四氢吡咯烷类化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类四氢吡咯烷类化合物、其制备方法、并包含其药物制剂及其医药用途。

背景技术：

鞘磷脂是细胞膜的成分之一，其代谢产物神经酰胺(ceramide,cer)、鞘氨醇(sphingosine,sp)和鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,s1p)在调控细胞增殖、迁移及凋亡中发挥着重要作用。cer和sp能抑制细胞生长、促进细胞凋亡，s1p则促进细胞生长、抑制细胞凋亡。鞘氨醇激酶(sphingosinekinase,sphk)是调控上述物质在细胞内动态平衡的重要限速酶，也是细胞增殖及存活的重要信号分子。

目前在哺乳动物组织中发现有sphk1和sphk2两种异构体。sphk1主要存在于细胞质中，主要功能是磷酸化sp生成s1p，进而调控细胞增殖、迁移、侵染、分化及细胞的程序性凋亡等多种生物学功能，是sphk1-s1p-s1p受体(sphk1-s1p-s1prs)信号通路中重要的激酶。sphk1高表达不仅能刺激细胞生长，而且可以导致细胞恶性转化，故sphk1基因也具有癌基因的特性。sphk1在胶质瘤、结肠癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肾癌等多种癌细胞中高表达，其活性高低直接决定着癌细胞的命运。sphk1的活性受抑制会使细胞内cer和sp水平升高，s1p水平降低，进而抑制细胞生长或促进细胞凋亡，因此，sphk1是癌症治疗的理想靶标。近几年，sphk1-s1p-s1prs信号通路及其在肿瘤、自身免疫系统疾病、炎症、动脉粥样硬化、神经系统疾病等多种疾病中的作用已逐步被阐明，靶向sphk1的药物设计、开发研究也成为药物研究的热点之一。

由于癌症和炎症性疾病的发病率呈逐年升高的趋势，其病理机制非常复杂，因此，发现结构多样性的sphk1抑制剂来缓解癌症和炎症性肠病迫在眉睫。研究人员基于此研究思路发现了含四氢吡咯烷的化合物，其对sphk1具有较好的选择性及抗细胞增殖活性。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一类四氢吡咯烷类化合物及其药学上可接受的盐、其制备方法、药物组合物以及其在制备预防和/或治疗与sphk1功能异常相关的疾病中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供如通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，r为

-c16h33,-c14h29,-c12h25,

优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为

更优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为

进一步优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为更进一步优选的，上述化合物或其药学上可接受的盐，所述r为

本发明上述任一化合物药学上可接受的盐为有机酸盐或无机酸盐，其中有机酸包括乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸；无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。

本发明技术方案的第二方面是提供第一方面所述化合物的制备方法，本发明的通式(i)化合物可用下述方法制备：

r'＝-c13h27,-c11h23,-c9h19,

r＝-c16h33,-c14h29,-c12h25,

将化合物ii溶解于二氯甲烷中，于氮气保护下，加入相应烯烃，grubbs^2nd，加热回流反应7h，以tlc检测反应原料消失；反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用etoac洗脱，得化合物粗品(iii)；将化合物粗品(iii)溶解于乙腈中，于氮气保护下加入碳酸铯，苯硫酚，50℃反应3h，以tlc检测反应原料消失；反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用二氯甲烷洗脱，得化合物粗品(iv)；将化合物粗品(iv)溶解于甲醇中，加入20％氢氧化钯碳(30wt％)，10％钯碳(10wt％)，于氢气条件下反应24h，反应液用硅藻土过滤，旋干溶剂，得化合物粗品(v)；将化合物粗品(v)溶解于乙腈/水(体积比1:4)中，加入硝酸铈铵，室温反应3h，反应液直接用硅胶柱层析分离(洗脱剂为甲醇-乙醇-二氯甲烷-氨水-6:12:77:5)，得目标化合物。

化合物ii结构说明如下：

本发明技术方案的第三方面是提供包含第一方面所述化合物的药物组合物其药学上可接受的盐与一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物，为临床上或药学上可接受的任一剂型，优选为口服制剂或注射剂。其中含有生理有效量的通式(i)所示的化合物0.01g～10g，可以为0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.04g、0.05g、0.1g、0.125g、0.2g、0.25g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.75g、1g、1.25g、1.5g、1.75g、2g、2.5g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g等。

