来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的纳米囊泡及其用途的制作方法

1.本发明涉及来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的纳米囊泡及其用途，更特别地，涉及使用来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的纳米囊泡来诊断肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎等的方法，包含所述囊泡的用于预防、缓解或治疗所述疾病的组合物，包含所述囊泡的用于递送治疗脑部疾病的药物的组合物等。
2.本申请要求分别于2018年12月10日和2019年10月23日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请号kr10
‑
2018
‑
0158623和kr10
‑
2019
‑
0132138的专利申请的优先权和权益，并且这些申请的说明书和附图中公开的所有内容被并入本申请中。


背景技术：

3.自21世纪初以来，在过去被认为是流行病的急性传染病变得不再那么重要了，而由于人与微生物组之间的不和谐而导致的伴随免疫功能低下的慢性疾病已经改变了疾病模式，成为决定生存质量和人类寿命的主要疾病。作为21世纪的顽固性慢性疾病，癌症、心血管疾病、慢性变应性肺部疾病、代谢性疾病和神经精神疾病已成为国家公共卫生的重要问题，成为决定人类寿命和生存质量的主要疾病。
4.众所周知，人体中共存的微生物数量已达到100万亿，是人体细胞数量的10倍，微生物基因数量是人体基因数量的100倍以上。微生物群或微生物组是指微生物群落，包括存在于给定栖息环境中的细菌、古细菌和真核生物。
5.我们体内共存的细菌和周围环境中存在的细菌会分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换有关基因、低分子化合物、蛋白质等的信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒无法通过该物理防御膜，因此，共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但是来源于细菌的囊泡的大小为100纳米或更小并通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞后被吸收到我们体内。细菌局部分泌的来源于细菌的囊泡经粘膜上皮细胞吸收，从而引起局部炎症反应，而穿过上皮细胞的囊泡经淋巴管系统吸收，从而分布在各个器官中，免疫和炎症反应在囊泡分布的器官中受到调节。例如，来源于致病性革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的囊泡在通过血管吸收时局部诱导炎症反应和癌症，并通过血管内皮细胞炎症反应促进全身性炎症反应和血液凝固。另外，这些囊泡被吸收到胰岛素等作用于其上的肌肉细胞中，从而引起胰岛素抵抗和糖尿病。相反，来源于有益细菌的囊泡可通过调节致病囊泡的免疫功能和代谢功能障碍来调节疾病。
6.作为对诸如来源于细菌的囊泡之类的因子的免疫反应，出现以白介素(以下简称il)
‑
17细胞因子分泌为特征的th17免疫反应，当暴露于来源于细菌的囊泡时，上皮细胞和免疫细胞分泌il
‑
6，从而诱导th17免疫反应。th17免疫反应引起的炎症以中性粒细胞浸润为特征，在炎症发生过程中，诸如中性粒细胞和巨噬细胞之类的炎性细胞分泌的肿瘤坏死因子
‑
α(以下称tnf
‑
α)在炎症和肿瘤发生中起重要作用。
7.属于鞘氨醇单胞菌属的细菌是需氧性革兰氏阴性细菌，广泛存在于自然界例如
水、土壤和植物根中，而其他革兰氏阴性细菌在细胞外膜中具有脂多糖(lps)，而属于鞘氨醇单胞菌属的细菌在细胞外膜中具有鞘糖脂(gsl)。鞘氨醇单胞菌属的二十种是已知的，并且其中少动鞘氨醇单胞菌已被报道导致人类医院获得性感染。然而，尚未报道将来源于鞘氨醇单胞菌属的细菌(包括上述细菌)的囊泡用于诊断和治疗诸如癌症、心血管疾病和特应性皮炎之类的不可治愈的疾病的情况。
8.因此，在本发明中，证实了，通过确认在患有肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的患者的临床样本中的来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡与正常个体相比显著减少，从而可以诊断疾病。此外，通过从属于鞘氨醇单胞菌属的少动鞘氨醇单胞菌和韩国鞘氨醇单胞菌分离囊泡并分析其特性，证实了所述囊泡可以用作用于预防或治疗诸如肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎之类的疾病的组合物。此外，已经证实当口服施用囊泡时，可以将药物递送至大脑。


技术实现要素：

9.[技术问题]
[0010]
为了解决上述问题，经过深入研究，本发明的发明人通过宏基因组学分析证实，在患有肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的患者的样本中来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的含量与正常个体相比显著降低。还证实了，当从少动鞘氨醇单胞菌和韩国鞘氨醇单胞菌(其是属于鞘氨醇单胞菌属的细菌)中分离出囊泡并用其处理巨噬细胞时，致病性囊泡分泌il
‑
6和tnf
‑
α受到显著抑制，从而基于这些发现完成了本发明。
[0011]
因此，本发明的一个目的是提供一种诊断一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的方法，或提供诊断信息的方法。
[0012]
此外，本发明的另一个目的是提供用于预防、缓解或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的组合物，其包括来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为有效成分。
[0013]
另外，本发明的另一个目的是提供用于递送治疗脑部疾病的药物的组合物，其包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分。
[0014]
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。
[0015]
[技术方案]
[0016]
为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供了一种提供用于诊断一种或多种疾病的信息的方法，所述疾病选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎，所述方法包括以下步骤：(a)从分离自正常个体和受试者的样本的囊泡中提取dna；(b)使用一对基于16s rdna中存在的基因序列制备的引物对提取的dna进行聚合酶链式反应(pcr)，以获得每种pcr产物；和(c)通过对pcr产物进行定量分析，将其中来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡含量
