本申请涉及数字pcr
技术领域：
，尤其涉及一种基于数字pcr用于血源筛查的引物、探针及试剂盒。
背景技术：
：为了保障临床用血的安全和血液制品的质量、防止供受血之间的交叉感染和采血及血液制品工作者的健康，必须防止乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等疾病的感染者进入供血队伍，防止上述疾病病原体阳性血浆直接输注病人或用于血液制品生产。目前，在临床上筛选各种血源性传播疾病的方法，主要是免疫学诊断方法。但由于受免疫学诊断方法的灵敏度及与生俱来的限制，依然不能完全杜绝阳性病毒血样的漏检，漏检率较高。其主要原因在于：免疫学诊断主要依赖抗原抗体介导的免疫反应，而病毒感染机体后，机体产生可检测水平的高滴度抗体的需要一段相对较长的时间。另外，由于个体免疫机能不同，其中有少数感染者感染后机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测限以下，甚至不产生抗体。因此，免疫学诊断方法不能检测出处于窗口期和新近感染病毒的献血员，这样势必导致漏检。其次，抗原出现变异以及稀有亚型也可导致漏检，因此，免疫学筛查后，输血相关疾病传播依然存在一定的概率。近5年来，随着以核酸检测(nucleicacidtest，nat)为代表的分子生物学技术在血液筛查方面的应用，输血及血制品安全性有了很大的提高。在理论上，nat技术能够显著缩短病原体检出的窗口期，nat技术灵敏度和特异性均较显著的高于免疫学方法。核酸检测hbv，hcv，hiv病毒的窗口期较抗体检测分别提前：9天、25天、14天。而应用nat技术筛查，可将献血员传播以上病毒性疾病的概率分别降低42％、72％和50％。除以上三种病毒外，梅毒的发病率近年来呈上升趋势，也是影响血液安全的一大因素。随着nat技术在临床检验中应用的日趋完善和成熟，现阶段在世界范围内开展大规模血液筛查多采用nat技术。应用最多最常见的nat技术是荧光-pcr(taqman技术)，但是，荧光pcr定量时需要标准品，是一种相对定量方法，结果判断依赖扩增效率，抑制剂耐受性较低。技术实现要素：鉴于
背景技术：
中存在的问题，本申请的目的在于提供一种基于数字pcr用于血源筛查的引物、探针及试剂盒。为了达到上述目的，本申请的第一方面提供了一种基于数字pcr用于血源筛查的引物组合，包括hbv检测引物、hcv检测引物、hiv1检测引物、hiv2检测引物和内标检测引物；所述hbv检测引物包括核苷酸序列如seqidno.1所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的下游引物；所述hcv检测引物包括核苷酸序列如seqidno.4所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.5所示的下游引物；所述hiv1检测引物包括核苷酸序列如seqidno.7所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的下游引物；所述hiv2检测引物包括核苷酸序列如seqidno.10所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.11所示的下游引物；所述内标检测引物包括核苷酸序列如seqidno.13所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.14所示的下游引物。优选地，本申请所提供的用于血源筛查的引物组合，还包括tp检测引物，所述tp检测引物包括核苷酸序列如seqidno.16所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.17所示的下游引物。本申请的第二方面提供了一种基于数字pcr用于血源筛查的探针组合，包括hbv检测探针、hcv检测探针、hiv1检测探针、hiv2检测探针和内标检测探针；所述hbv检测探针的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述hcv检测探针的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述hiv1检测探针的核苷酸序列如seqidno.9所示；所述hiv2检测探针的核苷酸序列如seqidno.12所示；所述内标检测探针的核苷酸序列如seqidno.15所示；所述hbv检测探针、hcv检测探针、hiv1检测探针、hiv2检测探针和内标检测探针上标记有荧光报告基团和荧光猝灭基团。优选地，本申请所提供的基于数字pcr用于血源筛查的探针组合，还包括tp检测探针，所述tp检测探针的核苷酸序列如seqidno.18所示，所述tp检测探针上标记有荧光报告基团和荧光猝灭基团。优选地，本申请所提供的基于数字pcr用于血源筛查的探针组合中，所述hbv检测探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1荧光猝灭基团；所述hcv检测探针的5’端标记hex荧光基团，3’端标记bhq1荧光猝灭基团；所述hiv1检测探针的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2荧光猝灭基团；所述hiv2检测探针的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2荧光猝灭基团；所述内标检测探针的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq3荧光猝灭基团；所述tp检测探针的5’端标记alexafluor700荧光基团，3’端标记bbq650荧光猝灭基团。