本发明任一化合物、其药学上可接受的盐，可以口服或肠胃外给药等方式施用于需要这种治疗的患者。

用于肠胃外给药时，可制成注射剂。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，可选用水性溶剂或非水性溶剂。最常用的水性溶剂为注射用水，也可用0.9％氯化钠溶液或其他适宜的水溶液；常用的非水性溶剂为植物油，主要为供注射用大豆油，其他还有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等的水溶液。配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、ph值调节剂、增溶剂、填充剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。用于口服时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。

本发明所述的化合物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、液剂、悬浮剂、针剂，可以加入香料、甜味剂、液体或固体填料或稀释剂等常用药用辅料。

本发明所述的化合物在临床上的给药方式可以采用口服、注射等方式。

本发明的化合物临床所用剂量为0.01-1000mg/天，也可根据病情的轻重或剂型的不同偏离此范围。

本发明技术方案的第四方面是提供包含第一方面所述化合物以及第三方面所述药物组合物在制备预防或治疗sphk1功能异常相关的疾病的药物中的应用。其中，所述的与sphk1功能异常相关的疾病包括癌症、炎症性疾病。所述的癌症包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺腺癌、黑色素瘤、食管癌；所述的炎症性疾病包括炎症性肠病、肝炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎或多发性硬化症。

有益技术效果：

本发明的优点在于，所述的化合物对sphk1有较强的选择性及抑制作用，该类化合物与其药用制剂可以用于治疗sphk1功能异常导致的一系列疾病，例如结肠癌、肝癌、炎症性肠病、肝炎、哮喘、发性硬化症等。此外，本发明提供的制备方法具有不需要中间体分离，反应条件温和、操作简单等特点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

将化合物ii(0.186mmol)溶解于二氯甲烷(6ml)中，于氮气保护下，加入烯烃(0.744mmol)，grubbs^2nd(0.037mmol)，加热回流反应7h，以tlc检测原料消失。反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用etoac洗脱，得化合物粗品(iii)。将所得粗品(iii)溶解于乙腈(6ml)中，于氮气保护下加入碳酸铯(0.372mmol)，苯硫酚(0.28mmol)，50℃反应3h，以tlc检测原料消失。反应液冷却至室温并通过短的短硅胶柱过滤，用二氯甲烷洗脱，得化合物粗品(iv)。将所得粗品(iv)溶解于甲醇(6ml)中，加入20％氢氧化钯碳(30wt％)，10％钯碳(10wt％)，于氢气条件下反应24h，反应液经硅藻土过滤，旋干溶剂，得化合物粗品(v)。将所得粗品(v)溶解于乙腈/水(1:4)中，加入硝酸铈铵(0.372mmol)，室温反应3h。反应液直接用硅胶柱层析分离(洗脱剂为甲醇-乙醇-二氯甲烷-氨水-6:12:77:5)，得p系列四氢吡咯烷类目标化合物，

实施例1

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-十四烷基吡咯烷-3-醇的制备(p1)的合成

将化合物ii(0.186mmol)溶解于二氯甲烷(6ml)中，于氮气保护下，加入1-十三烯(0.744mmol)，grubbs^2nd(0.037mmol)，加热回流反应7h，以tlc检测原料消失(乙酸乙酯-二氯甲烷-石油醚3:2:5)。反应液冷却至室温并通过短硅胶柱过滤，用etoac洗脱，得粗品。将所得粗品溶解于乙腈(6ml)中，于氮气保护下加入碳酸铯(0.372mmol)，苯硫酚(0.28mmol)，50℃反应3h，以tlc检测原料消失(甲醇-二氯甲烷7:93)。反应液冷却至室温并通过短的短硅胶柱过滤，用二氯甲烷洗脱，得粗品。将所得粗品溶解于甲醇(6ml)中，加入20％氢氧化钯碳(30wt％)，10％钯碳(10wt％)，于氢气条件下反应24h，反应液经硅藻土过滤，旋干溶剂，得粗品。将所得粗品溶解于乙腈/水(1:4)中，加入硝酸铈铵(0.372mmol)，室温反应3h。反应液直接用硅胶柱层析分离(洗脱剂为甲醇-乙醇-二氯甲烷-氨水-6:12:77:5)得化合物p1。白色固体，产率：25％,¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.48(t,j＝5.6hz,1h),3.29–3.43(m,2h),2.82(q,j＝5.6hz,1h),2.60(dq,j＝11.6,6.0,5.5hz,1h),1.84(brs,4h),1.54–1.63(m,1h),1.25(s,25h),0.88(t,j＝6.7hz,3h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):75.72,65.00,53.15,51.73,34.02,31.85,29.55,29.58(2c),29.62(4c),29.48,29.29,26.75,22.61,14.00.ir(kbr,cm^-1):3348,3242,2918,2850,1558,1469,1458,1377,1350,1118,1080,1028,956,908,894,869,825,719.hrms(esi):m/zcalcdforc18h38n2o(m+h)⁺:299.3062.found:299.3047.

