马齿苋中新骨架生物碱化合物及其提取分离方法

马齿苋中新骨架生物碱化合物及其提取分离方法
【专利摘要】本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的新骨架生物碱化合物及其提取分离方法。所述的新骨架生物碱化合物，分子依次式为C18H26N2O，C18H24N2O2，C18H28N2O2，命名为Oleracimine，Oleracimine A和Oleracone A。还提供上述新化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱、及Sephadex LH?20，成功的提取分离出骨架独特的新生物碱化合物，新化合物具有抗炎、镇痛和抗肿瘤作用，本发明新化合物及其盐或衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，用于制备抗炎、治疗疼痛和抗肿瘤的药物或保健品。
【专利说明】
马齿苋中新骨架生物碱化合物及其提取分离方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的 新骨架生物碱化合物及其提取分离方法。
【背景技术】
[0002] 马齿苋(Portulaca oleracea L.)，又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科植物。马齿苋 耐旱耐涝，且耐光耐阴，分布广泛，资源丰富，作为药食两用的野生植物备受关注，2015版 《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢 等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。
[0003] 马齿苋现代药理学研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血压、降血脂、抗氧 化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。研究表明马齿苋众多化学成分为其 多样的药理作用提供了物质基础，马齿苋主要化学成分包括黄酮类、香豆素、萜类、留类、生 物碱、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中一类主要的化学成分，目 前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N_ 二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺;还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱:马齿苋酰 胺A-I、K、L、N-S 〇
[0004] 目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对 马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。

【发明内容】

[0005] 针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取的新骨架生物碱化合物，经研究发现 本发明的新骨架生物碱具有抗炎镇痛抗肿瘤的作用，同时提供一种针对本发明新化合物的 简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
[0006] 为实现本发明的上述目的，本发明提供新骨架生物碱化合物，分子式分别为 〇181126他0，〇181124他〇2，〇181128~〇2，命名依次为〇16瓜(3；[111；[116,016抑(3；[111；[116八，016瓜(30116八，化 学结构式依次为：
[0007]
[0008] 为买现本友明的上还目的，本友明边提供一种马齿苋中新骨架生物碱化合物的提 取分离方法，具体步骤为。
[0009] 步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液滤过，合并滤液直接加热浓 缩，放凉至室温，得药液备用；
[0010]步骤2、将步骤1中药液用乙酸乙酯反复萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸 乙酯萃取物；
[0011] 步骤3、将步骤2中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗 脱得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱 部位经减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
[0012] 步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的0DS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键 合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显 色，将各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
[0013] 步骤5、将步骤4中所得各浓缩物经预处理的Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶） 层析分离，分别以甲醇-水梯度洗脱，得到来源于马齿苋的新骨架生物碱化合物。