低于所述正常个体样本的囊泡含量的情况确定为选自以下的一种或多种疾病：肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎。
[0017]
此外，本发明提供了一种诊断一种或多种疾病的方法，所述疾病选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎，所述方法包括以下步骤：(a)从分离自正常个体和受试者的样本的囊泡中提取dna；(b)使用一对基于16s rdna中存在的基因序列制备的引物对提取的dna进行聚合酶链式反应(pcr)，以获得每种pcr产物；和(c)通过对pcr产物进行定量分析，将其中来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡含量低于所述正常个体样本的囊泡含量的情况确定为选自以下的一种或多种疾病：肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎。
[0018]
作为本发明的一示例性实施方案，步骤(a)中的样本可以是血液或尿液。
[0019]
作为本发明的另一实施方案，步骤(b)中的引物对可以是包含由seq id no.1和2表示的碱基序列的引物对。
[0020]
此外，本发明提供了一种用于预防、缓解或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的组合物，其包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分。
[0021]
该组合物可以包含药物组合物，食物组合物和化妆品组合物。
[0022]
此外，本发明提供了一种预防或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的方法，所述方法包括将包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分的组合物施用给受试者的步骤。
[0023]
此外，本发明提供了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡用于预防或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的用途。
[0024]
此外，本发明提供了包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分的组合物用于预防或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的用途。
[0025]
另外，本发明提供了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡用于生产用于一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的药物的用途。
[0026]
此外，本发明提供了将药物递送到大脑的药物载体组合物(或用于递送治疗脑部疾病的药物的组合物)，其包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分。
[0027]
此外，本发明提供了递送用于治疗脑部疾病的药物的方法，所述方法包括向受试者施用包含来源于属于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的组合物，其中装载有用于治疗靶标脑部疾病的药物作为活性成分。
[0028]
另外，本发明提供了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡用于递送用于治疗脑部疾
病的药物的用途。
[0029]
作为本发明的一示例性实施方案，囊泡可具有10至200nm的平均直径。
[0030]
作为本发明的另一示例性实施方案，囊泡可以从鞘氨醇单胞菌属细菌天然或人工地分泌。
[0031]
作为本发明的又一实施方案，可以通过对细菌进行诸如热处理或加压处理之类的方法来分泌囊泡。
[0032]
作为本发明的又一实施方案，来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡可以由少动鞘氨醇单胞菌分泌。
[0033]
作为本发明的另一实施方案，来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡可以从韩国鞘氨醇单胞菌分泌。
[0034]
[有益效果]
[0035]
本发明人证实细菌没有被吸收到体内，但是来源于细菌的囊泡通过上皮细胞被吸收到体内，全身分布，并通过肾脏、肝脏和肺从体内排泄，并且通过宏基因组分析患者血液中存在的来源于细菌的囊泡，来源于存在于患有肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的患者血液或尿液中的鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡与正常个体相比已显著减少。另外，观察到当离体(ex vivo)培养鞘氨醇单胞菌属细菌少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonas paucimobilis)和韩国鞘氨醇单胞菌(sphingomonas koreensis)、分离囊泡并离体施用于炎症细胞的情况下，致病性囊泡的炎性介质的分泌被显著抑制。另外，观察到当口服少动鞘氨醇单胞菌囊泡时，所述囊泡被递送至大脑。因此，根据本发明的来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡可用作诊断肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的方法，以及用作为用于预防、缓解或治疗所述疾病的组合物，例如化妆品、食品或药物，并且可以预期将其有效地用作将药物递送至脑部的药物载体。
附图说明
[0036]
图1a是在将细菌和来源于细菌的囊泡(ev)口服施用于小鼠后捕获细菌和来源于细菌的囊泡的随时间的分布模式的一系列照片。图1b是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。
[0037]
图2是评估在向小鼠的肠内施用细菌和来源于细菌的囊泡(lu，肠腔(gut lumen)；lp，肠固有层(gut lamina propria))后细菌和来源于细菌的囊泡(ev)是否渗透到肠粘膜上皮细胞中的图。
[0038]