实施例2-17中化合物p2-p17的制备方法同实施例1，区别在于使用不同的烯烃试剂合成，具体每个实施例中使用的烯烃原料在相应实施例中有记载：

实施例2

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-十二烷基吡咯烷-3-醇的制备(p2)

所用烯烃试剂为1-十一烯。产物为白色固体，产率:36％,¹hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):3.62–3.66(m,1h),3.22(q,j＝6.7hz,1h),3.17(dd,j＝11.0,6.7hz,1h),2.90(q,j＝5.8hz,1h),2.62(dd,j＝11.0,7.4hz,1h),1.58–1.65(m,1h),1.24–1.51(m,21h),0.92(t,j＝7.0hz,3h).¹³cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):75.93,64.58,53.38,50.68,33.65,31.69,29.44,29.42,29.40,29.38,29.36,39.30,29.10,26.66,22.36,13.07.ir(kbr,cm^-1):3350,3244,2920,2850,2667,2546,1641,1591,1467,1377,1352,1311,1116,1080,1029,954,906,871,823,719cm^-1；hrms(esi):m/zcalcdforc16h34n2o(m+h)⁺:271.2749.found:271.2629.

实施例3

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-十六烷基吡咯烷-3-醇(p3)

所用烯烃试剂为1-十四烯。产物为白色固体，产率：30％,¹hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):3.55–3.58(m,1h),3.15(q,j＝6.7hz,1h),3.09(dd,j＝11.2,6.7hz,1h),2.84(q,j＝6.3hz,1h),2.56(dd,j＝11.2,7.5hz,1h),1.48–1.55(m,1h),1.11–1.40(m,29h),0.80(t,j＝7.0hz,3h).¹³cnmr(cdcl3,150mhz)δ(ppm):75.66,65.09,53.01,51.91,33.98,31.90,29.59,29.63(2c),29.67(6c),29.52,29.33,26.79,22.66,14.07.ir(kbr,cm^-1):3350,3240,2956,2918,2850,1558,1469,1458,1261,1101,1083,1028,954,914,883,852,804,765,719.hrms(esi):m/zcalcdforc20h42n2o(m+h)⁺:327.3375.found:327.3231.

实施例4

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-[9-(环己基)壬基]吡咯烷-3-醇的制备(p4)

所用烯烃试剂为((辛-7-烯-1-氧基)甲基)环己烷。产物为粘稠油状，产率：29％,¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.52(t,j＝5.3hz,1h),3.36(h,j＝7.3hz,4h),3.19(d,j＝6.6hz,2h),2.82–2.90(m,1h),2.63(dd,j＝9.7,6.2hz,1h),2.41(brs,4h),1.12–1.79(m,25h),0.90(q,j＝10.9,10.1hz,2h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):76.83,75.81,71.13,65.53,53.29,53.00,38.04,34.42,30.18(2c),29.74(2c),29.55,29.51,29.48,26.90,26.69,26.17,25.90(2c).ir(kbr,cm-¹):3427(br),3248,2924,2850,2792,2665,1463,1448,1409,1375,1122,927,910,891,844,815,723.hrms(esi):m/zcalcdforc20h40n2o2(m+h)⁺:341.3168.found:341.3419.