[0014] 所述0DS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇 洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
[0015]与现有技术相比本发明的有益效果。
[0016]本发明中所述马齿苋新骨架化合物的分离和药理活性研究未被现有的论文期刊 所报道;本发明提供来源于马齿苋的新骨架生物碱化合物及一种针对本发明新化合物的提 取分离方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、0DS中压柱、及Sephadex LH-20，成功提取分离出骨架独特的新生物碱化合物，该方法操作步骤仅为五步，操作方法 简便及快速，提取分离过程主要采用水提取及乙酸乙酯萃取，工艺方法环保，且经该方法分 离得到的化合物纯度较高均大于90%，此外经研究表明以上各化合物具有抗炎、镇痛和抗 肿瘤作用，因此本发明三种新化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以 及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎、治疗疼痛和抗肿瘤的药物。
【附图说明】
[0017]图1为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的紫外光谱图。
[0018]图2为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的红外光谱图。
[0019]图3为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的高分辨质谱图。
[0020] 图4为本发明新骨架生物碱化合物的Oleracimine h-NMR光谱图。
[0021]图5为本发明新骨架生物碱化合物的Oleracimine 13C-NMR光谱图。
[0022]图6为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。 [0023]图7为本发明新骨架生物碱化合物Olerac imine的核磁共振1H-hCOSY光谱图。 [0024]图8为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的核磁共振HMBC光谱图。
[0025]图9为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的核磁共振HSQC光谱图。
[0026]图10为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的核磁共振N0ESY光谱图。
[0027]图11为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的紫外光谱图。
[0028]图12为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的红外光谱图。
[0029]图13为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的高分辨质谱图。
[0030] 图14为本发明新骨架生物碱化合物的Oleracimine A h-NMR光谱图。
[0031] 图15为本发明新骨架生物碱化合物的Oleracimine A 13C-NMR光谱图。
[0032]图16为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的核磁共振碳谱(DEPT)光谱 图。
[0033]图17为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的核磁共振1H-hCOSY光谱图。 [0034]图18为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的核磁共振HMBC光谱图。
[0035]图19为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的核磁共振HSQC光谱图。
[0036]图20为本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的核磁共振N0ESY光谱图。
[0037]图21为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的紫外光谱图。
[0038]图22为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的红外光谱图。
[0039]图23为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的高分辨质谱图。
[0040] 图24为本发明新骨架生物碱化合物的Oleracone A h-NMR光谱图。
[0041 ] 图25为本发明新骨架生物碱化合物的Oleracone A 13C_NMR光谱图。
[0042]图26为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的核磁共振碳谱(DEPT)光谱图。 [0043]图27为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的核磁共振1H-hCOSY光谱图。 [0044]图28为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的核磁共振HMBC光谱图。
