一种共价有机骨架材料、其制备方法及其应用与流程

本发明涉及质谱分析技术领域，具体地说，涉及一种共价有机骨架材料，及其作为基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用。

背景技术：

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi)方法是1987和1988年分别由karas团队和tanaka团队提出的一种软电离质谱技术。其作用原理为激光照射样品于基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同，而被检测及测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比而检测离子。

maldi离子化方法灵敏度高、分析速度快、样品制备简单、对盐具有良好的耐受性。发展至今，已被广泛应用于蛋白质、多肽、糖类、核酸等生物大分子以及高分子聚合物的分子量测定与结构分析中。

蛋白质翻译后修饰是调控各种细胞活动的关键机制之一，在分子水平上，蛋白质翻译后修饰的写入、擦除和识别是实现其动态调控功能的核心过程。其中，蛋白质糖基化和磷酸化是两种重要的翻译后修饰过程，它们调控着细胞黏附、信号转导、免疫应答等生命过程，具有重要的生物学意义。

目前，基于maldi离子化的质谱技术为修饰蛋白质组学的鉴定与结构表征提供了极大的方便，其中，基于分离材料的选择性富集以及表征时基质的选择和使用是进行样品分析的关键步骤。目前，常用基质主要有α-氰基-4-羟基肉桂酸(hcca)、2,5-二羟基苯甲酸(dhb)、蒽三酚(dit)、3-吲哚乙酸(iaa)等，然而，这些基质与样品的共结晶形态和程度各不相同，导致分析效果均有显著的选择性和局限性。另一方面，在质谱分析前需要先纯化样品，合适的富集策略就成为对痕量糖肽、磷酸化肽进行有效结构鉴定的前提。近年来，研究者们发展了多种糖肽的分离富集方法，主要有亲水作用法、硼酸化学法、凝集素亲和法和肼化学法等等。虽然基于这些分离富集方法所开发的分离材料众多，但因比表面积小、功能分子负载量少、选择性特异性不佳等缺点而无法展现出更优异的富集性能，同时，通过材料的分离富集操作，再利用洗脱液洗脱后的样品馏分与基质需要分别点在靶上，进行质谱鉴定，操作繁琐，也会造成一定的样品损失。因此，探索既可以进行样品前处理又可以作为基质直接提供样品鉴定的一体化材料，将大大提高修饰化肽研究的效率，拓展应用前景。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题是，提供一种共价有机骨架材料。本发明要解决的另一个技术问题是，提供该共价有机骨架材料的制备方法。本发明还要解决的技术问题是，提供该共价有机骨架材料的应用。

本发明的技术方案是，一种共价有机骨架材料，其化学结构式为：

其中，x选自氢键、苯基、联苯基中的一种或一种以上。

本发明还提供了上述共价有机骨架材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将2,3,5,6,10,11-六羟基三亚苯水合物和硼酸试剂二种单体溶解在三甲苯和二氧六环混合液中，液氮冷冻；两种单体的投料摩尔比为1:3-3:1；两种单体与混合液的比例是0.01mol/l-1mol/l；

(2)将步骤(1)得到的冷冻液体置于反应装置内，反应装置抽真空，进行气体置换，通入氮气做保护，密封；

(3)将得到的液体搅拌加热进行反应，反应的温度控制为80-150℃；将得到的液体用丙酮及二氯甲烷进行后处理。

由于单体不稳定，步骤(2)的密封是为了隔绝氧气，反应需要三步，反应产物从第三步得到。

其中，本发明的反应过程见图1。

根据本发明的共价有机骨架材料的制备方法，优选的是，步骤(1)所述硼酸试剂选自四羟基二硼，1,4-苯二硼酸，4,4'-联苯基二硼酸中的一种；所述三甲苯和二氧六环混合液中，三甲苯和二氧六环的体积比为1:5～5:1。