实施例5

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-[10-(环己基)癸基]吡咯烷-3-醇的制备(p5)

所用烯烃试剂为((壬-8-烯-1-氧基)甲基)环己烷。产物为粘稠油状，产率：17％,¹hnmr(cd3od,400mhz)δ(ppm):3.63(t,j＝5.4hz,1h),3.39(t,j＝6.5hz,2h),3.12–3.24(m,4h),2.89(q,j＝5.9hz,1h),2.61(dd,j＝10.7,7.2hz,1h),1.50–1.79(m,10h),1.19–1.45(m,21h),0.94(q,j＝10.5,9.0hz,2h).¹³cnmr(cd3od,100mhz)δ(ppm):76.48,75.83,70.75,64.60,53.31,50.58,37.93,33.51,29.83(2c),29.42,29.34(2c),29.29,29.27,29.17,26.64,26.37,26.89,25.62(2c).ir(kbr,cm-¹):3338,3253,2924,2850,2792,1558,1541,1454,1373,1124,964,916,887,815,721.hrms(esi):m/zcalcdforc21h42n2o2(m+h)⁺:355.3325.found:355.3316.

实施例6

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-[11-(环己基)十一烷基]吡咯烷-3-醇的制备(p6)

所用烯烃试剂为((癸—9-烯-1-氧基)甲基)环己烷。产物为粘稠油状，产率：23％,¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.52(t,j＝5.3hz,1h),3.36(h,j＝6.7hz,4h),3.19(d,j＝6.6hz,2h),2.86(d,j＝5.2hz,1h),2.63(dd,j＝9.6,6.1hz,1h),2.31(brs,4h),1.10–1.81(m,29h),0.90(q,j＝10.9,10.1hz,2h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):76.83,75.80,71.15,65.54,53.26,52.97,38.05,34.40,30.18(2c),29.75(2c),29.59(2c),29.56,29.55,29.50,26.91,26.69,26.18,25.91(2c).ir(kbr,cm^-1):3348,3244,2922,2850,2792,1558,1541,1465,1448,1406,1375,1124,1014,954,889,821,721.hrms(esi):m/zcalcdforc22h44n2o2(m+h)⁺:369.3481.found:369.3477.

实施例7

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-(10-异丁基癸烷)吡咯烷-3-醇的制备(p7)

所用烯烃试剂为9—异丁氧基—1-烯。产物为粘稠油状,产率:26％,¹hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):3.87(t,j＝5.3hz,1h),3.52(q,j＝6.6hz,1h),3.39(dt,j＝18.7,6.7hz,3h),3.20(dd,j＝12.6,6.9hz,3h),2.93(dd,j＝11.8,7.1hz,1h),1.77–1.89(m,1h),1.69(dt,j＝15.3,7.8hz,1h),1.54(dt,j＝14.4,7.2hz,3h),1.16–1.49(m,18h),0.90(d,j＝6.7hz,6h).¹³cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):77.51,74.02,70.07,64.72,51.99,31.43,29.36,29.32,29.23,29.18,29.15,29.13,28.19,26.32,25.91,18.37(2c).ir(kbr,cm^-1):3246,3070,2927,2852,1635,1558,1521,1419,1114,1041,1008,968,945,873,831,819,721.hrms(esi):m/zcalcdforc18h38n2o2(m+h)⁺:315.3012.found:315.3000.

实施例8

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-[9-(苄基氧基)壬基]吡咯烷-3-醇的制备(p8)

所用烯烃试剂为((辛-7-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：37％,¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):7.23–7.41(m,5h),4.50(s,2h),3.48(dt,j＝21.9,6.1hz,3h),3.33(h,j＝6.9hz,2h),2.85(q,j＝5.8hz,1h),2.61(dq,j＝11.7,6.5,5.7hz,1h),2.31(brs,4h),1.06–1.68(m,16h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):138.71,128.33(2c),127.61(2c),127.45,75.84,72.85,70.53,66.51,53.30,53.06,34.47,29.77,29.74,29.53,29.50,29.46,26.90,26.18.ir(kbr,cm^-1):3346,3242,2924,2850,2659,2536,1585,1496,1454,1363,1311,1114,1074,1035,964,921,910,875,825,734,698,634,609.hrms(esi):m/zcalcdforc20h34n2o2(m+h)⁺:335.2699.found:335.2696.