[0045]图29为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的核磁共振HSQC光谱图。
[0046]图30为本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的核磁共振N0ESY光谱图。
【具体实施方式】 [0047] 实施例1。
[0048]本发明提供一种新骨架生物碱化合物，分子式为C18H26N20，化学结构式为：
[0049]
[0050]所述新骨架生物碱化合物根据结构命名为Oleracimine，表1为该新骨架生物碱化 合物的核磁数据:^-NMR与13C-NMR在CDC13中。
[0051 ]表1:本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine的核磁数据。
[0052]
[0053]请参阅图1-10,本发明一种新骨架生物碱化合物的结构鉴定与推导。
[0054] Oleracimine:黄色粉末，[a]2QD+4.2(c 0 · 38，MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、 微溶于水。喷稀碘化铋钾试液显红棕色，提示该化合物为生物碱成分，UV(MeOH)A max: 448， 272nm，IRvN-h3354，vc=01666，v c=N1554，δΝ-h1510，vc-Nl〇49cm- 1，HRESI ( + )T0FMS给出m/z : 287.2118[M+H]+的准分子离子峰，分子量为286.2045。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据， 推测该化合物可能的分子式SC 18H26N20，不饱和度为7。13C-匪R谱和DEPT谱显示18个碳信 号，分别为 7个〇130:14.4,21.2,27.4,28.6,28.8,29.1，32.5)、2个(：!12(3 :46.8,52.3)、9个 季碳（一个羰基碳，δ :206.2;-个碳氮双键的碳，δ: 169.4;四个双键碳，δ :11〇. 7,121.3， 141 · 0，143 · 5;三个脂肪碳，δ: 38 · 9，50 · 6，65 · 7)。
[0055] h-NMR谱显示一个活泼Η信号δ4.07(1H，s)，表明其可能在一个氨基基团。7个甲基 信号，分别为 Sl.l6(3H，s)，Sl.29(3H，s)，Sl.30(3H，s)，Sl.34(3H，s)，Sl.45(3H，s)，Sl.82 (3!1，8)』1.88(3!1，8)。2个亚甲基信号分别为52.02(1!1，(1，1=13.5)，51.47(1!1，(1，1=13.5) 和32.56(1!1，(1，1=15.3)，52.28(1!1，(1，1=15.3)，根据!1-!1邙3￥谱可知，7个甲基中!1谱3 1.88与51.82相耦合，31.45与51.30相耦合，31.16与51.34、31.29相耦合。而51.82与31.88 相对于其他甲基化学位移较大，可能与双键相连。
[0056] HMBC 谱相关峰表明 H2-6 与 C-5，C-7，C-8，C-9，C-4a 和，C-14; H2-9 与 C-6，C-7，C-8，C-10，C-16 和 C-17; H3-14 与 C-6，C-7，C-8，C-9 和 C-10; H3-15 与 C-8 和 C-8a; H3-16 与 C-9，C-10 和 C-17;H3-17与C-9，C-10和C-16有耦合作用，说明存在两个六元环结构，此两个六元环公用 C-7，C-8，C-8a三个碳原子，且结合H-H COSY谱可知，两个甲基C-16，C-17连接在C-10上，一 个甲基C-14连接在C-7上。C-8a，C-10和C-2出现在碳谱低场区（SC-8a: 141.0，δ〇10:50.6，δ C-2:65.7)，说明此三个碳原子与Ν相连。由HMBC相关谱显示H3-l 1与C-2，C-3和C-12; H3-l 2与 C-2，C-3和C-l 1; Η3-13与C-3，C-4和C-4a的耦合关系可知，另有一六元环片段与上述两个六 元环共用C_4a，C-8a和N三个原子，一个甲基C-13连接在C-4上，且结合H-H COSY谱可知两个 甲基C-l 1，C-12均连接在C-2上。此外，季碳原子C-5出现在碳谱低场区（δ(：-5:169.4)，可推 测得知亚胺基团与C-5相连。根据以上信息，此新骨架生物碱为上述结构。
[0057]本发明提供一种新骨架生物碱化合物，分子式为C18H24N2O2,化学结构式为：
[0058]
[0059]所述新骨架生物碱化合物根据结构命名为Oleracimine Α，表2为该新骨架生物碱 化合物的核磁数据:^-NMR与13C-NMR在CDC13中。
[0000]表2:本发明新骨架生物碱化合物Oleracimine A的核磁数据。
[0061]
[0063] 请参阅图11-20,本发明一种新骨架生物碱化合物的结构鉴定与推导。
