利用生物传感器检测水中四环素类抗生素的试纸条及方法与流程

本发明属于生物分析检测技术领域，具体是涉及利用生物传感器检测水中四环素类抗生素的试纸条及方法。

背景技术：

随着工业化程度的升高以及各类化工产品污染水体事件的突发，各种化学物质数量猛增，给人类生存环境造成很大影响，迫切需要对日益增多的环境污染物进行急性毒性鉴定。

四环素类药物(Tetracyclines,TCs)具有广谱高效的杀菌抗生功效，可作为预防和治疗鱼类疾病的用药或作为促进鱼类生长的饲料添加剂而广泛被应用。由于TCs能抑制大多数革兰氏阳性菌和阴性菌，性质稳定、价格低廉、使用方便，常以亚治疗浓度的药物作为饲料添加剂来预防疾病的发生，提高饲料的转化率，促进鱼类生长。但长期用药所产生的不良反应、在畜禽产品中的残留、耐药性的增加以及在环境中的生态效应等己引起国内外的广泛关注。美国FDA明确规定四环素、土霉素、金霉素在动物肌肉组织中残留总量不超过2μg/kg。传统的化学分析方法能准确定量分析污染物中主要成分的含量，如微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、高效毛细管电泳法(HPCE)、放射免疫法和荧光光度法等。但不能直接而又及时地反映各种有毒物质对环境和生物的综合影响。传统的动物毒性实验以哺乳类、鱼类等为受试对象，虽然能反映毒物对生物的直接影响，但方法繁琐，实验周期长，不满足水质急性毒性检测的需求。针对传统毒性检测方法的不足，目前国内外研究者建立了各种各样的生物实验方法，包括微生物、藻、底栖软体动物、浮游生物、鱼等，用来监测环境污染物对水生生物的毒性，其中细菌生物传感器因其独特的生理特性，与现代光电检测手段完美匹配的特点而倍受关注。

试纸以其独特的检测成本低、操作简单等特点在各个领域中应用广泛，例如:实验室所用的pH试纸、淀粉碘化钾试纸；工业所用的温度热敏试纸、废水检测试纸；生活所用的血糖试纸等。由于制作试纸的材料和方法不同，试纸的检测领域和检测灵敏度也不同。目前，尚未发现利用全细胞生物传感器制备试纸条检测水中四环素类抗生素的方法。

技术实现要素：

本发明旨在填补应用全细胞生物传感器制备试纸条检测水中四环素类抗生素的空白，提供一种利用全细胞生物传感器检测水中四环素类抗生素的试纸条及检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用生物传感器检测水中四环素类抗生素的试纸条，包括：滤纸条、固定液、敏化剂以及四环素生物传感器细菌菌剂；所述四环素生物传感器细菌菌剂为Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株；所述固定液和敏化剂包裹Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株固定负载在所述滤纸条上。

进一步地，在上述方案中，所述Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株的制备方法为：

(1)利用引物聚合酶链反应(PCR)从质粒pMTmCherry中克隆到Staphylococcus rostri RST11:Tn916和转座子Tn10上的四环素介导调控系统的pMT片段(5256bp)的基因序列，退火温度为55℃；所用质粒如表1所示。

所述pMT引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示，

SEQ ID No.1：TCGTGCCAGCTGCATTAAT

SEQ ID No.2：TTCACTTTTCTCTATCACTGATAGG；

表1所使用菌种和质粒

(2)将利用引物聚合酶链反应(PCR)从pCU19质粒上克隆LacZ(368bp)报告基因片段的基因序列，退火温度为65℃；质粒pMTmCherry中克隆到T7片段(220bp)的基因序列，退火温度为60℃；从并结合融合LacZ和T7终止子序列得到LacZ-T7融合片段(568bp)，需在设计引物时，添加同源片段；

所述LacZ引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示，

SEQ ID No.3：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGACCATGATTACGCCAAGC

SEQ ID No.4：GTGGCAGCAGCCTAGGTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG；

所述T7引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，

SEQ ID No.5：TTAACCTAGGCTGCTGCC

SEQ ID No.6：TCATTAATGCAGCTGGCACGATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC；

融合LacZ-T7所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，

SEQ ID No.7：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA

SEQ ID No.8：TCATTAATGCAGCTGGCAC；

(3)将所述的LacZ-T7和pMT通过同源重组酶连接，将基因片段添加到PCR管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部。载体用10-100ng。载体与插入片段的摩尔比1:1～1:10。多片段连接时，各片段的摩尔比为1:1。

pmols＝(质量ng×1000)/(片段长度bp×650daltons)；

混合液在50℃反应15min。对于多片段克隆可延长反应时间，但总长不要超过60min。

取100μL冰浴上融化的Escherichia coli BL21感受态细抱，加入目的DNA(质粒或使用；连接产物)，轻轻混匀，冰上静置25min。42℃水浴热激30-45s,迅速转移至冰浴中，静置2min。向离心管中加入500μL不含抗生素的无茵LB培养基，混匀后37℃,200rpm复苏1h。吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含Amp抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；