优选的是，步骤(1)中还可以加入甲醇，二氧六环和甲醇的体积比为50:1-10:1。

根据本发明的共价有机骨架材料的制备方法，优选的是，步骤(3)所述的搅拌速度控制在100-800rpm；搅拌时间为24-72小时。

根据本发明的共价有机骨架材料的制备方法，优选的是，步骤(3)所述后处理方法是，将得到的液体加丙酮洗涤，超声震荡离心，去除上清液；将所得样品在60-90℃下烘干8-20小时，再将烘干后的样品加入二氯甲烷洗涤，超声震荡离心，去除上清液，将所得样品在60-90℃下烘干8-20小时，得到共价有机骨架材料。

本发明还提供了上述共价有机骨架材料在糖肽富集上的应用。

将所述共价有机骨架材料作为富集材料，采用固相萃取(spe)或者分散固相萃取(dspe)富集和纯化糖肽。

在糖肽富集上的应用中，将共价有机骨架材料与上样缓冲液配置成材料分散液，将该材料分散液和蛋白酶解液混合，室温下孵育5-60分钟，用淋洗缓冲液洗涤材料，用洗脱液洗脱并离心收集糖肽馏分，进行质谱分析；

所述上样缓冲液包括：体积占85％-95％的有机溶剂，体积占0.1-5％的酸缓冲溶液，体积占0.1-10％的水；所述淋洗缓冲液包括：体积占85％-95％的有机溶剂，体积占0.1-5％的酸缓冲溶液，体积占0.1-10％的水；

上样缓冲液体积为共价有机骨架材料体积的5-200倍；淋洗缓冲液体积为共价有机骨架材料的体积的5-200倍；

洗脱液包括：体积占95-99.9％的水和体积占0.1-5％的含酸溶液；

洗脱糖肽所用的洗脱液体积为共价有机骨架材料体积的2-50倍。

离心含糖肽的上清液即糖肽馏分。淋洗缓冲液淋洗材料时，所用的体积为共价有机骨架材料的体积的5-200倍。

进一步地，洗脱液包括0.5-30％体积比的有机溶剂，65-99.9％的水和体积占0.1-5％的酸缓冲溶液。洗脱液中可以不含有机溶剂，也可以加入有机溶剂。

优选的是，上述有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇等中的一种或二种以上，酸缓冲溶液包括但不局限于甲酸、乙酸、三氟乙酸等中的一种或二种以上。

本发明还提供了上述的共价有机骨架材料作为基质在基质辅助激光解吸电离(maldi)飞行时间质谱检测中的应用。

根据上述在基质辅助激光解吸电离(maldi)飞行时间质谱检测中的应用，优选的是，所述基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中待检测的化合物是指分子量小于5000的化合物。进一步地，所述的化合物包括氨基酸、多肽、糖类、生物碱、核酸、聚合物等。

根据上述在基质辅助激光解吸电离(maldi)飞行时间质谱检测中的应用，优选的是，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中，待测样品与基质溶液的用量比例为1μg/μl-100μg/μl。

该材料直接可以作为基质，操作中与样品混合，所以其比例就是混合液的浓度范围，即1μg/μl-100μg/μl。用材料直接当基质，配成的材料溶液就是基质溶液。

使用时，待测样品与基质溶液混合均匀，震荡1-60min。震荡后的混合液0.5-1μl点样于基质辅助激光解吸电离靶板，在室温下空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。

本发明所制备的共价有机骨架材料，制备方法简单，高效，重复性与稳定性均良好。可应用于糖肽的富集，富集用量少、富集选择性与重复性良好。可作为基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测，包含共价有机骨架材料的糖肽洗脱馏分可直接点靶，所形成的均匀结晶溶液对355nm激光能量的吸收好、能量传导效率高、产生的信号强度高、适用的分子量分布范围广，可用于不同极性的多种类型的不同分子量分布的化合物的测定和结构解析。本发明所述方法的灵敏度高、材料用量少、重现性好、适用范围广，有效地合并了样品前处理及与其它基质引入或与样品混合的步骤，大大减少了修饰蛋白质组学研究的工作量，显著提高了分析效率。