[0064] Oleracimine A:黄色粉末，[a]2QD-13(c 0· 1，MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、 微溶于水。喷稀碘化铋钾试液显红棕色，提示该化合物为生物碱成分，UV(MeOH)A max: 446， 268nm,IRvN-H 3470,3290,ν〇=〇 1712,1668,5n-h 1628,v〇=n 1578,vc=c 1531,v〇-n 1312cm-l, HRESI( + )T0FMS 给出 111/2:301.1912[]\1+!1]+的准分子离子峰，分子量为300.1833。结合1!1-匪1? ， 13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C18H24N 2〇2，不饱和度为8。13C-NMR谱 和 DEPT 谱显示 18 个碳信号，分别为 6 个(?3(δ:14·7,25·5,27·6,27·8,28·4,28·7)、?Αα?2(δ: 43.3)、1个ΟΚδ: 22.1)、10个季碳(两个羰基碳，206.6，212.1; -个碳氮双键的碳，166.8;四 个双键碳，δ :110.6,122.2,140.3,142.0;三个脂肪碳，δ :49.3,60.2,65.9)。
[0065] 匪R谱显示两个活泼Η信号64.07(1!1，8)、61.62(2!^8)，表明存在两个氨基基 团。6个甲基信号，分别为Sl.31(3H，s)J1.34(3H，s)，Sl.37(3H，s)J1.44(3H，s)J1.49 (3!1，8)』1.95(3!1，8)。1个亚甲基信号为52.85(1!1，(1，了=17.1)，52.60(1!1，(1，了=17.1)，1个 次甲基信号为S2.〇2(lH，s)。根据H-H COSY谱可知，6个甲基中，δ?.37与δ?.49相耦合，δ?.44 与si. 34相耦合，δ?. 31与δ2.85相耦合。而δ?.95相对于其他甲基化学位移较大，可能与双键 相连。
[0066]由HMBC谱所示，H2-10/与C-l，C-2，C-7，C-8a，C-9和C-16;Hi-3a与C-8和C-8a;H 3-l 1 与C-2，C-3和C-12;H3-12/与C-2，C-3and和C-l 1; H3-I6与C-l，C-2，C-8a和C-10相互耦合，提 示存在一个六元环和一个五元环，两环公用C-1和C-8a两个碳原子，C-1和C-3出现在低场区 (δ〇1:49.3，δ〇3:60.2)，提示C-2所在羰基位于C-1和C-3之间，甲基C-16连接在C-1上，C-8 和C-9出现在碳谱低场区（δ〇8:142.0，δ(：-9:166.8)，说明双键碳原子C-8与伯胺基团相连， 亚胺基团位于C-9上。结合H-H COSY谱推测可知，两个甲基C-l 1，C-12连接在C-3上。此外，根 据 HMBC 谱，可知 Hi-3a/与 C-5; H3-l 3 与 C-4，C-5 和 C-14; H3-14/与 C-4，C-5 和 C-13; H3-15 与 C-5，C-6和C-7的耦合关系，提示存在另外一个七元环结构与上述两环共用C-3a，C-7和C-8a三 个碳原子，提示C-5所在羰基与C-4相连。综合考虑HMBC谱和H-H COSY谱，可知甲基C-15连接 在C-6上，甲基C-13和C-14均与C-4相连。根据以上信息描述，可确定此新骨架生物碱结构如 上所述结构。
[0067]本发明提供一种新骨架生物碱化合物，分子式为C18H28N20 2,化学结构式为：
[0068]
[0069]所述新骨架生物碱化合物根据结构命名为Oleracone A，表3为该新骨架生物碱化 合物的核磁数据:^-NMR与13C-NMR在CDC13中。
[0070] 表3:本发明新骨架生物碱化合物Oleracone A的核磁数据。
[0071]
[0072]
[0073] 请参阅图21-30,本发明一种新骨架生物碱化合物的结构鉴定与推导。
[0074] Oleracone A:褐色粉末，[a]2QD+20(c 0.1，Me0H)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微 溶于水。喷稀碘化铋钾试液显红棕色，提示该化合物为生物碱成分，UV(Me0H)Amax:339， 273nm，IRvN-η 3330,3278，vc=h 3075，vc=〇 1655，1620，vc=c 1506，vc-n 1258，1160cm-l， HRESI ( + )T0FMS给出m/z : 305.2359[M+H]+的准分子离子峰，分子量为304.2280。结合1H-NMR ，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C18H28N 2〇2，不饱和度为6。13C-NMR谱 和 DEPT 谱显示 18 个碳信号，分别 7 个 CH3(S:20.3,22.0,24.4,24.6,25.2,27.3,29.0)、lfCH2 (δ:42·7)、3 个〇Κδ:44·0,48·3，112·0)、7 个季碳(两个羰基碳，169·5,200·6;三个双键碳， δ :101.0,132.0,152.7;两个脂肪碳，δ :51.0,58.1)。
[0075] 々-Μ?谱显示两个活泼Η信号64.61(1!1沁8)、65.40(1!^8)，表明存在两个氨基基 团。7个甲基信号，分别为 δ1·08(3Η，8)，δ1·09(3Η，8)，δ1·09(3Η，(1，7·3)δ1·29(3Η，8)，δ1·39 (3Η，s)J1.90(3H，s)J2.35(3H，shl个亚甲基信号为δ2.33(lH，d，J= 13.9)，δ2.19( lH，d， 了=13.9)，3个次甲基信号为62.44(3!14，了 = 7.3)，62.92(1!14，了 = 5.2)，65.05(1!1，(1，了 = 6.25)。由!1-!1〇)5￥谱可知，有相互耦合关系的!1为51.09与52.44,51.08与51.29,51.09与3 1.39,32.92与35.05,32.35与34.61。而31.90和32.35相对于其他甲基化学位移较大，可能 与双键相连。
