一种啤酒酵母中敲除芳香氨基酸转氨酶IIAro9基因的构建方法与流程

本发明涉及一种啤酒酵母中敲除芳香氨基酸转氨酶iiaro9基因的构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术：

目前，在s.pastorianustccc31194基因中通过二代测序，发现sptt22_00910和sptt4_00770都是编码芳香氨基酸转氨酶的基因。同ncbi上公布的基因序列比对sptt22_00910与s.cerevisiae中aro9基因序列比对同源性一致，编码的蛋白同源性均一致，故称为aro9(sptt22_00910)；sptt4_00770与s.eubayanus中aro9基因序列进行比对其核酸和蛋白质同源性均一致，故称为aro9(sptt4_00770)。

cre/loxp系统是由cre重组酶和loxp序列组成，cre重组酶能识别特异的dna序列即loxp位点，使loxp位点间的基因序列被删除和重组。loxp序列是两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp的序列共同组成，8bp的序列确定loxp的方向，如果两个loxp序列位于一条dna链上，且方向相同，cre重组酶能由切除两个loxp位点间的序列。

将loxp-kanmx-loxp抗性基因连接aro9基因序列的上下游300bp左右的同源臂中间，得到一个敲除重组盒，结合同源重组来敲除酵母中编码芳香氨基酸转氨酶ii基因aro9，再利用cre/loxp系统消除kanmx基因，得到不带有筛选基因的敲除菌株，此方法简便且效率高。

技术实现要素：

本发明的目的在于构建一种啤酒酵母中敲除芳香氨基酸转氨酶ii基因aro9的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

(1)啤酒酵母基因组的获得：挑取新鲜的酵母单菌落至50ul2.5g/l十二烷基磺酸钠(sds)溶液中，振荡混匀1min，放置95℃热激5min，再放置冰中冰浴5min,重复3个循环后，12000r/min离心1min，收集上清液即可获得啤酒酵母基因组；

(2)目的基因的克隆：利用合理引物、条件，pcr分别扩增出aro9的上下游同源臂。以pug6质粒为载体，pcr扩增出两端带有loxp序列kanmx基因；

(3)构建敲除重组盒：以puc18质粒为载体，将aro9的上下游同源臂和kanmx基因插入到puc18质粒的bamh1位点，构建puc18-aro9敲除载体，将其用限制性bamh1酶酶切获得aro9敲除重组盒；

(4)获得重组菌株：将aro9敲除重组盒通过醋酸锂转化法转入到酵母中，分别得到带有抗性基因的aro9敲除菌株；

(5)利用cre/loxp系统消除筛选基因：将带有编码cre重组酶基因的质粒psh65转入待酵母中，用半乳糖培养基培养5h，在涂布到带有博来霉素抗生素的平板上，待长出转化子，分别影印到带有g418抗生素和不带g418抗生素的平板上，若能在后者上面生长而不能在前者上生长，则可获得无筛选基因的的敲除菌株。

本发明的积极意义

1.本发明采用同源重组的方法构建载体，较整合至基因组的方法简便，大大缩短构建周期。

2.本发明将啤酒酵母中的aro9同源基因进行敲除，优化了目的基因的引物序列，能针对性敲除基因组中某个位点的序列。

3.本发明采用粗提酵母基因组的方法，试剂单一，方法简便，可大批量获得酵母基因组。

附图说明

图1是tccc31194δaro9(sptt22-00910)的敲除验证电泳图；

图2是tccc31194δaro9(sptt4-00770)的敲除验证电泳图。

具体实施方式

实施例1酵母基因组中aro9(sptt22-00910)基因的敲除

(1)将新鲜酵母单菌落用接种环挑取到ypd平板上，静置培养，直到菌体长出来，从平板上刮下菌体，加入含有50μl的2.5g/lsds溶液的ep管，用涡旋混合器混匀，放至95℃水浴锅中5分钟后在冰上放置5分钟，重复三次后离心吸取上清30μl至新的ep管中，放置-20℃备用。

(2)以酵母基因组为模板，通过同源引物pcr扩增出sptt22-00910基因序列所对应的大小为300bp左右上游同源臂和下游同源臂；以pug6质粒为模板扩增loxp-kanmx-loxp片段。

(3)选择puc18质粒为载体，以5′端bamhi为酶切位点，用插入上下游同源臂和loxp-kanmx-loxp基因，构建载体puc18-aro9(sptt22-00910)载体,并用限制性bamhi酶进行酶切，得到u+loxp-kanmx-loxp+d重组盒片段。

(3)将u+loxp-kanmx-loxp+d重组盒片段纯化回收，利用醋酸锂转化法转化到啤酒酵母中，涂板得到转化子。根据同源重组，kanmx基因替代sptt22-00910基因，挑转化子进行验证。

(4)将带有编码cre重组酶基因的质粒psh65转入待酵母中，用半乳糖培养基诱导培养5h，涂布到带有博来霉素抗生素的平板上，待长出转化子，分别影印到带有g418抗生素和不带g418抗生素的平板上，若能在后者上面生长而不能在前者上生长，则可获得无筛选基因的的敲除菌株，选用特定引物进行验证如图1。

实施例2酵母基因组中aro9(sptt4-00770)基因的敲除

(1)将新鲜酵母单菌落用接种环挑取到ypd平板上，静置培养，从平板上刮下菌体，加入含有50μl的sds溶液的ep管，用涡旋混合器混匀，放至95℃水浴锅中5分钟后在冰上放置5分钟，重复三次后离心吸取上清30μl至新的ep管中，放置-20℃备用。

(2)以酵母基因组为模板，通过同源引物pcr扩增出基因组中sptt4-00770基因序列所对应的大小为300bp左右上游同源臂和下游同源臂；以pug6质粒为模板扩增loxp-kanmx-loxp片段；。

(3)选择puc18质粒为载体，以5′端bamhi为酶切位点，用插入上下游同源臂和loxp-kanmx-loxp基因，构建载体puc18-aro9(sptt4-00770)载体,并用限制性bamhi酶进行酶切，得到u+loxp-kanmx-loxp+d重组盒片段。

(3)将u+loxp-kanmx-loxp+d重组盒片段纯化回收，利用醋酸锂转化法转化到啤酒酵母中，涂板得到转化子。根据同源重组，kanmx基因替代sptt4-00770基因，挑转化子进行验证。

(4)将带有编码cre重组酶基因的质粒psh65转入待酵母中，用半乳糖培养基诱导培养5h，涂布到带有博来霉素抗生素的平板上，待长出转化子，分别影印到带有g418抗生素和不带g418抗生素的平板上，若能在后者上面生长而不能在前者上生长，则可获得无筛选基因的的敲除菌株，选用特定引物进行验证如图2。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，可依然能对前述实施例对所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改均应包含在本发明的保护范围之内。