实施例9

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-[10-(1-苯基乙氧基)癸基]吡咯烷-3-醇的制备(p9)

所用烯烃试剂为1-氯-4-(1-(壬-8-烯-1-氧基)乙基)苯。产物为白色固体，产率：34％,¹hnmr(cd3od,400mhz)δ(ppm):7.28(dp,j＝21.3,7.2hz,5h),4.40(q,j＝6.5hz,1h),3.63(t,j＝5.3hz,1h),3.30(dt,j＝13.4,7.6hz,3h),3.18(ddd,j＝17.6,11.9,6.6hz,2h),2.89(q,j＝5.8hz,1h),2.60(dd,j＝10.6,7.1hz,1h),1.08–1.66(m,24h).¹³cnmr(cd3od,100mhz)δ(ppm):143.88,128.07(2c),127.10,125.82(2c),77.94,75.91,68.37,64.59,53.38,50.72,33.68,29.55,29.45,29.32,29.30,29.29,29.15,26.66,25.90,23.15.ir(kbr,cm^-1):3344,3267,3028,2926,2852,1647,1558,1541,1456,1406,1369,1280,1207,1105,815,759,700,611,559.hrms(esi):m/zcalcdforc22h38n2o2(m+h)⁺:363.3012.found:363.2998.

实施例10

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[1-(4-氟苯基)乙氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p10)

所用烯烃试剂为1-氟-4-(1-(壬-8-烯-1-氧基)乙基)苯。产物为白色固体，产率：38％,¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):7.27(t,j＝6.7hz,2h),7.02(t,j＝8.6hz,2h),4.36(q,j＝6.3hz,1h),3.52(t,j＝4.8hz,1h),3.35(dq,j＝16.2,6.7hz,2h),3.25(p,j＝9.0,7.6hz,2h),2.80–2.89(m,1h),2.56–2.69(m,1h),1.03–1.71(m,25h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):162.03(d,j＝243.0hz),140.03,127.65(d,j＝7.0hz,2c),115.14(d,j＝21.0hz,2c),77.18,75.81,68.73,65.53,53.29,53.01,34.44,29.91,29.75,29.55,29.54(2c),29.43,26.90,26.17,24.20.ir(kbr,cm^-1):3400(br),3253,2926,2854,1645,1606,1560,1510,1456,1369,1340,1224,1103,1016,887,837,725,640,580.hrms(esi):m/zcalcdforc22h37fn2o2(m+h)⁺:381.2917.found:381.2761.

实施例11

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[1-(4-氟苯基)氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p11)

所用烯烃试剂为2-氯-4-氟-1-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：26％；¹hnmr(cd3od,400mhz)δ(ppm):7.29–7.38(m,2h),7.05(t,j＝8.7hz,2h),4.46(s,2h),3.63(t,j＝5.3hz,1h),3.47(t,j＝6.5hz,2h),3.18(ddd,j＝17.5,12.0,6.7hz,2h),2.89(q,j＝5.8hz,1h),2.61(dd,j＝10.7,7.2hz,1h),1.20–1.67(m,22h).¹³cnmr(cd3od,100mhz)δ(ppm):162.32(d,j＝242.0hz),134.50,129.35(d,j＝8.0hz,2c),114.63(d,j＝21.0hz,2c),75.85,71.71,70.08,64.60,53.33,50.62,33.58,29.41,29.35,29.31,29.27,29.26,29.14,26.63,25.88.ir(kbr,cm^-1):3348,3242,2922,2850,2791,2659,2528,1514,1465,1363,1298,1240,1120,1016,966,921,879,821,767,721,634,567.hrms(esi):m/zcalcdforc21h35fn2o2(m+h)⁺:367.2761.found:367.2761.