[0076] HMBC谱所示相关峰如下所述，H3-2与C-1，活泼HS5.40(lH，b S)与C-1和C-2相互耦 合，说明存在一个乙酰基片段。出-2'与(：-3'，(：-4'，(：-9'3，(：-10'和(：-15'；!1 2-4'与(：-3'，(：-5'，C-6'，C-10'和C-ΙΓ ;Ηι-6'与C-4'，C-6'a和C-9'a;Hi-6'a与C-5'和C-6' ；H3-10'与C-3'， C-4 '，和C-l Γ ;H3-l Γ 与C-3 '，C-4 ' 和C-10 ' ；H3-15 ' 和C-Γ 和C-9 'a相互耦合，考虑到C-Γ 和 C-3 '的化学位移偏大，推测与仲胺基团相连，如此可断定一个八元环片段的存在，甲基C-15'位于C-Γ上，因 C-5'出现在碳谱低场区〇(：-5'：132.0)，推断其与上述酰胺基团的仲氨 基相连，结合H-H COSY谱可知两个甲基C-10 '，C-1Γ均连接在C-3 '上。此外，根据HMBC谱可 知Hi-6'a/与C-7'，C-8'，C-9'，C-9'a，C-12'和C-13' ；Ηι-9'与C-6'，C-6'a，C-7'，C-8'，C-9'a 和C-14' ；H3-12'与C-6'a，C-7'和C-13' ；H3-137与C-6'a，C-7'和C-12' ；H3-14'与C-8'和C-9 '相互耦合，证明一个五元环片段的存在，甲基C-14 '与C-9 '相连，根据ft-9 '与C-8 '的耦合 关系和C-7 '较大的化学位移可推断C-8 '所在的羰基连在出-7 '与C-9 '之间，并且该五元环 与上述八元环共用C_6'a和C_9'a两个碳原子，结合H-H COSY谱所示δ1.〇9与δ?.39的相互耦 合可断定两个甲基C-12'和C-13'均连在C-7'上。综合以上信息推断，可确定此新骨架生物 碱结构如上所述。
[0077]本发明还提供上述新骨架生物碱化合物的提取分离方法，具体步骤为。
[0078]步骤1:称取马齿苋干燥药材150kg，采用水煎煮提取，水用量为药材的8~16倍，煎 煮提取两次，每次煎煮2小时，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备 用。
[0079]步骤2:将步骤1中所得药液，用乙酸乙酯反复萃取3次，乙酸乙酯与浓缩液的体积 比例为1:1(^4,40°(：以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。
[0080] 步骤3:将步骤2中所得乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，其中硅胶为 200~300目，依次用石油醚-丙酮（1:1、1 :2、1:3、1:5，￥:￥)梯度洗脱，共得到150个部位（即 共得到150个瓶，每瓶400mL)，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的90~130洗脱部位（即 合并显色的90~130瓶，弃去1~89瓶与131~150瓶），将合并后的90~130部位经40 °C以下 减压浓缩至干，备用。
[0081] 步骤4:将步骤3中所得物再经预处理的0DS中压柱层析分离，其中填料粒度为20~ 40μL?，用甲醇-水（10/90，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v)梯度洗脱（加压，使流速为lml/ min，温度为室温），得到10个部位（即梯度洗脱得10个瓶，每瓶200mL)，经薄层色谱进行检 测，显色，将显色的部位分别合并，50°C以下减压浓缩至干，备用。所述0DS的预处理过程为 甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
[0082] 步骤5:将步骤4中所得各显色部位经预处理的Sephadex LH-20柱层析，分别以甲 醇-水(70/30，v/v)等度洗脱，得到新骨架生物碱化合物。经超高效液相色谱，归一法测定纯 度均为90~99%。所述Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲 醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
[0083]本发明新骨架生物碱化合物的抗炎作用。
[0084] 1、主要材料。
[0085] 1.1、药品和试剂：实验所用新骨架生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90~ 99%，精密称取，用DMS0稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国 Hyc 1 one公司）；青霉素、链霉素(杭州四季青公司）；LPS (美国Si gma公司）；IL-6、TNF-α、PGE2 的EL ISA试剂盒(美国Cayman公司）；细胞裂解液、Gr i e s s试剂(碧云天生物技术有限公司）
[0086] 1 · 2细胞株:RAW264 · 7巨噬细胞(美国ATCC细胞库）
[0087] 1.3分组:分为对照组、LPS组和实验组，各一组。
[0088] 2实验方法。
[0089] 2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（100U/mL青霉素 和100yg/mL链霉素），置于37 °C、5 % C02培养箱中培养。
