一种利用氧化石墨烯提升水生动物疫病检测效率的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用氧化石墨烯提升水生动物疫病检测效率的方法。

背景技术：

我国为水产品产量居世界首位的养殖大国，水产养殖品种繁多，病害发生种类多（如传染性造血器官坏死病、锦鲤疱疹病毒病、白斑综合症、传染性皮下和造血器官坏死病、草鱼出血病等）且综合发病多，发病时间长、流行面积广，病害控制难度大，死亡率高，经济损失大。水生动物疫病具有传染快、爆发性强等特点，因此，水生动物疫病的快速精确检测对于病害预防和防治尤为重要。环介导等温扩增反应作为一种在等温条件下进行的核酸扩增术，可以应用于水生动物疫病的快速检测。由于该技术灵敏度高，很容易产生假阳性结果；同时由于扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合产生引物二聚体，从而消耗反应体系中的反应底物，降低反应效率和检测灵敏度，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何提升环介导等温扩增检测效率，使得其既有较高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增，是水生动物疫病检测领域中急需解决的技术难题。

氧化石墨烯是石墨粉末经化学氧化及剥离后的产物，是单一的原子层，可在横向尺寸上扩展到数十微米，具有聚合物、胶体、薄膜，以及两性分子的特性，在生物技术、生物医学工程、纳米医学、肿瘤治疗、组织工程、药物释放、生物成像和生物分子传感等领域都具有重要潜在应用。尚未见有将氧化石墨烯应用于水生动物疫病检测的报道。

本发明提供了一种利用氧化石墨烯提升水生动物疫病检测效率的方法，能够进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，可以很好的解决在水生动物疫病检测方面遇到的技术难题。

技术实现要素：

针对现有基于环介导等温扩增技术进行水生动物疫病检测时所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本发明目的在于：提供一种利用氧化石墨烯提升水生动物疫病检测效率的方法，以提升水生动物疫病检测效率。

本发明目的通过以下方案实现：一种利用氧化石墨烯提升水生动物疫病检测效率的方法，其特征在于，通过向水生动物疫病环介导等温扩增反应体系中添加氧化石墨烯材料来提升检测效率，具体如下：

（1）氧化石墨烯制备：氧化石墨烯试剂利用现有技术制备；

（2）扩增反应体系优化：将氧化石墨烯加入到环介导等温扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；

（3）核酸扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测。

通过向环介导等温扩增反应体系中添加氧化石墨烯材料来提升检测效率，提供了一种的方法。采用本发明的检测方法检测，具有高灵敏度和高特异性的优点。

所述的水生动物疫病环介导等温扩增反应体系优化，其中用量为：在25µl的核酸扩增反应体系中加入氧化石墨烯的终浓度为0.4-10μg/l。

本发明方法中，水生动物疫病包括但不限于传染性造血器官坏死病、锦鲤疱疹病毒病、白斑综合症、传染性皮下和造血器官坏死病、草鱼出血病等。

本发明方法中，在一具体实施方案中，所述核酸扩增反应体系包括外引物f3和b3各0.2μmol/l，内引物fip和bip各1.6μmol/l，bstdna聚合酶8u，1×聚合酶缓冲液，mg²⁺2-9mmol/l，dntp1.0-1.6mmol/l，甜菜碱0-1.5mol/l，氧化石墨烯0.4-10μg/l。例如，1×bstdna聚合酶反应缓冲液可以选用1×thermopol反应缓冲液，包含tris-hcl(ph8.8)20mmol/l，kcl10mmol/l，(nh4)2so410mmol/l，0.1%tritonx-100，mgso42mmol/l。1×bstdna聚合酶反应缓冲液中的mgso4和酶反应体系中的镁离子mg²⁺做合并处理。本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90min；②80℃终止反应2~20min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。

本发明方法中，扩增结果检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测（包括肉眼直接观察或借助仪器进行扩增曲线判断）等。

本发明为生物技术领域提供了一种提升水生动物疫病检测效率的方法。本发明有益效果包括：采用本发明检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点。与目前常用的水生动物疫病环介导等温扩增检测方法相比，本发明通过向扩增反应体系中添加氧化石墨烯材料来提升水生动物疫病检测效率，操作简单，效果极佳，非常适于水产养殖和质量检测等领域推广使用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。

