本发明涉及植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法。
背景技术：
芋是天南星科芋属多年生草本湿生植物，原产于中国、印度、马来半岛等热带沼泽地区，在一些太平洋岛屿国家，芋是非常重要的粮食和营养来源，根据联合国粮农组织(fao)统计，中国芋的栽培面积连续多年稳居世界前四(faostat，2017)，主要分布于江苏、山东、浙江、广西、广东和云南等省，我国芋资源非常丰富，栽培品种较多，仅江苏省就有7个芋地方特色品种被认定为中国地理标志农产品，芋主要通过球茎繁殖，长期无性繁殖导致植株病毒积累，是造成芋种性退化的主要原因，迄今为止，在全世界已发现的侵染芋的病毒有10多种，其中芋花叶病毒是芋生产上最主要的病毒病害之一，黄瓜花叶病毒是我国分布较广的主要病毒，还有芋瘦小病毒是侵染芋的一种新型弹状病毒科病毒，由于病毒可经种苗、种子、机械和蚜虫等媒介传播，目前尚无有效的化学防治方法，因此带病植株的早期发现拔除和利用茎尖脱毒提纯种苗成为预防芋病毒的最为有效的方法，芋生产过程和脱毒组培苗制备过程中，病毒检测是至关重要的环节，因此，建立快速、准确、高效和稳定的芋病毒检测技术有利于芋病毒病害的早期防控以及脱毒技术的发展，对保障芋质量、脱毒苗的检测具有重要意义。
用于检测芋病毒病的方法主要有直接观测法、血清法、电镜法和rt-rcr技术等，其中直接观测法主观性强；电镜检测需要大型精密设备且操作繁琐；血清法目前仅dsmv病毒有成品的检测试剂盒，且成本高、灵敏度低。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中存在用于检测芋病毒病的方法主要有直接观测法、血清法、电镜法和rt-rcr技术等，其中直接观测法主观性强；电镜检测需要大型精密设备且操作繁琐；血清法目前仅dsmv病毒有成品的检测试剂盒，且有成本高、灵敏度低的缺点，而提出的一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
s1：采集疑似带病毒的芋植株叶片，样品经液氮快速冷冻后置于-80℃冰箱保存；
s2：采用植物totalrna提取试剂盒进行叶片总rna提取，反转录参照takara试剂盒操作方法进行，1.0μlprimeroligo(dt)、11μl总rna样品和depc处理水至反应管中，轻轻混匀并离心；
s3：将反应管置于abi7500pcr仪中65℃反应5min后，立即转移至冰上静置5min，之后于上述反应液体中加入4.0μl5×反转录酶缓冲液、1.0μlrnase抑制剂、1.0μl反转录酶及2.0μldntp，总体积调整至20μl，轻轻混匀并离心，将反应管置于pcr仪中42℃反应90min，70℃反应5min，反应结束后迅速放在冰上冷却备用；
s4：根据genbank公布的芋花叶病毒(dsmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)及芋瘦小病毒(cbdv)3种病毒外壳蛋白(cp)和gapdh基因序列，应用primerpremier5.0软件分别设计3种病毒和芋内参的特异性引物；
s5：以反转录cdna为模板，分别使用dsmv、cbdv和cmv病毒的特异性引物对样品进行pcr扩增，rt-pcr体系为20μl：2.0μlcdna，3种病毒的上游引物和下游引物(10μmol·l-1)各1.0μl，2×tagmix10.0μl，ddh2o补足至20μl，反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸10min，4℃保存；
s6：在单引物rt-pcr基础上，筛选扩增条带单一、稳定的引物并进行多重引物的组合，通过对rt-pcr条件：退火温度以及循环次数的调节，优化芋3种病毒的多重rt-pcr体系；
s7：rt-pcr反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，上样量为8μl，100v稳压电泳30分钟，凝胶紫外成像观察并拍照；