图3是在对存在于肝硬化患者、肝癌患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析之后，比较来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0039]
图4是在对存在于心肌梗塞患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析之后，比较来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0040]
图5是在对存在于肾功能不全患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析之后，比较来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0041]
图6是在对存在于糖尿病患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析之后，比较来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0042]
图7是在对存在于脑肿瘤患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0043]
图8是在对存在于轻度认知障碍患者、阿尔茨海默氏痴呆患者和正常个体的血液中的细菌衍生囊泡进行宏基因组分析后，比较了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡分布的结果。
[0044]
图9是在对存在于抑郁症患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0045]
图10是在对存在于自闭症患者和正常个体的尿液中的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析之后，比较来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0046]
图11是在对存在于特应性皮炎患者和正常个体的血液和尿液中的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析之后，比较来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布的结果。
[0047]
图12是通过用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡处理小噬细胞(microphage)(raw264.7细胞)来评估凋亡的结果，以便评估来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡(ev，胞外囊泡)的凋亡作用。
[0048]
图13a和图13b是通过用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡处理巨噬细胞(raw264.7细胞)比较炎性介质与大肠杆菌ev(其为致病性囊泡)的分泌水平以评估来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡的炎症诱导作用的结果。图13a比较了il
‑
6的分泌水平，图13b比较了tnf
‑
α的分泌水平(ev：胞外囊泡)。
[0049]
图14a和图14b是在用大肠杆菌ev(为致病性囊泡的)处理之前，通过用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡进行预处理来评估大肠杆菌ev对炎性介质分泌的作用的结果，以评估来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡的抗炎作用。来源于鞘氨醇单胞菌的囊泡。图14a比较了il
‑
6的分泌水平，图14b比较了tnf
‑
α的分泌水平(spc101，少动鞘氨醇单胞菌ev；ev，胞外囊泡)。
[0050]
图15a和15b是在用大肠杆菌ev(为致病性囊泡的)进行处理之前，通过用来源于韩国鞘氨醇单胞菌的囊泡进行预处理来评估大肠杆菌ev对炎性介质分泌的作用的结果，以评估来源于韩国鞘氨醇单胞菌的囊泡的抗炎作用。图15a比较了il
‑
6的分泌水平，图15b比较了tnf
‑
α的分泌水平(spc102，韩国鞘氨醇单胞菌ev；ev，胞外囊泡)。
[0051]
图16是在将来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡口服施用于小鼠之后捕获来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡的随时间的分布模式的一系列照片。
[0052]
图17是在将来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡口服施用于小鼠后来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡在脑组织中随时间的分布模式的一系列视图。
具体实施方案
[0053]
本发明涉及来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡及其用途。
[0054]
本发明人通过宏基因组学分析证实，与来源于正常个体的样本相比，在来源于患有肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的患者的样本中来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡含量显著降低，从而基于此完成了本发明。
[0055]
因此，本发明提供了一种诊断一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不
全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的方法，或一种提供用于诊断所述疾病的信息的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从分离自正常个体和受试者的样本的囊泡中提取dna；(b)使用一对基于16s rdna中存在的基因序列制备的引物对提取的dna进行聚合酶链式反应(pcr)，以获得每种pcr产物；和(c)通过对所述pcr产物进行定量分析，将其中来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡含量低于所述正常个体样本的囊泡含量的情况确定为选自以下的一种或多种疾病：肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎。
[0056]
