一种双通道双光子荧光极性探针及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种双通道双光子荧光极性探针及其制备方法和用途，以实现双通道双光子荧光成像定量检测细胞线粒体内的极性，具有选择性专一、灵敏度高、生物毒性低的优点。

背景技术：

线粒体是真核细胞中非常重要的细胞器，例如产生三磷酸腺苷(atp)为生理过程提供能量，因此它被称为细胞的能量源泉。此外，线粒体参与许多生理过程例如为大分子的生物合成提供能量和维持细胞内ca²⁺水平的稳态等。线粒体与极性，粘度，ph等微环境参数密切相关。并且线粒体极性尤为重要，它能够影响线粒体活性。其中，线粒体功能障碍会导致一系列的疾病例如神经退行性疾病等。线粒体功能障碍会导致细胞凋亡。更为重要的是，线粒体功能障碍时线粒体极性会发生变化，因此通过检测极性改变能够进一步监测凋亡。

细胞凋亡，是程序性死亡的其中一个过程，在生物过程中扮演重要的角色，因此检测细胞凋亡对于生物学研究具有重要的意义。目前检测凋亡的方法是基于传统方法，例如检测半胱天冬酶蛋白的活性等。但这些方法的成本很高，周期很长和敏感性很差，并且它们成本很高不能满足评估细胞凋亡的要求。迄今为止，用于评估细胞凋亡的荧光探针分析方法仍然很少见，因此，需要尽快开发性能优异的荧光探针来检测细胞凋亡。

在过去十年中，荧光探针方法已经被广泛应用于监测生物过程，这主要基于荧光探针技术价格便宜，使用简单，灵敏度高，响应速度快。目前，已经开发非常多的荧光探针，但是检测线粒体极性的探针还是非常少的，因此开发性能优异的线粒体极性探针是非常迫切的。

极性在生物过程中是起着非常重要的作用。例如极性可以调节细胞器膜的渗透性。此外，极性的异常变化与某些疾病有很大的联系。当前检测极性的主要机制是基于ict机理，这种机理对环境极性具有更高灵敏度，从而在检测极性过程中提供准确的结果，这对于生物环境的研究具有重要意义。并且，细胞凋亡过程中极性会有很大的改变，因此可以通过极性来检测凋亡，这对于研究细胞凋亡提供了一个很好的思路。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种双通道双光子荧光极性探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以线粒体定位的比率型双光子荧光极性探针的结构，以实现双通道双光子荧光成像检测细胞凋亡过程线粒体中的极性变化，具有选择性专一、灵敏度高、双通道检测的优点，细胞毒性测试表明本发明荧光探针对细胞几乎没有毒性作用。

本发明双通道双光子荧光极性探针，简记为mito-pf，以咔唑为母体，其结构式如下：

本发明双通道双光子荧光极性探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将化合物9-乙基-6-碘-9h-咔唑-3-甲醛(1.0g，2.86mmol)，4-氟苯乙炔(0.41g，3.44mmol)，三苯基磷二氯化钯(9.65mg，0.014mmol)，碘化亚铜(5.24mg，0.027mmol)和三乙胺(2ml)加入反应器中，在30℃无水无氧条件下搅拌12小时；将混合物冷却至室温，将沉淀过滤并浓缩，得到粗产物；通过柱色谱法(石油/二氯甲烷＝4：1作为洗脱液)纯化粗产物，得到中间体1，0.80g，产率为82％。

步骤2：将化合物3-苄基-2-甲基苯并噻唑溴化物盐(0.28g，0.9mmol)和中间体1(0.3g，0.9mmol)在50ml无水乙醇中混合，并将混合溶液在氮气下回流直至tlc显示原料反应完全(约12小时)，将混合物冷却至室温后，通过旋转蒸发仪除去溶剂；将得到的粗产物用30ml饱和盐水洗涤，然后用dcm(3×50ml)萃取，并在真空下蒸发溶剂，通过柱色谱法(二氯甲烷/甲醇＝50：1作为洗脱液)纯化粗产物，得到目的产物mito-pf，0.35g，产率为62％。