本发明的有益效果是：

1.所制备的共价有机骨架材料，制备方法简单，高效，重复性与稳定性均良好；

2.可应用于糖肽的富集，富集用量少、富集选择性与重复性良好；

3.对355nm激光能量的吸收好、能量传导效率高、产生的信号强度高，适用的分子量分布范围广，可用于不同极性的多种类型的不同分子量分布的化合物的测定和结构解析；

4.基于材料独特的性能，有效地合并了样品前处理及与其它基质引入或与样品混合的步骤，避免了分离富集与样品鉴定操作的繁琐及复杂化，从而提供简便、可控、高效、稳定的修饰蛋白质组学研究新方法与新思路。

该应用适用于分子量小于5000的化合物的质谱检测分析。适用的化合物种类包括氨基酸、多肽、糖类、生物碱、核酸、聚合物等，适用范围广。采用本方法检测质荷比值(m/z)小于5000的分子时，不存在基质背景干扰现象。本方法在有机生物质谱、质谱呈像、翻译后修饰蛋白质组学、代谢组学、生物标记物发现等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为使用实施例1中的共价有机骨架材料的制备过程图；

图2为使用实施例2中的共价有机骨架材料的糖肽富集图，选择dhb为基质。

图3为使用实施例3中的共价有机骨架材料的糖肽富集图，不使用其他基质，以自身为基质。

图4为使用实施例4中的共价有机骨架材料的复杂样品(高非糖肽掺入比)的糖肽富集图，不使用其他基质，以自身为基质。

图5为使用实施例5中的共价有机骨架材料的制备过程图；

图6为使用实施例5中的共价有机骨架材料的扫描电镜图。

图7为使用实施例5中的共价有机骨架材料的透射电镜图。

图8为使用实施例6中的共价有机骨架材料的制备过程图。

图9为使用实施例6中的共价有机骨架材料的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

称取hhtp(2,3,6,7,10,11-六羟基三苯)250mg(0.7mmol)和四羟基二硼97mg(1.05mol)于50ml三口烧瓶中(预先放入搅拌子)；量取2ml三甲苯，8ml二氧六环和0.6ml甲醇配成溶液；将烧瓶在液氮冷冻下，将配好的溶液倒入烧瓶中，直到溶液全部冷冻后取出；将反应装置抽真空，进行气体置换，连续三次；充入氮气做保护，密封；在90℃油浴下，以300rad/min搅拌72h；取出液体，加入丙酮，超声震荡离心，除去上清液，重复三次，将所得样品放入80℃烘箱隔夜烘干；将样品取出，再用二氯甲烷洗涤，重复超声震荡离心三次，将材料再次烘干；称的干燥后的材料146mg，收率为42％，样品为灰色。

共价有机骨架材料的制备过程图见图1。

实施例2

取0.5mg实例1所制备材料于离心管中，用上样液清洗平衡材料，上样液为acn/h2o/tfa＝90:9:1,v/v/v；将6μg的人血清免疫球蛋白g(igg)溶于200μl的上样液中，并与材料混匀震荡30min；接着，用100μl淋洗液淋洗三次，淋洗液为acn/h2o/tfa＝90:9.9:0.1,v/v/v，除去与材料结合的多余非糖肽；最后，用10μl洗脱液洗脱与材料结合的糖肽，洗脱液为h2o/tfa＝95:5,v/v。离心分离取上清液，将该上清液取1μl点在靶上，自然干燥后，加入0.5μl基质溶液dhb(25mg/ml，acn/h2o/h3po4＝70:29:1,v/v/v)，采用maldi-tof/tof-ms仪的正离子模式分析，质谱范围为2200-3400，激光强度为3800，获取的质谱数据采用软件dataexplorer(tm)software进行分析，峰的分辨率设为0.95，且s/n大于3。

共价有机骨架材料的糖肽富集图见图2，选择dhb为基质，从图中可知基于材料的糖肽富集选择较好。

实施例3

取0.5mg实例1所制备材料于离心管中，用上样液清洗平衡材料，上样液为acn/h2o/tfa＝90:9:1,v/v/v；将6μg的igg溶于200μl的上样液中，并与材料混匀震荡30min；接着，用100μl淋洗液淋洗三次，淋洗液为acn/h2o/tfa＝90:9.9:0.1,v/v/v，除去与材料结合的多余非糖肽；最后，用10μl洗脱液洗脱与材料结合的糖肽，洗脱液为h2o/tfa＝95:5,v/v。取混合有材料与样品的洗脱液1μl点在靶上，自然干燥后，用maldi-tof/tof-ms仪的正离子模式分析，质谱范围为2200-3400，激光强度为3800，获取的质谱数据采用软件dataexplorer(tm)software进行分析，峰的分辨率设为0.95，且s/n大于3。