如本文所用，术语“诊断”在广义上是指在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病实体，病因，发病机理，严重程度，疾病的详细方面，是否存在并发症，预后等。本发明中的诊断意味着确定是否发生肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症或特应性皮炎，疾病的程度等。
[0057]
如本文所用，术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由从各种细菌分泌的纳米尺寸的膜组成的结构。来源于革兰氏阴性细菌的囊泡或外膜囊泡(omv)具有内毒素(脂多糖)或鞘糖脂，有毒蛋白质以及细菌dna和rna，来源于革兰氏阳性细菌的囊泡除了蛋白质和核酸外还具有肽聚糖和脂蛋白酸，它们也是细菌的细胞壁成分。在本发明中，纳米囊泡或囊泡从鞘氨醇单胞菌属细菌天然分泌或通过对细菌进行热处理、加压处理等人工产生，并且具有10至200nm的平均直径。
[0058]
如本文所用，术语“宏基因组”也指微生物组，是指在诸如土壤和动物的肠等分离区域中包括所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且通常用作基因组的概念，用来解释通过使用序列分析仪一次识别大量微生物以分析未培养微生物。特别地，该宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是一个由产生完整物种的观点衍生的术语，完整物种是由各种相互作用的物种以及一类功能上既存的物种构成的。从技术上讲，宏基因组是一种技术的目标，该技术可以在一种环境中识别所有物种，并通过使用快速序列分析方法分析所有dna和rna来研究相互作用和代谢，而不考虑物种。
[0059]
可通过使用一种或多种选自离心，超高速离心，高压处理，挤压，超声处理，细胞裂解，均质化，冻融，电穿孔，机械分解，化学处理，过滤器过滤，凝胶过滤色谱，自由流动电泳和毛细管电泳的方法，从包含鞘氨醇单胞菌属细菌的培养液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如洗涤以去除杂质和浓缩所获得的囊泡的过程。
[0060]
在本发明中，步骤(a)中的样本可以是血液或尿液，但不限于此。
[0061]
在本发明中，步骤(b)中的引物对可以是包含由seq id no.1和2表示的碱基序列的引物对，但不限于此。
[0062]
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防、缓解或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的组合物，其包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分。
[0063]
该组合物包括药物组合物，食品组合物和化妆品组合物。
[0064]
作为本发明的另一方面，本发明提供了一种预防或治疗一种或多种选自肝硬化、
肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的方法，该方法包括以下步骤：将包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分的组合物施用给受试者。
[0065]
作为本发明的另一方面，本发明提供了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡用于预防或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的用途。
[0066]
作为本发明的另一方面，本发明提供了包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡作为活性成分的组合物用于预防或治疗一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的用途。
[0067]
作为本发明的另一方面，本发明提供了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡用于生产用于一种或多种选自肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的疾病的药物的用途。
[0068]
作为本发明的另一方面，本发明提供了一种递送用于治疗脑部疾病的药物的方法，该方法包括向受试者施用包含来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的组合物，其中将用于治疗靶标脑部疾病的药物加载作为有效成分。
[0069]
作为本发明的另一方面，本发明提供了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡在递送用于治疗脑部疾病的药物中的用途。
[0070]
如本文所用，术语“预防”是指通过施用根据本发明的组合物抑制肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎等或延迟其发作的所有行为。
[0071]
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物缓解或有益地改变肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎等的症状的所有行为。
[0072]
如本文所用，术语“缓解”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数例如症状的程度的所有行为。
[0073]
如本文所用，术语“药物载体”是指在根据本发明的组合物中装载和输送药物以将药物输送至特定器官，组织，细胞或细胞器的所有方式或行为。
[0074]
在本发明的一实施方案中，通过对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡并观察该细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式，可以证实尽管细菌不通过肠粘膜吸收，来源于细菌的囊泡在施用后5分钟内被吸收并全身分布，并通过肾脏、肝脏等排出(参见实施例1)。
[0075]
在本发明的另一示例性实施方案中，评估了直接施用于肠的细菌和来源于细菌的囊泡是否通过了粘膜的保护膜，并且证实了细菌未能通过粘膜的保护膜，而来源于细菌的囊泡则穿过粘膜的保护膜。(参见实施例2)。
[0076]
在本发明的另一示例性实施方案中，使用从患有肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的患者以及与患者年龄和性别相匹配的正常个体的血液或尿液分离的囊泡来进行细菌宏基因组分析。结果证实，与正常个体的样本相比，在患有肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的患者的临床样本中来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡显著减少。(参见实施例4至12)。