本发明双光子荧光探针mito-pf的合成过程如下：

本发明双通道双光子荧光极性探针的用途，是在非治疗或诊断目的的定量检测活细胞中线粒体内的极性变化时作为检测试剂使用。检测方法如下：

将本发明双光子荧光探针溶于dmso中制得2mm的母液，各取15μl母液于3ml不同极性的溶剂中，获得探针mito-pf在不同溶剂中的紫外谱图。在360nm波长激发下，其在436nm处的荧光强度随着测试体系极性的增大逐渐减弱，荧光强度在589nm处几乎没有变化。并且荧光强度(i436nm/i589nm)和δf之间存在线性关系，这表明mito-pf可用于比率检测常见溶液的极性。为了进一步验证探针mito-pf对极性的响应特性，在具有不同比例的水和四氢呋喃极性范围内，测量mito-pf的吸收和荧光光谱。当溶剂的极性从含10％水(δf≈0.2556)依次增大到含80％水(δf≈0.3103)时，在吸收最大值中只能看到微小的变化与测不同溶剂极性的结果一致。相反，当溶液的极性(δf)从0.3103(80％水)降低到0.2556(10％水)时，mito-pf在436nm处的荧光强度增加了3.6倍，而在589nm处红色发射几乎没有响应。上述结果还显示荧光强度i436nm/i589nm与δf具有良好的线性相关性，这表明mito-pf对溶剂极性高度敏感。为了探究探针mito-pf在hela细胞中光学的稳定性，这是非常重要的实验，因为在细胞凋亡过程中，线粒体膜电位会被破坏，这会影响探针的定位性能，从而关系到能否实时监测细胞凋亡过程。已有报道的文章指出3-氯苯腙(cccp)是膜电位破坏剂，可以破坏线粒体膜电位。加入cccp实验证明探针mito-pf不依靠膜电势进行定位。此外，利用探针mito-pf测试了依托泊苷(etoposide)诱导hela细胞凋亡过程，随着细胞凋亡的深入，细胞内的线粒体极性会逐渐减小。

本发明双光子荧光极性探针分子在与其他干扰因素共存的体系中，表现出对极性的专一性响应。细胞毒性测试表明该探针对于细胞几乎没有什么毒副作用，双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该探针对hela细胞渗透性好，可以有效定位细胞中的线粒体(定位系数分别为0.95)，适用于细胞线粒体内极性的双通道双光子荧光成像和定量检测，并可以通过检测线粒体极性变化实时监测细胞凋亡。

附图说明

图1是10μm探针在不同极性有机溶剂中的(a)紫外吸收光谱图；(b)荧光发射光谱图；(c)荧光强度(i436nm/i589nm)和δf之间的线性关系图。

图2是10μm探针在不同体积比水/四氢呋喃混合溶剂中的(a)紫外吸收光谱图；(b)荧光发射光谱图；(c)荧光强度(i436nm/i589nm)和δf之间的线性关系图。

图3是10μm探针在四氢呋喃和不同黏度的甲醇/甘油混合体系中的荧光发射图。

图4是10μm探针在水/四氢呋喃不同比例的ph稳定性图。

图5是0.1mm探针在不同体积比水/四氢呋喃混合溶剂中的(a)有效双光子吸收截面图；(b)相对双光子荧光强度(iout)与输入功率(iin)的对数关系图。

图6是在不同浓度(0μm、10μm、20μm、30μm)的探针分子的作用下的hela细胞存活率图。

图7是10μm探针和1μmmitotrackergreen(mtg)同时共染hela细胞线粒体定位验证共聚焦荧光成像图。

图8是加入和不加人cccp两组实验，探究探针mito-pf的光学稳定性。

图9是10μm探针在50μm依托泊苷(etoposide)诱导的hela细胞凋亡共聚焦荧光成像图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：荧光探针分子mito-pf的合成

将化合物3-苄基-2-甲基苯并噻唑溴化物盐(0.28g，0.9mmol)和化合物1(0.3g，0.9mmol)在50ml无水乙醇中混合，并将混合溶液在氮气下回流直至tlc显示原料反应完全(约12小时)，将混合物冷却至室温后，通过旋转蒸发仪除去溶剂；将得到的粗产物用30ml饱和盐水洗涤，然后用dcm(3×50ml)萃取，并在真空下蒸发溶剂，通过柱色谱法(二氯甲烷/甲醇＝50：1作为洗脱液)纯化粗产物，得到目的产物mito-pf，0.35g，产率为62％。

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.95(d,j＝7.1hz,1h),8.51(d,j＝15.4hz,1h),8.44(s,1h),8.40–8.36(m,1h),8.18(m,j＝14.4,10.1hz,2h),8.12–8.09(m,1h),7.84–7.71(m,5h),7.66–7.60(m,2h),7.38(t,j＝13.9,7.1hz,5h),7.29(t,j＝8.9hz,2h),6.26(s,2h),4.55–4.50(m,2h),1.36(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(150mhz,dmso)δ173.37,152.05,143.28,141.69,140.58,134.43,134.00,133.94,130.50,129.93,129.68,129.41,129.03,128.71,128.33,127.50,126.20,124.97,124.46,123.03,122.92,117.23,116.61,116.46,114.16,111.21,111.07,110.54,90.50,87.55,51.72,38.18,14.36.