实施例12

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[(2,3,5,6-四氟-4-甲基苄基)氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p12)

所用烯烃试剂为1,2,4,5-四氟-3-甲基-6-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：33％,¹hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):4.59(s,2h),3.67(t,j＝5.4hz,1h),3.49(t,j＝6.5hz,2h),3.26(q,j＝6.7hz,1h),3.19(dd,j＝11.2,6.7hz,1h),2.91–2.97(m,1h),2.66(dd,j＝11.3,7.5hz,1h),2.28(s,3h),1.59(ddt,j＝27.5,14.0,7.6hz,3h),1.22–1.49(m,19h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):146.20,145.92,143.86,143.56,116.25(t,j＝19.0hz,1c),113.64(t,j＝18.0hz,1c),75.81,70.90,65.54,59.74,53.31,52.99,34.43,29.74,29.55,29.52(3c),29.37,26.89,25.99,7.61.ir(kbr,cm^-1):3350,3244,2920,2850,2686,2538,1633,1581,1487,1409,1367,1284,1109,1072,1031,956,923,875,837,752,719,667,597.hrms(esi):m/zcalcdforc22h34f4n2o2(m+h)⁺:435.2635.found:435.2453.

实施例13

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-{[4-(三氟甲基)苄基]氧基}癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p13)

所用烯烃试剂为1-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)-4-(三氟甲基)苯。产物为白色固体，产率：35％,¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):7.60(d,j＝8.0hz,2h),7.45(d,j＝7.9hz,2h),4.55(s,2h),3.50(dt,j＝19.5,6.0hz,3h),3.30–3.43(m,2h),2.87(d,j＝5.3hz,1h),2.64(dd,j＝9.7,6.1hz,1h),2.40(brs,4h),1.11–1.68(m,18h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):142.90,129.60(d,j＝32.0hz),127.46(2c),125.26(q,j＝3.8hz,2c),122.85,75.76,72.02,70.93,65.52,53.14,52.94,34.33,29.73(2c),29.56,29.54(2c),29.46,26.89,26.17.ir(kbr,cm^-1):3350,3240,2926,2850,1622,1558,1469,1406,1340,1165,1124,1066,1018,970,921,879,823,758,646,594.hrms(esi):m/zcalcdforc22h35f3n2o2(m+h)⁺:417.2729.found:417.2721.

实施例14

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[(2,4-二甲氧基苄基)氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p14)

所用烯烃试剂为2,4-二甲氧基-1-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯。产物为白色固体，产率：19％,¹hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):7.09(d,j＝8.3hz,1h),6.42(d,j＝2.3hz,1h),6.38(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),4.33(s,2h),3.70(s,3h),3.69(s,3h),3.54–3.57(m,1h),3.36(t,j＝6.6hz,2h),3.14(q,j＝6.7hz,1h),3.08(dd,j＝11.2,6.7hz,1h),2.82(q,j＝6.1hz,1h),2.54(dd,j＝11.2,7.5hz,1h),1.44–1.54(m,3h),1.15–1.40(m,19h).¹³cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):161.01,158.72,130.32,118.56,103.89,97.80,75.63,69.79,67.08,64.62,54.46,54.37,53.16,50.31,33.30,29.36,29.31,29.27,29.25,29.23,29.11,26.58,25.82.ir(kbr,cm^-1):3433(br),3269,2926,2850,1618,1510,1259,1209,1138,1093,970,920,869,829,790,719,634,565.hrms(esi):m/zcalcdforc23h40n2o4(m+h)⁺:409.3066.found:409.2900.

实施例15

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-(10-羟基癸基)吡咯烷-3-醇的制备(p15)

所用烯烃试剂为2-((壬-8-烯-1-基氧基)甲基)萘。产物为白色固体，产率：28％,¹hnmr(cdcl3,400mhz)δ(ppm):3.59(t,j＝6.6hz,3h),3.20–3.31(m,2h),3.12(brs,5h),2.90(q,j＝6.6,5.9hz,1h),2.62(dd,j＝10.1,6.7hz,1h),1.08–1.65(m,18h).¹³cnmr(cdcl3,100mhz)δ(ppm):75.74,65.00,62.49,53.18,51.84,34.03,32.52,29.50,29.38,29.31,29.29,29.26,26.66,25.63.ir(kbr,cm^-1):3342,3248,2922,2850,2659,2528,1649,1558,1467,1431,1354,1321,1109,1062,1020,966,920,877,831,786,719,634,570,513.hrms(esi):m/zcalcdforc14h30n2o2(m+h)⁺:259.2386.found:259.2380.