(4)在培养基上挑点，使用无菌的10μL移液枪头在含氨苄青霉素抗生素的LB培养基和含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上长出蓝色斑点的菌株，使用引物PCR鉴定重组后的质粒，退火温度为53℃；验证质粒的核心片段为3590bp。

鉴定所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，

SEQ ID No.9：ACTGTCAATTTGATAGCGGG

SEQ ID No.10：ATTAATGCAGCTGGCACGA；

并测序验证所得含重组质粒菌种Escherichia coli BL21/pMTLacZ。

进一步地，在上述方案中，所述固定液为10％乳糖。

进一步地，在上述方案中，所述敏化剂为PMB的1/4LB培养基。

本发明还提供了上述试纸条的制备方法：

(a)准备滤纸条基底，裁剪成需要的尺寸；优选大小为l cm×4cm；

(b)将Escherichia coli BL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基按比例混合；

(c)将Escherichia coli BL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基的混合物滴加于试纸基底上；

(d)将试纸置于冷冻干燥机固定。

进一步地，所述Escherichia coli BL21/pMTLacZ细菌和10％乳糖和PMB的1/4LB培养基混合物的用量比例范围为：3～4mg菌粉对应100μL 10％乳糖和PMB的1/4LB培养基混合。

进一步地，所述在冷冻干燥机固定时间为4h。

本发明还提提供了一种上述试纸条检测水中四环素类抗生素的方法：

将待测100μL水样品和900μL LB培养基混合液进行复苏，(约13-18min)复苏完毕后，投入所述试纸，检测试纸上的蓝色强度。

进一步地，根据初始显色和1.5h后的颜色强度，对比得出颜色强度，从而实现对该水体中六种四环素类抗生素的检测。

进一步地，可选择

来检测使用相机获取显色照片，传入电脑上用ImageJ软件处理获得蓝色颜色强度。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明的pMTLacZ质粒为发明人自主设计的可受多种四环素类抗生素诱导标的合成质粒，pMTLacZ质粒可在不同浓度的四环素的诱导下产生不同量的β半乳糖苷酶，可降解试纸条上固定的X-gal显色剂，直观显示样品中四环素类抗生素的浓度。

(2)本发明的试纸条能够同时有效检测水体中六种四环素类抗生素(四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、米诺环素和甲烯土霉素)的含量且并不引入任何有机化学试剂。

(3)本发明的检测方法简便、快速、直观、准确、便于携带、环保、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1是基因片段的凝胶电泳图；其中，图a为重组质粒所用基因片段，图b为重组质粒验证片段；

图2是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌显色原理和效果；其中，图a为重组质粒显色原理，图b为x-gal化学反应，图c为显色结果图；

图3是pMTLacZ质粒基因图谱；

图4是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸制备流程；

图5是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸测试六种四环素类抗生素色卡；

图6是Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸测试水体中六种四环素类抗生素。

图7是本发明的检测方法流程图。

具体实施方式

1、Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌株的制备：

(1)利用引物聚合酶链反应(PCR)从质粒pMTmCherry中克隆到Staphylococcus rostri RST11:Tn916和转座子Tn10上的四环素介导调控系统的pMT片段(5256bp)的基因序列，退火温度为55℃(图1)。所用质粒如表1所示。

所述pMT引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示，

SEQ ID No.1：TCGTGCCAGCTGCATTAAT

SEQ ID No.2：TTCACTTTTCTCTATCACTGATAGG；

表1所使用菌种和质粒

(2)将利用引物聚合酶链反应(PCR)从pCU19质粒上克隆LacZ(368bp)报告基因片段的基因序列，退火温度为65℃；质粒pMTmCherry中克隆到T7片段(220bp)的基因序列，退火温度为60℃；从并结合融合LacZ和T7终止子序列得到LacZ-T7融合片段(568bp)，需在设计引物时，添加同源片段(图1)。

所述LacZ引物的正向引物序列和反向引物序列如SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示，

SEQ ID No.3：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGACCATGATTACGCCAAGC

SEQ ID No.4：GTGGCAGCAGCCTAGGTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG；

所述T7引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，

SEQ ID No.5：TTAACCTAGGCTGCTGCC

SEQ ID No.6：TCATTAATGCAGCTGGCACGATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC；

