。
利用对nt-3基因的pcr扩增和mlui/nhe的双酶切对重组质粒pt-nt3进行初步鉴定,再筛选出可能的阳性克隆进行测序鉴定,进而筛选出含有完全正确序列的人nt-3基因的克隆,如图2所示,lane1:dnamarkerdl2000,lane2:质粒pt-nt3,lane3:hindiii/hpai双酶切,lane4:pt-nt3为模板进行nt-3pcr扩增产物。
其中,nt-3信息如下:
homosapiensneurotrophin3,genbank:bc069773.1
cds84..857=774bp
治疗基因nt-3表达后的信息如下:
neurotrophin3(人源)
长度:257aa,genbank:aah69773.1。
氨基酸序列:
由于nt-3序列后方有一段odd来调控,所以nt-3的终止密码子(tga)取消,置于odd的后方。
步骤3:人来源hif-1αodd基因的克隆和鉴定
用trizol抽提法,从hek293细胞中抽提的总rna进行反转录pcr后,获得cdna作为模板,根据genebank中人hif-1α的序列(af208487.1)设计odd片段上、下游引物(在上、下游引物中分别插入酶切位点nhei、xhoi,扩增odd(片段1211-1819)序列,序列如下:
forwardprimer:5'gcgctagcgcccagccgctggagac3'
reverseprimer:5'gcctcgagtcactggaatactgtaac3'
进行pcr扩增反应后,用凝胶回收试剂盒,将odd片段回收、纯化、连接于pmd18-t载体,将连接反应体系转化至大肠杆菌jm109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人odd基因的重组质粒pt-odd。
利用对odd基因的pcr扩增和nhei/xhoi的双酶切对重组质粒pt-odd进行初步鉴定,再筛选出可能的阳性克隆进行测序鉴定,进而筛选出含有完全正确序列的人odd基因的克隆。
其中,odd信息如下:
人来源hif-1α,genbank:af208487.1,odd:1211-1819
由于odd为nt-3序列后方的一段调控序列,所以nt-3的终止密码子取消,置于odd的后方,终止密码子为tga。
步骤4:重组载体质粒pgl3-5hre-sv40-nt3-odd的构建
将pt-odd和pgl3-5hre-sv40-nt3分别进行nhei/xhoi双酶切反应,并回收酶切产物,再用t4dna连接酶将odd片段插入pgl3-5hre-sv40-nt30中,获得重组载体质粒pgl3-5hre-sv40-nt3-odd通过pcr、酶切和测序鉴定。
步骤5:人来源促红细胞生成素(erythropoietin,epo)3’-端utr基因的克隆和鉴定
用trizol抽提法,从hepg2细胞中抽提的总rna进行反转录pcr后,获得cdna作为模板,根据genebank中人utr序列(m11319)设计utr片段2773-3602上、下游引物(在上、下游引物中分别插入酶切位点xhoi、bglii,扩增utr(片段2773-3602)序列,序列如下:
forwardprimer:5'gcctcgagggaggtgtgtccacctgg3'
reverseprimer:5'gcagatctctgcagccttgccctgggc3'
进行pcr扩增反应后,用凝胶回收试剂盒,将utr片段回收、纯化、连接于pmd18-t载体,将连接反应体系转化至大肠杆菌jm109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人utr基因的重组质粒pt-utr。
利用对utr基因的pcr扩增和xhoi/bglii的双酶切对重组质粒pt-utr进行初步鉴定,再筛选出可能的阳性克隆进行测序鉴定,进而筛选出含有完全正确序列的人utr基因的克隆。
其中,utr信息如下:
人来源epo3’-端utr,genebank:m11319,片段2773-3602
此段序列为调控整条mrna的片段,所以要置于前方需要转录的mrna的后方,如图3所示,lane1:质粒pt-utr,lane2:hpai/clai双酶切,lane3:pt-utr为模板进行utrpcr扩增产物,lane4:dnamarkerdl2000。
步骤6:重组载体质粒pgl3-5hre-sv40-nt3-odd-utr的构建
将pt-utr和pgl3-5hre-sv40-nt3-odd分别进行xhoi/bglii双酶切反应,并回收酶切产物,再用t4dna连接酶将utr片段插入pgl3-5hre-sv40-nt3-odd中,获得重组载体质粒pgl3-5hre-sv40-nt3-odd-utr,通过pcr、酶切和测序鉴定。
将各质粒用脂质体lipofectamine2000转染入pc12细胞中,分别获得pc12-nt3和pc12-5hre-nt3-odd-utr,然后在缺氧条件下处理。将培养瓶置于已经预工作的厌氧工作站(bugbox)中,37℃孵育相应时间点24h后取出进行下一步实验。
厌氧工作站中气体含量分别为:5%co2,0.3%o2和94.7%n2,在孵育期间用氧气检测仪(cy-100b)持续监测氧气含量,使其维持在0.3%水平。
结果:
反转录pcr和westernblot分别检测nt-3mrna和蛋白的表达情况,如图4所示,反转录pcr(a)和westernblot法(b)检测pc12-nt3(lane1)和pc12-5hre-nt3-odd-utr(lane2)细胞中nt-3的mrna和蛋白表达情况。
反转录pcr结果显示,在常氧条件下,pc12-5hre-nt3-utr-odd中nt-3的mrna表达水平明显低于pc12-nt3组,有显著性差异(p<0.05);在缺氧条件下,pc12-5hre-nt3-utr-odd中nt-3的mrna表达水平明显升高,且与常氧条件下相比,有显著性差异(p<0.05)。westernblot结果显示,在常氧条件下,pc12-5hre-nt3-utr-odd组中nt-3蛋白表达量明显低于pc12-nt3组,有显著性差异(p<0.05);而且在pc12-5hre-nt3-utr-odd组中,与常氧条件下相比较,在缺氧条件下细胞内中nt-3mrna表达量明显升高,有显著性差异(p<0.05);但在pc12-nt3组中,与常氧条件下相比较,在缺氧后缺氧条件下细胞内nt-3蛋白表达量无显著性差异变化。
序列表
<110>西安医学院
<120>转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2626
<212>dna
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
ggtaccccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggc60
tccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgc120
atacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctct180
ttgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgccccta240
actccgcccagttccgcccattctccgccccatcgctgactaattttttttatttatgca300
gaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttgga360
ggcctaggcttttgcaaaaagcttacgcgtcggtgatgtccatcttgttttatgtgatat420
ttctcgcttatctccgtggcatccaaggtaacaacatggatcaaaggagtttgccagaag480
actcgctcaattccctcattattaagctgatccaggcagatattttgaaaaacaagctct540
ccaagcagatggtggacgttaaggaaaattaccagagcaccctgcccaaagctgaggctc600
cccgagagccggagcggggagggcccgccaagtcagcattccagccggtgattgcaatgg660
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tggcgaacagaacatcacggcggaaacggtacgcggagcataagagtcaccgaggggagt840
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acctgggcatatccaccacctccctcaccaacattgcttgtgccacaccctcccccgcca1860
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ggctggcctctggctctcatggggtccaagttttgtgtattcttcaacctcattgacaag2340
aactgaaaccaccaatatgactcttggcttttctgttttctgggaacctccaaatcccct2400
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aggccacaagctctgcctacgctggtcaataaggtgtctccattcaaggcctcaccgcag2580
taaggcagctgccaaccctgcccagggcaaggctgcagtctagagc2626