实施例16

4-{{{10–[(2r,3s,4s)-4-氨基-3-羟基吡咯烷-2-基]癸基}氧基}甲基}苄腈(p16)

所用烯烃试剂为4-((壬-8-烯-1-氧基)甲基)苯甲腈。产物为白色固体，产率：26％,¹hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):7.22(d,j＝8.0hz,2h),7.16(d,j＝7.9hz,2h),4.45(s,2h),3.64(dd,j＝6.0,4.9hz,1h),3.47(t,j＝6.6hz,2h),3.14–3.24(m,2h),2.90(dt,j＝7.2,5.5hz,1h),2.62(dd,j＝11.0,7.4hz,1h),1.56–1.64(m,3h),1.26–1.51(m,15h).¹³cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):137.03,135.34,128.56(2c),127.59(2c),75.89,72.34,69.87,64.59,50.65,33.61,29.41,29.33,29.31,29.27,29.25,29.13,26.63,25.86,19.83.ir(kbr,cm^-1):3348,3242,2920,2850,2657,2520,1720,1587,1516,1465,1367,1114,1020,960,920,877,833,800,754,719,682,655,632,567.hrms(esi):m/zcalcdforc22h35n3o2(m+na)⁺:396.6080.found:396.6080.

实施例17

(2r,3s,4s)-4-氨基-2-{10-[(四氢-2h-吡喃-4-基)氧基]癸基}吡咯烷-3-醇的制备(p17)

所用烯烃试剂为4-(壬-8-烯-1-氧基)四氢-2h-吡喃。产物为白色固体，产率：37％,¹hnmr(cd3od,600mhz)δ(ppm):3.50–3.54(m,1h),3.32(t,j＝6.6hz,2h),3.19(d,j＝7.1hz,2h),3.03–3.13(m,2h),2.78(q,j＝5.8hz,1h),2.50(dd,j＝11.0,7.5hz,1h),2.03(dq,j＝14.9,7.5hz,1h),1.60–1.67(m,2h),1.49(dddd,j＝27.3,20.0,10.1,4.9hz,7h),1.18–1.39(m,15h),1.15(dq,j＝14.2,7.2hz,2h).¹³cnmr(cd3od,150mhz)δ(ppm):75.93,75.20,70.69,64.58,53.39,50.70,39.31,33.66,29.44,29.35,29.34,29.29,29.28,29.24,29.18(2c),26.66,25.90,25.00(2c).ir(kbr,cm^-1):3336,3255,2920,2850,2796,2546,1558,1469,1373,1116,1078,1008,964,914,875,813,759,719,665,634.hrms(esi):m/zcalcdforc14h30n2o2(m+h)⁺:357.3117.found:357.3000.

本发明化合物的部分药理学试验及结果如下：

实验例1：本发明化合物对sphk1和sphk2的抑制作用检测

实验方法：首先将化合物p1-p17用dmso配制成10mm的母液，超声加速溶解，后用dmso及激酶缓冲液进行梯度稀释，保证dmso的终浓度小于1％。在白色的酶标板上，每孔加1ul的药物，然后加入10μlakt1酶(100ng/孔)混匀，再加5μl的crosstide底物,后加入34μl的分析缓冲液(ph7.4,40mmtris,10mmmgcl2,0.1mg/mlbsa,1mmdtt,10μmatp)，混匀，在30℃下孵育40分钟，然后加入atp检测液50μl,室温反应5分钟，立即在在酶标仪上检测化学发光信号，将数值代入如下公式，计算活性百分率：

％activity＝[(lu药物–lu本底)/(lu酶–lu本底)]×100％

用graphpadprism5软件处理，计算出化合物的ic50值。

实验结果

1、初步筛选结果

表1化合物p1-p17(10μm)对sphk1和sphk2抑制率

初步的筛选结果表明，化合物p3，p4，p5，p7，p17在浓度为10μm时对sphk1均具有一定的抑制效果，其中化合物p17的抑制率高达95％。初筛的所有化合物对sphk2几乎不具有抑制作用，初步测试结果说明，部分化合物对sphk1具有较好的选择性。继续选取化合物p3，p4，p5，p7，p17进行sphk1和sphk2的ic50值测试。