融合LacZ-T7所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，

SEQ ID No.7：CTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA

SEQ ID No.8：TCATTAATGCAGCTGGCAC；

(3)将所述的LacZ-T7和pMT通过同源重组酶连接，将基因片段添加到PCR管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部。载体用10-100ng。载体与插入片段的摩尔比1:1～1:10。多片段连接时，各片段的摩尔比为1:1。

pmols＝(质量ng×1000)/(片段长度bp×650daltons)；

混合液在50℃反应15min。对于多片段克隆可延长反应时间，但总长不要超过60min。

取100μL冰浴上融化的Escherichia coli BL21感受态细抱，加入目的DNA(质粒或使用；连接产物)，轻轻混匀，冰上静置25min。42℃水浴热激30-45s,迅速转移至冰浴中，静置2min。向离心管中加入500μL不含抗生素的无茵LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h。吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含Amp抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

(4)在培养基上挑点，使用无菌的10μL移液枪头在含氨苄青霉素抗生素的LB培养基和含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含氨苄青霉素、20mg/L X-gal和四环素抗生素的LB培养基上长出蓝色斑点的菌株(图2)，使用引物PCR鉴定重组后的质粒，退火温度为53℃；验证质粒的核心片段为3590bp(图1)。

鉴定所用引物的正向引物序列及反向引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，

SEQ ID No.9：ACTGTCAATTTGATAGCGGG

SEQ ID No.10：ATTAATGCAGCTGGCACGA；

并测序验证所得含重组质粒菌种Escherichia coli BL21/pMTLacZ。pMTLacZ质粒图谱如图3所示。

2、试纸的制备：

将上述菌种Escherichia coli BL21/pMTLacZ接种于含100mg/L氨苄青霉素抗生素的LB培养基，生物传感器细胞在37℃LB培养基中培养约4-5h，150r/min剧烈振荡，OD600nm为0.450-0.500。以4000g离心10min收集细菌细胞，加入到10％乳糖和PMB的1/4LB培养基中复苏。生物传感器细胞悬液(50μL)被滴加在纸滤纸条(1cm×4cm)，在室温下风干10min，随后冷冻干燥。纸带保存于-20℃备用(图4)。

3、四环素比色卡制备：

需要进行水质六种四环素检测时，需要四环素比色卡，将固定有生物传感器细菌的试纸放入不同浓度的四环素溶液测试，使用相机获取显色照片，传入电脑上用ImageJ软件处理得到显色强度(图5)。

4、四环素检测：

将复苏后的Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸放入待测水样中，反应150min立即读取发光量，然后滴加X-gal等待1.5h，待生物传感器与水中四环素类抗生素物质反应完毕，再次读取显色，然后根据构建的四环素比色卡的色度计算，从而评估出该水样的四环素的含量(图7)。为了佐证该新型试纸的准确性和可靠性，我们利用两种池塘水(表2)分别配制250μg/L土霉素和100μg/L强力霉素，分别进行了Escherichia coli BL21/pMTLacZ菌试纸测试。结果证明该测试试纸结果为稳定且具重现性。因此可以认定该方法可靠可行，具有实际应用价值(图6)。

表2池塘水理化性质

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 利用生物传感器检测水中四环素类抗生素的试纸条及方法

<130> 无

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223>根据实验要求而设计，作为pMT引物的正向引物

<400> 1

tcgtgccagc tgcattaat 19

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<223>根据实验要求而设计，作为pMT引物的反向引物

<400> 2

ttcacttttc tctatcactg atagg 25

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223>根据实验要求而设计，作为LacZ引物的正向引物

<400> 3

ctatcagtga tagagaaaag tgaaatgacc atgattacgc caagc 45

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223>根据实验要求而设计，作为LacZ引物的反向引物

<400> 4

gtggcagcag cctaggttaa ctatgcggca tcagagcag 39

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223>根据实验要求而设计，作为T7引物的正向引物

<400> 5

ttaacctagg ctgctgcc 18

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223>根据实验要求而设计，作为T7引物的反向引物

<400> 6

tcattaatgc agctggcacg atttcacaca ggaaacagct atgac 45

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223>根据实验要求而设计，作为融合LacZ-T7所用引物的正向引物

<400> 7

ctatcagtga tagagaaaag tgaa 24

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223>根据实验要求而设计，作为融合LacZ-T7所用引物的反向引物

<400> 8

tcattaatgc agctggcac 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223>根据实验要求而设计，作为鉴定所用引物的正向引物

<400> 9

actgtcaatt tgatagcggg 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223>根据实验要求而设计，作为鉴定所用引物的反向引物

<400> 10

attaatgcag ctggcacga 19