得到共价有机骨架材料的糖肽富集图见图3，不使用其他基质，以自身为基质。从图中可知基于材料的糖肽富集选择较好，无基质下检测丰度较好。

实施例4

取0.5mg实例1所制备材料于离心管中，用上样液清洗平衡材料，上样液为acn/h2o/tfa＝90:9:1,v/v/v；将6μg的igg和26μg的牛血清白蛋白(bsa)溶于200μl的上样液中，并与材料混匀震荡30min；接着，用200μl淋洗液淋洗三次，淋洗液为acn/h2o/tfa＝90:9.9:0.1,v/v/v，除去与材料结合的多余非糖肽；最后，用10μl洗脱液洗脱与材料结合的糖肽，洗脱液为h2o/tfa＝95:5,v/v。取混合有材料与样品的洗脱液1μl点在靶上，自然干燥后，用maldi-tof/tof-ms仪的正离子模式分析，质谱范围为2200-3400，激光强度为3800，获取的质谱数据采用软件dataexplorer(tm)software进行分析，峰的分辨率设为0.95，且s/n大于3。

共价有机骨架材料的复杂样品(高非糖肽掺入比)的糖肽富集图见图4，不使用其他基质，以自身为基质，从图中可知基于材料的复杂样品干干扰能力强，糖肽富集选择性较好，无基质下检测丰度较好。

实施例5

称取hhtp(2,3,6,7,10,11-六羟基三苯)83.3mg和1,4-苯二硼酸3.8mg于50ml三口烧瓶中(预先放入搅拌子)；量取2ml三甲苯，8ml二氧六环和0.6ml甲醇配成溶液；将烧瓶在液氮冷冻下，将配好的溶液倒入烧瓶中，直到溶液全部冷冻后取出；将反应装置抽真空，进行气体置换，连续三次；充入氮气做保护，密封；在90℃油浴下，以300rad/min搅拌72h；取出液体，加入丙酮，超声震荡离心，除去上清液，重复三次，将所得样品放入80℃烘箱隔夜烘干；将样品取出，再用二氯甲烷洗涤，重复超声震荡离心三次，将材料再次烘干；称的干燥后的材料97.9mg，收率为66.6％，样品为黑色。

共价有机骨架材料的制备过程图见图5；共价有机骨架材料形貌利用扫描电子显微镜进行表征，其扫描电镜图见图6，根据所得到的sem图像观察材料呈片层状结构，并带有较多的褶皱；共价有机骨架材料的内部结构特征利用投射电镜进行表征，其透射电镜图见图7，根据所得到的tem图像观察材料呈现孔道结构。

实施例6

称取hhtp(2,3,6,7,10,11-六羟基三苯)250mg和4,4'-联苯基二硼酸312mg于50ml三口烧瓶中(预先放入搅拌子)；量取2ml三甲苯，8ml二氧六环和0.6ml甲醇配成溶液；将烧瓶在液氮冷冻下，将配好的溶液倒入烧瓶中，直到溶液全部冷冻后取出；将反应装置抽真空，进行气体置换，连续三次；充入氮气做保护，密封；在90℃油浴下，以300rad/min搅拌72h；取出液体，加入丙酮，超声震荡离心，除去上清液，重复三次，将所得样品放入80℃烘箱隔夜烘干；将样品取出，再用二氯甲烷洗涤，重复超声震荡离心三次，将材料再次烘干；称的干燥后的材料257mg，收率为45.8％，样品为黑色。

共价有机骨架材料的制备过程图见图8。共价有机骨架材料的内部结构特征利用投射电镜进行表征，其透射电镜图见图9。并根据所得到的tem图像观察材料呈现孔道结构，分布均匀。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。