附图说明

附图1表明本发明实施例1氧化石墨烯提升传染性造血器官坏死病的检测效率；

附图2表明本发明实施例2氧化石墨烯提升鲤春病毒血症的检测效率。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

一种利用氧化石墨烯提升传染性造血器官坏死病的检测效率的方法，通过下述向水生动物疫病环介导等温扩增反应体系中添加氧化石墨烯材料来提升检测效率，具体步骤如下：

（1）针对传染性造血器官坏死病环介导等温扩增检测反应体系的优化，将氧化石墨烯加入到水生动物疫病环介导等温扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；

制备核酸扩增反应体系（除氧化石墨烯外），组成如下表：

其中引物fip、bip、f3和b3为传染性造血器官坏死病毒特异性核酸扩增引物，模板为传染性造血器官坏死病毒cdna，模板量为0（阴性对照）或1ng。

（2）向以上体系中加入处理过的优化材料氧化石墨烯，每25µl的体系中加入1.0µl的氧化石墨烯溶液（终浓度为0.5µg/l），同时做不加优化材料的相应对照实验。然后在63℃条件下进行核酸反应60min。80℃终止反应5min。

（3）将扩增产物进行琼脂糖电泳检测

扩增结果如图1所示，m为分子量标准（dl2000），样品1-2反应体系中没有添加优化材料氧化石墨烯，3-4添加了优化材料量子点，其中1和3模板量为1ng，2和4模板量为0（即阴性对照）。可以看出在没有添加氧化石墨烯的处理中，模板量为1ng和0的反应体系电泳呈现特征性梯形条带，表明存在非特异性扩增（即假阳性）；而在添加氧化石墨烯的处理中，模板量为1ng的反应体系电泳呈现特征性梯形条带，判断为阳性，而模板为0的反应体系（即阴性对照）电泳未呈现特征性梯形条带，判断为阴性。该检测结果显示，本发明可以消除非特异性扩增，避免假阳性，提升了检测效率。

实施例2

一种利用氧化石墨烯提升鲤春病毒血症的检测效率的方法，通过下述向水生动物疫病环介导等温扩增反应体系中添加氧化石墨烯材料来提升检测效率，具体步骤如下：

（1）制备核酸反应体系，组成如下表：

其中引物fip、bip、f3和b3为鲤春病毒血症病毒特异性环介导等温扩增引物，模板为鲤春病毒血症rna，并做了系列稀释，分别为10⁰（即原液）、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和0（即阴性对照）。氧化石墨烯加样量为1.0µl（终浓度为8μg/l）。

（2）向以上体系中加入处理过的优化材料氧化石墨烯，每个25µl的体系中加入1.0µl的氧化石墨烯溶液（终浓度为8.0µg/l），同时做不加优化材料的相应对照实验。然后在62℃条件下进行核酸反应60min。80℃终止反应2min。

（3）在扩增产物中加入sybrgreeni进行显色检测。

扩增结果如图2所示。图中样品从左至右1-8反应体系中加入的鲤春病毒血症病毒rna模板的量分别10⁰（即原液）、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和0（即阴性对照），第一组不加入本发明优化材料氧化石墨烯，第二组加入本发明优化材料氧化石墨烯。从图中可以看出，未加入优化材料氧化石墨烯的体系在模板量为10⁰（即原液）、10^-1、10^-2和10^-3的样品管显色为亮绿色，判断为阳性，而模板量为10^-4、10^-5、10^-6和0的样品管显色为橙色，判断为阴性，表明不添加优化材料氧化石墨烯的反应体系最低可检测到稀释度为10^-3的模板；而加入优化材料氧化石墨烯的体系模板量为10⁰（即原液）、10^-1、10^-2、10^-3和10^-4的样品管显色为亮绿色，判断为阳性，而模板量为10^-5、10^-6和0的样品管显色为橙色，判断为阴性，表明添加优化材料氧化石墨烯的反应体系最低可检测到稀释度为10^-4的模板，比未添加优化材料氧化石墨烯的检测灵敏度提高1个数量级。该检测结果显示，本发明可以提高反应灵敏度，提升检测效率。