[0077]
在本发明的又一示例性实施方案中，通过培养少动鞘氨醇单胞菌菌株和韩国鞘氨醇单胞菌菌株来评估从所述菌株分泌的囊泡的炎症诱导作用，并且通过用各种浓度的来源于细菌的囊泡处理巨噬细胞、然后用来源于大肠杆菌(e.coli)的囊泡(其为致病性囊泡)处理巨噬细胞，来比较炎性介质的分泌水平，结果证实了与来源于大肠杆菌的囊泡分泌的il
‑
6和tnf
‑
α相比，来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡显著降低了待分泌的炎性介质的分泌能力(参见实施例14)。
[0078]
在本发明的又一示例性实施方案中，评估了来源于少动鞘氨醇单胞菌和韩国鞘氨醇单胞菌菌株的囊泡的抗炎作用，并且通过在用来源于大肠杆菌的囊泡(其为致病性囊泡)处理之前，用各种浓度的来源于少动鞘氨醇单胞菌和韩国鞘氨醇单胞菌菌株的囊泡处理巨噬细胞之后评估炎性介质的分泌，结果证实了所述囊泡有效抑制了来源于诱导炎症的大肠杆菌的囊泡的il
‑
6和tnf
‑
α的分泌(参见实施例15和16)。
[0079]
在本发明的又一示例性实施方案中，已证实，当口服施用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡时，上述囊泡从经过1小时的时间点开始分布在胃中，从经过3小时的时间点开始甚至分布在小肠和大肠中，证实了在这些器官中的分布一直保持到72小时。此外，已经证实，荧光标记的来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡从3小时开始特异性地移动到大脑，并且增加直到32小时，然后逐渐减少直到经过72小时的时间点(参见实施例17)。
[0080]
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，包括盐水(saline)，无菌水，林格氏溶液，缓冲盐水，环糊精，葡萄糖溶液，麦芽糖糊精溶液，甘油，乙醇，脂质体等，但不限于此，并且如果需要，它们可以进一步包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂，分散剂，表面活性剂，粘合剂，润滑剂等，将组合物配制成可注射制剂，例如水溶液，混悬液和乳剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用雷明顿文献中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但是可以配制成注射剂，吸入剂，皮肤外用剂，口服剂等。
[0081]
本发明的药物组合物可以根据目标方法口服给药或胃肠外给药(例如静脉内，皮下，皮内给药)，并且给药剂量可以根据患者的状况和体重、疾病严重程度、药物形式以及给药途径和给药时间而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。
[0082]
以药学有效量施用根据本发明的药物组合物。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理的受益/风险比来治疗疾病的量，并且可以根据包括患者的疾病类型、疾病严重程度、药物活性、药物敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗时间和同时使用的药物、以及其他医学领域众所周知的因素的因素来确定有效剂量水平。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以能够获得最大效果而没有任何副作用的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。
[0083]
具体而言，根据本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄，性别和体重而变化，并且可以根据给药途径，肥胖症的严重程度，性别，体重，年龄等而增加或减少。
[0084]
本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是
可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或缓解)适当确定。通常，当制备食品或饮料时，以原料为基准，本发明的组合物的添加量为15wt％或更低，优选为10wt％或更低。但是，出于健康和卫生目的或出于健康控制目的而长期摄入时，该添加量可以小于上述范围。
[0085]
除了本发明的食品组合物以指定比例包含活性成分作为必需成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可以像典型的饮料一样包含各种调味剂、天然碳水化合物等作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例包括普通糖，例如单糖，例如葡萄糖，果糖等；二糖，例如麦芽糖，蔗糖等；多糖，例如糊精，环糊精等，以及糖醇如木糖醇，山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(奇异果甜蛋白，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙a，甘草甜素等)和合成调味剂(糖精，阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。
[0086]
本发明的食品组合物除了所述添加剂以外，还可以包含各种营养素，维生素，矿物质(电解质)，调味剂例如合成调味剂和天然调味剂，着色剂和填充剂(奶酪，巧克力等)，果胶酸及其盐，海藻酸及其盐，有机酸，保护性胶体增稠剂，ph调节剂，稳定剂，防腐剂，甘油，醇类，碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。
[0087]
本发明的化妆品组合物不仅可以包括来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡，而且可以包括化妆品组合物中常用的成分，并且可以包括例如一般的佐剂，例如抗氧化剂，稳定剂，增溶剂，维生素，色素和草药以及载体。
[0088]
另外，本发明的组合物除了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡以外，还可以包含在不会通过与来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡反应而对皮肤保护作用产生有害影响的范围内长期使用的有机紫外线阻隔剂的混合物。有机紫外线阻隔剂可以是选自以下的一种或多种：甘油基paba，甲酚曲唑三硅氧烷，甲酚曲唑，二没食子酰三油酸酯，苯基二苯并咪唑四磺酸酯二钠，二乙基己基丁酰胺基三嗪酮，二乙氨基羟基苯甲酰基己基苯甲酸酯，dea