s8：芋3种病毒扩增出的单一产物，经过电泳分离割胶回收，并采用takara公司dna纯化试剂盒纯化，纯化后产物与pmd18-tvector连接，经热激转化dh5α后，通过pcr筛选获得阳性克隆，送至擎科生物技术有限公司进行测序。在ncbi上通过blast对克隆获得的序列进行比对分析；
s9：根据芋3种病毒各自的外壳(cp)蛋白保守序列分别设计引物10对(dsmv)、8对(cmv)和5对(cbdv)，同时通过软件dnaman分析引物间的互补性及引物的退火温度，结果发现当退火温度为56-58℃时，其扩增片段大小差异明显，获得3种病毒特异性引物(编号分别是dsmv、cmv-1和cbdv-1)，单一rt-pcr扩增产物分别为942、202和437bp特异性条带，同时利用筛选到的3种病毒的特异性引物，检测当年收集的疑似病毒植株，筛选出带有单个病毒的植株，作为该病毒的阳性对照；
s10：将带有dsmv、cmv和cbdv单个病毒的cdna混合作为3种病毒的阳性混合对照，以gapdh基因为内参，将病毒特异性引物dsmv，cmv-1，cbdv-1两两组合或三组混合，进行多重rt-pcr，发现可以获得引物组合目标的设计片段；
s11：多重rt-pcr体系的优化筛选中，退火温度设置在52℃，引物二聚体增多，扩增产物模糊，54-58℃产物比较稳定，在退火温度56℃，在相同条件下长片段引物的扩增产物较弱，这是由于在同一个rt-pcr体系中，引物存在竞争性，片段较短，易于扩增反应，因此，延伸时间控制在1min，适当增加扩增片段较长的dsmv引物的浓度，增加循环次数到40次可以提高3种病毒的扩增效果；
s12：经过多重rt-pcr的调整，得到的优化反应体系为：cdna2μl，dsmv引物(10μmol·l-1)2.0μl，cmv-1和cbdv-1引物(10μmol·l-1)各1.0μl，2×tagmix10.0μl，ddh2o补足至20μl，扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，增加循环数至40次；最后72℃延伸10min。
一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法可以应用于对本年度中芋不同生产区收集的疑似样品进行检测，结果发现dsmv的检出率是最高的，且在自然条件下检测到了同时感染dsmv和cmv的样本，但没有检测到同时感染dsmv、cmv和cbdv的植株，芋脱毒组培苗的检测中，没有发现带cmv和cbdv的感毒株。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
利用多重rt-pcr的方法，建立可同时检测芋花叶病毒(dsmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)和芋瘦小病毒(cbdv)的检测体系，根据genbank中dsmv、cmv和cbdv外壳蛋白的序列设计特异引物，并对多重rt-pcr的引物组合、退火温度、循环次数等参数进行了优化设计，建立了能同时检测3种芋病毒的多重rt-pcr方法，该方法能稳定地同时扩增出dsmv、cmv及cbdv特异片段，其大小分别为942、202和437bp，经过克隆、测序和比对分析，明确了检测出的病毒序列与已公布的病毒序列具有高度同源性，应用建立的芋病毒多重rt-pcr检测方法进行芋田间植株和组培苗的病毒检测，结果表明该方法可以快速、准确、高效和稳定地进行单一或复合芋病毒的检测。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
s1：采集疑似带病毒的芋植株叶片，样品经液氮快速冷冻后置于-80℃冰箱保存；
s2：采用植物totalrna提取试剂盒进行叶片总rna提取，反转录参照takara试剂盒操作方法进行，1.0μlprimeroligo(dt)、11μl总rna样品和depc处理水至反应管中，轻轻混匀并离心；
s3：将反应管置于abi7500pcr仪中65℃反应5min后，立即转移至冰上静置5min，之后于上述反应液体中加入4.0μl5×反转录酶缓冲液、1.0μlrnase抑制剂、1.0μl反转录酶及2.0μldntp，总体积调整至20μl，轻轻混匀并离心，将反应管置于pcr仪中42℃反应90min，70℃反应5min，反应结束后迅速放在冰上冷却备用；