[0090] 2.2MTT比色法测定细胞活力，上述三组分别取对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种 于96孔培养板中，细胞密度为1 X 104个/mL，每孔100yL，温度37°C，5%C02条件下培养过夜 后，实验组加入不同浓度的本发明三种新化合物〇leracimine( 1_50μΜ)或oleracimine A (1-50μΜ)或oleracone Α(1-50μΜ)，孵育lh后向LPS组和实验组分别加入终浓度为lyg/mL的 LPS，另设调零组(含DMS0溶媒的培养液），每组设3个复孔，考察加入药物后对细胞的影响。 上述各组细胞培养24h后，在各孔细胞中加入5mg/mL MTT 20yL，温度37°C，5%C02条件下继 续孵育4h后，终止培养，吸弃孔内液体，每孔加入100yL二甲基亚砜(DMS0)，振荡10min，使细 胞内结晶充分溶解，酶标仪570nm波长处测定各孔吸光值。
[0091] 2.3利用格里斯(Griess)法测定N0的含量，考察本发明三种新化合物对LPS诱导的 小鼠巨噬细胞RAW264.7的N0产生量的抑制作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7传代后在含10 %胎 牛血清的高糖细胞培养基D Μ E Μ中培养，实验组加入不同浓度的本发明三种新化合物 oleracimine(l_20yM)或oleracimine Α(1_20μΜ)或oleracone Α(1_20μΜ)，在37°C，5%C〇2 条件下孵育lh后用LPS(终浓度为lyg/mL)诱导炎症反应，24h后收集上清液，每组处理重复3 孔。Griess法测定细胞上清液中N0的含量，根据不同浓度本发明三种新化合物对LPS诱导的 RAW264.7细胞释放N0的影响，用以反映 N0水平。
[0092] 2.4ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF-a和炎症介质PGE2:将对数生长期RAW264.7巨 噬细胞接种于24孔培养板中，细胞密度为1 X 105个/mL，每孔lmL，温度37°C，5%C02条件下培 养过夜，实验组加入本发明三种新化合物oleracimine(1_20μΜ)或oleracimine Α(1_20μΜ) 或oleracone Α(1-20μΜ)，培育lh后，在每孔加入LPS(终浓度为lyg/mL)，共孵育24h，每组处 理重复3孔。ELISA法测定三种马齿苋来源新生物碱处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-6、TNF_a和PGE 2的含量。
[0093] 3实验结果。
[0094]实验结果表明本发明三种新化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影 响，安全无毒;并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-6、 TNF-a和炎症介质NO、PGE2，且呈浓度依赖。
[0095]细胞相对存活率实验结果如表4所示。
[0096] 表4:本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响。
[0097]
[0098]
[0099] 注:*P〈0.05与对照组比较(高浓度组有显著性差异）。
[0100]利用格里斯(Griess)法测定N0的含量实验结果见表5。
[0101] 表5:本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞释放N0的影响（均数土标准差，η = 3)。
[0102]
[0104] 注:*P〈0 · 05与对照组比较，#P〈0 · 05与LPS组比较。
[0105] ELISA法测定炎症因子IL-6、TNF_a和炎症介质PGE2结果如表6所示。
[0106] 表6:本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-a和PGE2含量的影响（均 数土标准差，n = 3)。
[0107]
[0109] 注，P〈0 · 05与对照组比较，#P〈0 · 05与LPS组比较。
[0110] 本发明新骨架生物碱化合物的镇痛作用。
[0111] 1主要药品和试剂。
[0112] 实验所用新骨架生物碱化合物由上述方法制备，纯度为99%，精密称取，用生理盐 水稀释至下述各剂量组所需溶液。致痛剂为〇 . 6 %乙酸，用生理盐水配制。盐酸吗啡注射液 (沈阳第一制药厂），用生理盐水稀释至下述剂量溶液。
[0113] 2实验动物。
[0114] 昆明种雄性小鼠，体重为20±2g，清洁级，由大连医科大学实验动物中心提供。室 温20~25°C，自由饮食，实验室适应一周后用于实验。
[0115] 3实验方法。
[0116] 取健康小鼠，雌雄各半，共150只小鼠，体重20±2g，随机分为三组空白对照组、九 组实验组(分别为本发明三种新骨架生物碱化合物高剂量组(2mg/kg)、本发三种明新骨架 生物碱化合物中剂量组（lmg/kg)、本发明三种新骨架生物碱化合物低剂量组(0.5mg/kg)、、 三组阳性药组(5mg/kg)共计组十五，每组10只。
[0117] 各组小鼠灌胃给予受试药物，每日两次，连续给药3天。空白对照组给予等体积的 生理盐水，阳性药组给予盐酸吗啡注射液。末次给药1小时后，各组小鼠腹腔注射0.6%乙酸 (0. lmL/10g体重），观察30分钟内各组小鼠扭体出现时间、扭体次数、扭体结束时间，与空白 对照组比较计算各组镇痛抑制率。按下式计算镇痛抑制率，对各组小鼠扭体次数进行统计 分析，P<〇. 05为有显著差异。