‑
甲氧基肉桂酸酯，指甲花醌和二羟基丙酮的混合物，亚甲基双
‑
苯并三唑基四甲基丁基酚，4
‑
甲基苯亚甲基樟脑，邻氨基苯甲酸薄荷酯，二苯甲酮
‑
3(氧苯甲酮)，二苯甲酮
‑
4，二苯甲酮
‑
8(二氧苯甲酮)，丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷，双乙基己基氧基苯酚甲氧基苯基三嗪，肉桂酸酯，乙基二羟丙基paba，奥克立林(octocrylene)，乙基己基二甲基paba，乙基己基甲氧基肉桂酸酯，乙基己基水杨酯，乙基己基三嗪酮，对甲氧基肉桂酸异戊酯，聚硅氧烷
‑
15(dimethicodiethylbenzal malonate)，对苯二亚甲基二樟磺酸及其盐，tea
‑
水杨酸酯和对氨基苯甲酸(paba)。
[0089]
可以添加本发明的化妆品组合物的产品的实例包括化妆品，例如收敛剂，皮肤柔软剂，滋养调色剂，各种乳膏，香精，面膜，粉底等，清洁剂，洗面奶，肥皂，护理剂，美容液等。本发明的化妆品组合物的特定制剂包括皮肤乳液，皮肤柔软剂，皮肤调色剂，收敛剂，乳液，牛奶乳液，保湿乳液，营养乳液，按摩霜，营养霜，保湿霜，护手霜，香精，滋养香精，面膜，肥皂，洗发水，清洁泡沫，清洁乳液，清洁霜，身体乳液，沐浴露，乳剂，口红，隔离霜(makeup base)，粉底，压粉，散粉，眼影等。
[0090]
在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
[0091]
实施例
[0092]
实施例1.细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收，分布和排泄模式的分析
[0093]
为了评估细菌和来源于细菌的囊泡是否通过胃肠道被全身吸收，用以下方法进行了实验。首先，将荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡各50μg的剂量口服给予小鼠的胃，并且在0分钟，5分钟，3小时，6小时和12小时之后测量荧光。观察小鼠的整个图像，如图1a所示，结果显示了细菌没有被全身吸收，但是在施用后5分钟来源于细菌的囊泡被全身吸收了，并且在施用后3小时在膀胱中观察到明显的荧光，因此可以看出囊泡被排泄到尿道中。此外，可以看出囊泡存在于体内直到施用后12小时(见图1a)。
[0094]
为了评估其中的细菌和来源于细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，并且然后在施用后12小时收集血液，心脏，肺，肝脏，肾脏，脾脏，脂肪和肌肉。观察收集到的组织中的荧光，如图1b所示，可以看出，来源于细菌的囊泡分布在血液，心脏，肺，肝脏，脾脏，脂肪，肌肉和肾脏中，但是细菌没有被吸收(见图1b)。
[0095]
实施例2.评估细菌和来源于细菌的囊泡是否穿透肠粘膜保护膜
[0096]
为了评估细菌和来源于细菌的囊泡是否穿过粘膜保护膜以渗透到组织中，在将细菌和来源于细菌的囊泡直接施用于肠后，通过免疫组织化学方法评价在通过粘膜保护膜后肠道组织的渗透情况。为了评估粘膜组织中细菌和囊泡的存在，制备了针对细菌和囊泡的抗体，将其附着在绿色荧光蛋白(gfp)上并使用，并在用4,6
‑
二脒基2
‑
苯基吲哚(dapi)染色后，在显微镜下观察。
[0097]
结果，证实了细菌未能通过粘膜的保护膜，而来源于细菌的囊泡则通过粘膜并渗透到肠组织中(参见图2)。
[0098]
实施例3.临床样本中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0099]
首先将血液或尿液放入10ml试管中，并通过离心(3,500
×
g，10分钟，4℃)使悬浮物沉淀，然后仅将上清液转移至新的10ml试管中。使用0.22
‑
μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到centriprep管(50kd离心过滤器)中，并在1,500
×
g和4℃下离心15分钟，弃去小于50kd的物质，将残余物浓缩至10ml。使用0.22
‑
μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，使用90ti型转子在150,000
×
g和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的沉淀物溶解在生理盐水(pbs)中。
[0100]
通过将100μl通过上述方法分离的囊泡在100℃下煮沸，然后在冰上冷却5分钟，从脂质中提取内部dna。然后，为了除去残留的悬浮物，将dna在10,000
×
g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用nanodrop定量dna的量。此后，为了确认提取的dna中是否存在来源于细菌的dna，用下表1所示的16s rdna引物进行pcr，并确认提取的基因中存在来源于细菌的基因。
[0101]
[表1]
[0102]
使用16s rdna引物对通过上述方法提取的dna进行扩增，然后进行测序(illumina miseq测序仪)，结果以标准流程图格式(sff)文件输出，并使用gs flx软件(v2.9)将sff文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件，然后确认读段的可靠性估计，并且剔除窗口(20bps)的平均碱基调用准确性低于99％(得分低于20)的部分。对于otu(操作分类单元)分析，使用uclust和usearch根据序列相似性进行聚类，分别基于94％，90％，85％，80％，和75％的序列相似性对属、科、目、纲、门进行聚类，在每个out的门、纲、目、科、属水平上进行分类，并使用blastn和greengenes(qiime)的16s rna序列数据库(108,453个序列)对在该属水平上具有97％或更高的序列相似性的细菌进行分析。
[0103]
实施例4.肝病患者血液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0104]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对来自97例肝硬化患者、76例肝癌患者和171名年龄和性别相匹配的正常个体的血液进行了宏基因组分析后，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液相比，在来自肝硬化和肝癌患者的血液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图3)。
[0105]