2、化合物p3，p4，p5，p7，p17对sphk1和sphk2的ic50值

表2化合物p3，p4，p5，p7，p17对sphk1和sphk2的ic50值

化合物p3，p4，p5，p7，p17对sphk1和sphk2的ic50值表明，化合物p3的ic50值大于10μm，p4，p5，p7，p17的ic50值均小于10μm，是进行深入药理研究的理想化合物。特别的，p17的ic50值为0.8μm，其sphk2/sphk1高于125，是目前发现的已知选择性最好的sphk1拮抗剂之一。

实验例2：本发明化合物抗肿瘤活性研究

2.1.实验材料

化合物p1-p17，分别用二甲基亚砜(dmso，终浓度0.4％)溶解，用含15％胎牛血清rpmi-1640培养基配制成1mg/ml备用，用时稀释成所需浓度。人肺腺癌(a549)、人结肠癌(lovo)、人黑色素瘤细胞(a375)、人肝癌(hepg2)和人食管癌(te-1)细胞系，均购买于中国科学院细胞库，使用含15％胎牛血清的dmem(highglucose)培养基，置于37℃，5％的co2培养箱内培养。

2.2抗肿瘤活性实验

2.2.1mtt配制方法

5mg/ml的mtt溶液配制：称取mtt粉末500.0mg，溶于温的100mlpbs中，用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤得滤液，小剂量分装于高压灭菌后的ep管中，置于-20℃下冷冻避光保存。

2.2.2细胞培养及实验方法

将保存有肿瘤细胞的冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃恒温箱中，不停摇动，直到融化。用75％酒精擦拭冻存管盖边缘后，吸取细胞悬液转入10ml离心管中，补加5ml培养基。低速离心(25℃,3000r/min,5min)，弃上清，加培养基再重复离心清洗一次。加适量培养基稀释后，用吸管将细胞吹散制成悬液，转入培养瓶中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养。次日更换培养液，置于37℃、5％co2细胞培养箱中继续培养。

人肺腺癌(a549)、人结肠癌(lovo)、人黑色素瘤细胞(a375)、人肝癌(hepg2)和人食管癌(te-1)细胞均为贴壁细胞，根据肿瘤细胞生长速率，将处于对数生长期的贴壁肿瘤细胞洗涤，经0.25％的edta胰酶消化，调整细胞数为1×10⁵/ml接种于96孔板内，每孔100μl，37℃下于co2孵箱内培养，24h后给药。给药组加入不同浓度药物(化合物p1-p17)，每个药物设置5个剂量组，分别为100.00、10.00、1.00、0.10、0.01μm/l，每个浓度设三个复孔。设置空白对照、dmso(0.8％)溶剂对照和顺铂阳性对照。在37℃co2培养箱内培养48h后，用mtt法测定od值，计算细胞抑制率。

2.2.3细胞ic50值的计算

人肺腺癌(a549)、人结肠癌(lovo)、人黑色素瘤细胞(a375)、人肝癌(hepg2)和人食管癌(te-1)细胞培养48h后，终止，然后每个孔中加入10μl0.5％mtt溶液放置于co2培养箱中，4h后，除去每个孔中的液体，然后再分别加入0.2ml的dmso溶液，在摇床上低频充分振荡，使蓝紫色结晶的甲瓒充分溶解，置于酶标仪中，于490nm波长处记录od值，计算不同浓度的三个平行孔的平均值od值，根据平均值计算不同浓度下的每一种受试药物的细胞抑制率以及ic50值(见表3)。

抑制率(％)＝[1-供试品od值/阴性对照组od值]×100％

2.2.4结果判断

中药新药临床前研究指导原则表明，天然产物ic50≤30μmol/ml时认为有一定抑制作用；合成药物ic50≤10μmol/ml时认为有一定抑制作用。

表3化合物抗癌细胞增殖的ic50值

2.3结果与讨论

抗肿瘤细胞增殖活性表明，本项目合成的多数2,3,4三取代四氢吡咯烷类化合物经mtt所测得ic50值基本在3μm左右，其中，化合物p1、p2、p6、p12、p16对人肺腺癌(a549)、人结肠癌(lovo)、人肝癌(hepg2)的ic50值均较小，p9、p13对人肺腺癌(a549)的ic50值均较小，p3、p11对人肝癌(hepg2)的ic50值均较小，并且都与阳性对照药顺铂(cisplatin)的活性相当。这些化合物均为相应的抗癌药物的开发和利用奠定了基础。