实施例2：荧光探针分子的光谱测试

将本发明荧光探针mito-pf溶于dmso中制得2mm的母液，各取15μl母液于3ml不同极性的溶剂中，获得探针mito-pf在不同溶剂中的紫外谱图(图1a)。伴随溶剂极性的增加，其荧光强度在436nm处的值逐渐减小，荧光强度在589nm处几乎没有变化，从而提供比率响应(图1b)。并且荧光强度(i436nm/i589nm)和δf之间存在线性关系(图1c)，这表明mito-pf可用于双通道检测常见溶液的极性。为了进一步证明探针mito-pf的极性响应特性，在25℃下在具有不同比例的水和四氢呋喃极性范围内，测量mito-pf的吸收和荧光光谱(图2a，2b)。当溶液的极性(δf)从0.3103(80％水)降低到0.2556(10％水)时，mito-pf在436nm处的荧光强度增加了3.6倍，而在589nm处红色发射几乎没有响应。上述结果还显示荧光强度i436nm/i589nm与δf具有良好的线性相关性(图2c)，这表明mito-pf对溶剂极性高度敏感。据文献报道，thf和甲醇具有几乎相同的粘度(0.53cp对0.60cp)但极性不同(0.21对0.31)。mito-pf在436nm处的荧光强度显示出巨大的差异，而589nm处的红色发射仅显示出变化不大。随着粘度从0.60cp增加到约100cp，436nm和589nm处的荧光强度几乎没有变化(图3)说明探针mito-pf对粘度变化不敏感。为了排除ph的影响，测试其ph稳定性，在水/四氢呋喃不同体系中，其ph值在6-9范围内，mito-pf荧光强度数值变化不大(图4)，此实验结果表明ph值对探针mito-pf的影响较小，探针mito-pf对ph的变化不敏感。以上结果证明探针mito-pf可以特异性检测极性不受外界环境的干扰。

实施例3：荧光探针分子的双光子性能测试

mito-pf在不同水和四氢呋喃混合溶剂中(四氢呋喃的含量分别为90％，50％和20％)，有效双光子吸收截面在720nm出现最大并随着四氢呋喃含量的降低，逐渐从87gm降到41gm(图5a)。观察到了mito-pf在不同溶剂中的双光子激发荧光强度与输入功率(300-800mw)成平方的关系(图5b)。证明mito-pf有能力用于细胞内极性的双光子共聚焦荧光成像。

实施例4：细胞毒性测试

我们用mtt(5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑溴化物)方法进行了细胞毒性实验。mito-pf在活hela细胞中加入各种浓度(0μm，10.0μm，20.0μm，30.0μm)，24小时后测试，结果如图6所示，以上显示mito-pf的生物毒性很小，可以进行生物应用。

实施例5：细胞定位测试

为了研究mito-pf的线粒体定位性能，这对于研究线粒体极性是非常必须的，我们这里使用的商业染料mitotrackergreen(mtg)与mito-pf在hela细胞中进行共定位研究。结果表明mito-pf的红色通道(λem＝560-600nm，λex＝720nm)和mtg(λem＝500-540nm，λex＝488nm)的荧光图像重叠良好，并且mito-pf与mtg的pearson共定位系数计算为0.95(图7)。这些结果表明，mito-pf可以很好地定位于活细胞的线粒体中。

实施例6：mito-pf在线粒体中稳定性实验

为了探究探针mito-pf在hela细胞中光学的稳定性，这是非常重要的实验，因为在细胞凋亡过程中，线粒体膜电位会被破坏，这会影响探针的定位性能，从而关系到能否实时监测细胞凋亡过程。已有报道的文章指出3-氯苯腙(cccp)是膜电位破坏剂，可以破坏线粒体膜电位。在一组hela细胞中加入cccp，另一组不加入cccp(图8)。30分钟后进行荧光成像。加入和不加入cccp，绿色和红色通道在荧光成像中没有变化，并且线粒体绿色商染和探针红色重叠非常好，证明探针mito-pf不依靠膜电势进行定位。

实施例7：细胞线粒体体凋亡共聚焦荧光成像

依托泊苷(etoposide)能够引起细胞凋亡，是一种公认的细胞凋亡试剂。从已有的文献报道来看，细胞凋亡会引起细胞内线粒体微环境的变化，例如：极性。由于细胞凋亡过程中线粒体极性会发生变化，因此可以检测极性波动来监测凋亡。因此，我们做了以下一些实验(图9)。将mito-pf(10μm，0.5小时)入细胞内孵育。之后将etoposide(50μm)加入细胞内，时间每隔10分钟(a-e)进行成像。通过成像可以发现在蓝色通道(λem＝420-460nm)中的荧光强度逐渐增强。而在红色通道(λem＝560-600nm)中荧光强度基本保持稳定，这与体外测试的荧光数据保持一致。通过以上数据的分析，我们能够清晰的发现，随着加入依托泊苷(etoposide)的时间增长，即凋亡更深入，这时细胞内线粒体的极性逐渐减小(蓝色通道荧光增强，红色通道荧光不变)。这说明细胞凋亡会引起细胞内线粒体极性减小。这些数据证明我们通过细胞内线粒体极性变化来监测细胞凋亡是可行的。这为以后监测细胞凋亡提供了一个好的方法，也为以后荧光探针在生物方面的应用提供了一个好的思路。