s4：根据genbank公布的芋花叶病毒(dsmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)及芋瘦小病毒(cbdv)3种病毒外壳蛋白(cp)和actin基因序列，应用primerpremier5.0软件分别设计3种病毒和芋内参的特异性引物；
s5：以反转录cdna为模板，分别使用dsmv、cbdv和cmv病毒的特异性引物对样品进行pcr扩增，rt-pcr体系为20μl：2.0μlcdna，3种病毒的上游引物和下游引物(10μmol·l-1)各1.0μl，2×tagmix10.0μl，ddh2o补足至20μl，反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸10min，4℃保存；
s6：在单引物rt-pcr基础上，筛选扩增条带单一、稳定的引物并进行多重引物的组合，通过对rt-pcr条件：退火温度以及循环次数的调节，优化芋3种病毒的多重rt-pcr体系；
s7：rt-pcr反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，上样量为8μl，100v稳压电泳30分钟，凝胶紫外成像观察并拍照；
s8：芋3种病毒扩增出的单一产物，经过电泳分离割胶回收，并采用takara公司dna纯化试剂盒纯化，纯化后产物与pmd18-tvector连接，经热激转化dh5α后，通过pcr筛选获得阳性克隆，送至擎科生物技术有限公司进行测序。在ncbi上通过blast对克隆获得的序列进行比对分析；
s9：根据芋3种病毒各自的外壳(cp)蛋白保守序列分别设计引物10对(dsmv)、8对(cmv)和5对(cbdv)，同时通过软件dnaman分析引物间的互补性及引物的退火温度，结果发现当退火温度为56-58℃时，其扩增片段大小差异明显，获得3种病毒特异性引物(编号分别是dsmv、cmv-1和cbdv-1)，单一rt-pcr扩增产物分别为942、202和437bp特异性条带，同时利用筛选到的3种病毒的特异性引物，检测当年收集的疑似病毒植株，筛选出带有单个病毒的植株，作为该病毒的阳性对照；
s10：将带有dsmv、cmv和cbdv单个病毒的cdna混合作为3种病毒的阳性混合对照，以actin基因为内参，将病毒特异性引物dsmv，cmv-1，cbdv-1两两组合或三组混合，进行多重rt-pcr，发现可以获得引物组合目标的设计片段；
s11：多重rt-pcr体系的优化筛选中，退火温度设置在52℃，引物二聚体增多，扩增产物模糊，54-58℃产物比较稳定，在退火温度56℃，在相同条件下长片段引物的扩增产物较弱，这是由于在同一个rt-pcr体系中，引物存在竞争性，片段较短，易于扩增反应，因此，延伸时间控制在1min，适当增加扩增片段较长的dsmv引物的浓度，增加循环次数到40次可以提高3种病毒的扩增效果；
s12：经过多重rt-pcr的调整，得到的优化反应体系为：cdna2μl，dsmv引物(10μmol·l-1)2.0μl，cmv-1和cbdv-1引物(10μmol·l-1)各1.0μl，2×tagmix10.0μl，ddh2o补足至20μl，扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，增加循环数至40次；最后72℃延伸10min。
一种芋病毒的多重rt-pcr检测方法可以应用于对本年度中芋不同生产区收集的疑似样品进行检测，结果发现dsmv的检出率是最高的，且在自然条件下检测到了同时感染dsmv和cmv的样本，但没有检测到同时感染dsmv、cmv和cbdv的植株，芋脱毒组培苗的检测中，没有发现带cmv和cbdv的感毒株，对3种病毒扩增出的单一rt-pcr产物，经过回收、克隆、阳性筛选和测序，得到与目标片段大小相符的片段序列，将对应的序列提交至ncbi，进行blast比对分析，其中，dsmv扩增片段与中国的分离物同源性达到98％，与新西兰的分离物同源性达到95％。