实施例5.心肌梗塞患者血液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0106]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对来自69名心肌梗塞患者和159名年龄和性别相匹配的正常个体的血液进行了宏基因组分析，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液相比，在来自心肌梗塞患者的血液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图4)。
[0107]
实施例6.肾功能不全患者血液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0108]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对来自36名肾功能不全患者和72名年龄和性别相匹配的正常个体的血液进行了宏基因组分析，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液相比，在来自肾功能不全患者的血液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图5)。
[0109]
实施例7.糖尿病患者血液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0110]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对来自81名糖尿病患者和126名年龄和性别相匹配的正常个体的血液进行宏基因组学分析，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液相比，在来自糖尿病患者的血液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图6)。
[0111]
实施例8.脑肿瘤患者血液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0112]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对来自80名脑肿瘤患者和121名年龄和性别相匹配的正常个体的血液进行宏基因组分析后，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液相比，在来自脑肿瘤患者的血液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图7)。
[0113]
实施例9.患有轻度认知障碍和痴呆的患者血液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0114]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对76名轻度认知障碍患者、70名阿尔茨海默氏痴呆患者和146名年龄和性别相匹配的正常个体的血液进行了宏基因组分析后，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液相比，在来自轻度认知障碍患者和阿尔茨海默氏痴呆患者的血液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图8)。
[0115]
实施例10.抑郁症患者血液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0116]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对来自70名抑郁症患者和140名年龄和性别相匹配的正常个体的血液进行了宏基因组分析后，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液相比，在来自抑郁症患者的血液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图9)。
[0117]
实施例11.自闭症患者尿液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0118]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对30名自闭症患者和40名年龄和性别相匹配的正常个体的尿液进行了宏基因组分析后，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的尿液相比，在来自自闭症患者的尿液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图10)。
[0119]
实施例12.特应性皮炎患者的血液和尿液中来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
[0120]
通过从存在于血液中的囊泡中提取基因，使用实施例3的方法对来自61名特应性皮炎患者和52名年龄和性别相匹配的正常个体的血液和尿液进行了宏基因组分析后，评价了来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡的分布。结果，证实了与来自正常个体的血液和尿液相比，在来自特应性皮炎患者的血液和尿液中来源于鞘氨醇单胞菌属的囊泡显著减少(参见图11)。
[0121]
实施例13.来自少动鞘氨醇单胞菌和韩国鞘氨醇单胞菌培养液的囊泡的分离
[0122]
基于上述实施例，培养了少动鞘氨醇单胞菌和韩国鞘氨醇单胞菌菌株，然后从中分离囊泡并分析了分离的囊泡的特性。将菌株在37℃的培养箱中的de man
‑
rogosa and sharpe(mrs)培养基中培养直至吸光度(od 600)达到1.0至1.5，然后在luria
‑
bertani(lb)培养基中继代培养。随后，回收包含菌株的培养上清液，并在10,000
×
g和4℃下离心20分钟，然后除去菌株，并通过0.22μm过滤器过滤。通过使用具有100kda pellicon 2盒式滤膜(merck millipore，美国)的masterflex泵系统(cole
‑
parmer，美国)，通过微滤将过滤的上清液浓缩至小于或等于50ml的体积。将浓缩的上清液再次用0.22μm的过滤器过滤。此后，通过使用bca测定法对蛋白质进行定量，并对获得的囊泡进行以下实验。
[0123]
实施例14.来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡的炎症诱导作用
[0124]
为了检查来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡(少动鞘氨醇单胞菌ev，spc101)对炎性细胞中炎性介质(il
‑
6和tnf
‑
α)的分泌的影响，用各种浓度(0.1、1，或10μg/ml)的来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡处理小鼠巨噬细胞系raw 264.7细胞，然后进行细胞凋亡和elisa。