本申请的第三方面提供一种基于数字pcr用于血源筛查的试剂盒，包括hbv检测引物及探针、hcv检测引物及探针、hiv1检测引物及探针、hiv2检测引物及探针和内标检测引物和探针；所述hbv检测引物包括核苷酸序列如seqidno.1所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的下游引物，所述hbv检测探针的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述hcv检测引物包括核苷酸序列如seqidno.4所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.5所示的下游引物，所述hcv检测探针的核苷酸序列如seqidno.6所示；所述hiv1检测引物包括核苷酸序列如seqidno.7所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的下游引物，所述hiv1检测探针的核苷酸序列如seqidno.9所示；所述hiv2检测引物包括核苷酸序列如seqidno.10所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.11所示的下游引物，所述hiv2检测探针的核苷酸序列如seqidno.12所示；所述内标检测引物包括核苷酸序列如seqidno.13所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.14所示的下游引物，所述内标检测探针的核苷酸序列如seqidno.15所示；所述hbv检测探针、hcv检测探针、hiv1检测探针、hiv2检测探针和内标检测探针上标记有荧光报告基团和荧光猝灭基团。优选地，本申请所提供的基于数字pcr用于血源筛查的试剂盒还包括tp检测引物和探针，所述tp检测引物包括核苷酸序列如seqidno.16所示的上游引物和核苷酸序列如seqidno.17所示的下游引物，所述tp检测探针的核苷酸序列如seqidno.18所示，所述tp检测探针上标记有荧光报告基团和荧光猝灭基团。优选地，本申请所提供的基于数字pcr用于血源筛查的试剂盒中，所述hbv检测探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1荧光猝灭基团；所述hcv检测探针的5’端标记hex荧光基团，3’端标记bhq1荧光猝灭基团；所述hiv1检测探针的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2荧光猝灭基团；所述hiv2检测探针的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2荧光猝灭基团；所述内标检测探针的5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq3荧光猝灭基团；所述tp检测探针的5’端标记alexafluor700荧光基团，3’端标记bbq650荧光猝灭基团。优选地，本申请所提供的基于数字pcr用于血源筛查的试剂盒还包括dpcrbuffer、酶、无核酶水、阴性对照、阳性对照和内标。优选地，本申请所提供的基于数字pcr用于血源筛查的试剂盒中，所述阳性对照为含hbv、hcv、hiv特异性片段的假病毒；所述内标为含人工设计特异性序列的rna假病毒。采用本申请所提供的试剂盒进行血源筛查的方法包括以下步骤：步骤1：从血清或者血浆样本中提取核酸。步骤2：将样本、阳性对照、阴性对照提取核酸加入pcr反应体系，完成液滴制备。步骤3：对步骤2液滴进行数字pcr扩增和结果定量分析。相对于现有技术而言，本发明基于数字pcr技术，提供了用于血源筛查的引物组合、探针组合及包括了上述引物组合和探针组合的试剂盒。本申请所提供的试剂盒根据hbv、hcv、hiv、tp的基因序列设计扩增引物和taqman探针，特异性检测目标基因，检测位点的筛选主要标准为序列保守，无重复序列。使用本申请所提供的试剂盒，无需标准曲线，即可绝对定量，其对hbv、hcv、hiv及tp检测的灵敏度相比荧光pcr提高10倍以上，病原体检出的窗口期进一步缩短。具体实施方式实施例1本实施例是一种基于数字pcr血源筛查试剂盒的具体应用例。本实施例中所提供的试剂盒根据hbv、hcv、hiv的基因序列设计扩增引物和taqman探针，特异性检测目标基因，检测位点的筛选主要标准为序列保守，无重复序列。hbv检测位点探针标记为fam，hcv探针标记为hex，hiv探针标记为rox，内标探针标记为cy5。本实施例的试剂盒中，所包括的引物和探针及其设计原则如下：引物和探针设计原则：采用primerexpress3.0.1对筛选到的序列进行引物和探针设计，引物退火温度在59℃左右，探针退火温度在68℃左右，不易形成二聚体和发夹结构，gc含量正常，检测的扩增范围在65-250bp，并进行引物和探针特异性检测。引物和探针的核苷酸序列如下表1所示：表1实施例1引物和探针序列表使用本实施例的试剂盒进行检测的方法如下：1、待测样本制备使用磁珠法病毒核酸提取试剂盒提取1ml血清或者血浆样本中病毒dna/rna备用，阴阳性对照与样本同步处理(提取时加入内标)。2、试剂配制按照下表2配方制备数字pcr反应液(推荐数字pcr反应体系，1个反应)：表2实施例1数字pcr反应液组分体积10×dpcrbuffer3.5μl酶1.0μl引物和探针2.8μl检测模板1.0～17.5μl总体积用无核酶水补至30～35μl将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30秒，瞬时离心将反应液收集于管底后置于冰上待用。3、按照下表3制备油相混合液(1个反应)：表3实施例1油相混合液按上表配方将反应油相混合后，涡旋混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，置于冰上待用(注：混合后的油相混合液请在30min以内使用)。4、芯片进样(1)本发明使用上海小海龟科技有限公司数字pcr系统biodigital·青，系统为5路荧光通道(fam、hex、rox、cy5、alexafluor700)，可并行处理96个样本，芯片有效液滴数为20万个，每样本检测使用1张生物芯片。(2)进样操作按照数字pcr进样仪使用操作说明书的要求，开启芯片进样程序，完成芯片进样。5、芯片热循环反应将芯片置于核酸扩增仪的芯片槽内，进行热循环反应，反应程序如下表4：表4实施例1反应程序6、芯片阅读分析热循环反应结束后将芯片移至生物芯片阅读仪上，按照生物芯片阅读仪使用操作说明书的要求进行阅读分析，得到每个荧光通道拷贝数，并计算每个样本中hbv、hcv、hiv、内标浓度。7、结果判定质控：阳性对照fam、hex、rox、cy5通道拷贝数≥200copies/ml；阴性对照fam、hex、rox通道无拷贝数，cy5通道拷贝数≥200copies/ml；以上要求需同时满足，否则实验无效。样本结果判定见下表5：表5实施例1结果判定复测结果仍在灰区，判定为阳性。实施例2本实施例是另一种基于数字pcr用于血源筛查的试剂盒的具体应用例。本实施例中所提供的试剂盒根据hbv、hcv、hiv、tp的基因序列设计扩增引物和taqman探针，特异性检测目标基因，检测位点的筛选主要标准为序列保守，无重复序列。hbv检测位点探针标记为fam，hcv探针标记为hex，hiv探针标记为rox，内标探针标记为cy5，tp探针标记为alexafluor700。本实施例的试剂盒中，所包括的引物和探针及其设计原则如下：引物和探针设计原则：采用primerexpress3.0.1对筛选到的序列进行引物和探针设计，引物退火温度在59℃左右，探针退火温度在68℃左右，不易形成二聚体和发夹结构，gc含量正常，检测的扩增范围在65-250bp，并进行引物和探针特异性检测。引物和探针的核苷酸序列如下表6：表6实施例2引物和探针序列表使用本实施例的试剂盒进行检测的方法如下：1、待测样本制备使用磁珠法病毒核酸提取试剂盒提取1ml血清或者血浆样本中病毒dna/rna备用，阴阳性对照与样本同步处理(提取时加入内标)。2、试剂配制按照下表7配方制备数字pcr反应液(推荐数字pcr反应体系，1个反应)：表7实施例2数字pcr反应液将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30秒，瞬时离心将反应液收集于管底后置于冰上待用。3、按照下表8制备油相混合液(1个反应)：表8实施例2油相混合液组分用量油相a30μl油相b10μl总计40μl按上表配方将反应油相混合后，涡旋混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，置于冰上待用(注：混合后的油相混合液请在30min以内使用)。4、芯片进样(1)本发明使用上海小海龟科技有限公司数字pcr系统biodigital·青，系统为5路荧光通道(fam、hex、rox、cy5、alexafluor700)，可并行处理96个样本，芯片有效液滴数为20万个，每样本检测使用1张生物芯片。(2)进样操作按照数字pcr进样仪使用操作说明书的要求，开启芯片进样程序，完成芯片进样。5、芯片热循环反应将芯片置于核酸扩增仪的芯片槽内，进行热循环反应，反应程序如下表9所示：表9实施例2反应程序6、芯片阅读分析热循环反应结束后将芯片移至生物芯片阅读仪上，按照生物芯片阅读仪使用操作说明书的要求进行阅读分析，得到每个荧光通道拷贝数，并计算每个样本中hbv、hcv、hiv、tp、内标浓度。7、结果判定质控：阳性对照fam、hex、rox、alexafluor700通道拷贝数≥200copies/ml；阴性对照fam、hex、rox、alexafluor700通道无拷贝数，cy5通道拷贝数≥200copies/ml；以上要求需同时满足，否则实验无效。样本结果判定见下表10：表10实施例2结果判定复测结果仍在灰区，判定为阳性。根据上述说明书的揭示和教导，本领域技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本申请并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本申请的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本申请构成任何限制。sequencelisting<110>湖南圣洲生物科技有限公司<120>基于数字pcr用于血源筛查的引物、探针及试剂盒<130>191570cn-ch-i<160>18<170>patentinversion3.3<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列<400>1ttactagygccatttgttcagtggtt26<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列<400>2cccaataccacatcatccatataact26<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3tagggctttcccccactgtytggc24<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4cggaattgccggaaagr17<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5tttggtttttctttgaggtttagga25<210>6<211>27<212>dna<213>人工序列<400>6tctcgtagaccgtgcatcatgagcaca27<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7tgcacacatctagaaggaaaagtca25<210>8<211>28<212>dna<213>人工序列<400>8tgctgggataacttctgcttctatatat28<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<400>9cctggtagcagtccacgtggcca23<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10atggccccaacttcacttca20<210>11<211>26<212>dna<213>人工序列<400>11ttaggtggtgattcattgcttctact26<210>12<211>29<212>dna<213>人工序列<400>12tggagtaccttacaacccacaaagccagg29<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<400>13tttctctctggcttttaggtcgtt24<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14gccactggtgtaatgatgaatatca25<210>15<211>29<212>dna<213>人工序列<400>15tactaacattgctggtctcgtcaccccct29<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列<400>16attgtgaaacggatggattgc21<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17aagcctctgcttcctgaaagc21<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列<400>18tccgcacgatacacgtctggtcg23当前第1页1 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