[0125]
更具体地，以5
×
104个细胞/孔等分入48孔细胞培养板的raw 264.7细胞用通过dmem(dulbecos改良的eagles培养基)无血清培养基稀释的各种浓度的来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡处理，并将处理的细胞培养12小时。之后，使用ez
‑
cytox(韩国dogen)测量细
胞凋亡，将细胞培养液收集在1.5ml试管中，并以3,000g离心5分钟，回收上清液并在
‑
80℃下保存，然后进行elisa分析。
[0126]
为了进行elisa，将捕获抗体用磷酸盐缓冲盐水(pbs)稀释，并根据工作浓度将其50μl等分试样分配到96孔聚苯乙烯平板中，然后使其在4℃下反应过夜。随后，将样本用100μl pbst(含0.05％tween
‑
20的pbs)溶液洗涤3次，然后将rd(含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs)溶液分装成100μl等分试样，然后在室温下封闭1小时，然后按照浓度将样本和标准品分装成50μl等分试样，并在室温下反应2小时。然后，将样本和标准品用100μl pbst洗涤3次，然后用rd稀释检测抗体，并根据工作浓度将稀释的溶液分装成50μl等分试样，并使其在室温下反应持续2小时。之后，将样本和标准品用100μl pbst洗涤3次，然后将链霉亲和素
‑
辣根过氧化物酶(hrp)(r&d systems，美国)在rd中稀释至1/40，并将稀释后的溶液分装成50μl等分试样并使其在室温下反应20分钟。
[0127]
最后，将样本和标准品用100μl pbst洗涤3次，然后将3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)底物(surmodics，usa)分装成50μl等分试样，然后在5分钟至20分钟后显色时，将1m硫酸溶液分装成50μl等分试样，从而终止反应，并使用spectramax m3酶标仪(molecular devices，美国)测量450nm处的吸光度。
[0128]
结果，如图12所示，未观察到由于用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡(spc 101)处理而引起的细胞凋亡(见图12)。此外，通过评估炎性细胞中炎性介质的分泌模式的结果，证实了与用作为阳性对照的来源于大肠杆菌的囊泡(大肠杆菌ev 1μg/ml)处理后相比，用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡(spc 101)处理后炎性介质例如il
‑
6(图13a)和tnf
‑
α(图13b)的分泌大大减少(参见图13a和13b)。
[0129]
实施例15.来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡的抗炎作用
[0130]
为了基于实施例14的结果评估来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡的抗炎作用，在用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡(spc 101)以各种浓度(0.1、1、10μg/ml)预处理小鼠巨噬细胞细胞系12小时后，用1μg/ml来源于大肠杆菌(e.coli)的囊泡(其为致病因子)处理细胞系，然后在12小时后通过elisa测量炎性细胞因子的分泌。
[0131]
结果，证实了在用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡预处理后，通过来源于大肠杆菌的囊泡刺激在炎性细胞中诱导的炎性介质例如il
‑
6(图14a)和tnf
‑
α(图14b)的分泌被显著抑制(图14a和14b)。
[0132]
实施例16.来源于韩国鞘氨醇单胞菌的囊泡的抗炎作用
[0133]
为了基于实施例14的结果评估属于鞘氨醇单胞菌属的另一种细菌的抗炎作用，在用来源于韩国鞘氨醇单胞菌的囊泡(spc 102)以各种浓度(0.1、1、10μg/ml)预处理小鼠巨噬细胞细胞系12小时后，用1μg/ml来源于大肠杆菌(e.coli)的囊泡(其为致病因子)处理细胞系，然后在12小时后通过elisa测量炎性细胞因子的分泌。
[0134]
结果，证实了在用来源于韩国鞘氨醇单胞菌的囊泡进行预处理后，通过来源于大肠杆菌的囊泡刺激在炎性细胞中诱导的炎性介质例如il
‑
6(图15a)和tnf
‑
α(图15b)的分泌被显著抑制(图15a和15b)。
[0135]
实施例17.来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡的分布模式
[0136]
为了确认口服施用来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡时随时间的器官吸收和分布，进行如下实验。口服施用10μg的荧光标记的来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡，并且分别在
1、3、6、32、48和72小时后测量荧光。通过观察整个小鼠图像的荧光，证实了来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡从口服给药后1小时开始分布在胃中，并且从3小时后也分布在小肠和大肠中，并且观察到器官中的分布一直维持到72小时(见图16)。
[0137]
另外，可以确认，荧光标记的来源于少动鞘氨醇单胞菌的囊泡从3小时起特异性地向大脑移动，并且确认了已经迁移到脑部的胞外囊泡的分布度增加直到32小时。然后从32小时到72小时逐渐减少(见图17)。
[0138]
提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应理解，上述实施例仅在所有方面进行说明，而不是限制性的。
[0139]
[工业实用性]
[0140]
证实了根据本发明的来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡通过上皮细胞在体内被吸收，全身地分布，并通过肾脏、肝脏和肺离体排出，并且证实了患有肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的患者的血液或尿液中囊泡显著减少，并且通过致病性囊泡的炎性介质的分泌可被显著抑制。因此，根据本发明的来源于鞘氨醇单胞菌属细菌的囊泡具有很高的工业应用价值，因为所述囊泡可用作诊断肝硬化、肝癌、心肌梗塞、肾功能不全、糖尿病、脑肿瘤、轻度认知障碍、痴呆、抑郁、自闭症和特应性皮炎的方法，并且作为用于预防、缓解或治疗所述疾病的组合物，例如化妆品、食品或药物，并且还可以有效地用作用于将药物输送到大脑的药物载体。