[0118] 抑制率％ =(空白对照组平均扭体数一给药组平均扭体数)/空白对照组平均扭体 数 X100%〇
[0119] 4实验结果。
[0120]空白对照组小鼠腹腔注射乙酸后表现为显著的扭体次数多，表现出强烈的疼痛反 应;与空白对照组比较，中、高剂量组及阳性药组扭体次数及扭体结束时间均有减少趋势， 本发明新骨架生物碱化合物高剂量组、中剂量组、低剂量组及阳性药组潜伏期均有不同程 度延长趋势。结果表明本发明新骨架生物碱化合物对乙酸致小鼠扭体反应有一定的镇痛作 用。具体实验结果如表7所示。
[0?21 ]表7:本发明对乙酸致扭体反应小鼠的镇痛作用影响(均数土标准差，η = 10)。
[0122]
[0123 ] 注:*P〈〇 · 05广P〈0 · 01广*P〈0 · 001与空白对照组比较。
[0124] 本发明新骨架生物碱化合物的抗肿瘤作用。
[0125] i主要材料。
[0126] 1.1药品和试剂：实验所用新骨架生物碱化合物由上述方法制备，纯度为90~ 99%，精密称取，用DMS0稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国 Hyclone公司）；青霉素、链霉素(杭州四季青公司）；
[0127] 1.2细胞株:人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞BGC-823、人肺 腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、卵巢癌细胞Ho-8910、人类 口腔表皮样癌细胞KB (中科院上海细胞库）。
[0128] 1.3分组:分为对照组、实验组和调零组(含DMS0溶媒的培养液）。
[0129] 2实验方法。
[0130] 2.1细胞培养，DMEM高糖培养基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（100U/mL青霉素 和100yg/mL链霉素），置于37 °C、5 % C02培养箱中培养。
[0131 ] 2.2MTI法检测细胞增殖，取对数生长期细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1 X 104个/mL，每孔100yL，温度37°C，5%C02条件下培养过夜后，实验组加入不同浓度的本发明 三种新化合物，每组设3个复孔，加药后置于37 °C，5 % C02培养箱中培养48h。将含药培养液 吸去，加入体积比为4:1的无血清培养液和MTT (终质量浓度为5mg/mL)共1 OOmL，继续孵育 4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMS0 150yL，放于震荡器上震荡以使结晶完全溶解 (5min)，酶标仪在570nm波长下检测各孔的吸光度(A)值。然后，计算各浓度化合物对细胞生 长的抑制率，抑制率公式:细胞生长抑制率=(1-A細fL/A*ML) X 100%，再应用SPSS软件处理 数据，将抑制率对药物浓度作曲线，计算IC5〇值。
[0132] 3实验结果。
[0133] 实验结果表明本发明三种新化合物对人结肠癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF-7、 人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞SPC-A1、人肝癌细胞BEL-7402、人宫颈癌细胞Hela-229、 卵巢癌细胞Ho-8910、人类口腔表皮样癌细胞KB、的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增大， 抑制率也明显升高，即呈浓度依赖。本发明三种新化合物对上述八种肿瘤细胞IC 5Q值见表8。
[0134] 表8本发明三种新化合物对肿瘤细胞的抑制作用。
[0135]
[0136] 综上所述，本发明提供三种新骨架生物碱化合物及其提取分离方法，依次采用水 煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、0DS中压柱层析、及Sephadex LH-20柱层析，成功的 提取分离出新骨架生物碱化合物，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物 纯度较高，由于所得三种化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗 炎、镇痛、抗肿瘤作用，因此本发明三种新化合物及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中 药新药，具有广阔的前景。
【主权项】
1. 一种马齿苋中新骨架生物碱化合物，其特征在于，分子为C18H26N2O 3,命名为 Oleracimine，化学结构式如下。2. -种马齿苋中新骨架生物碱化合物，其特征在于，分子式为C18H24N2O2，命名为 Oleracimine，化学结构式如下。3. -种马齿苋中新骨架生物碱化合物，其特征在于，分子式为C18H28O2,命名为 Oleracone A，化学结构式如下。4. 如权利要求1至3所述的化合物的提取分离方法，其特征在于，具体步骤为： 步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液过滤，合并滤液直接加热浓缩，放 凉至室温，得药液备用； 步骤2、将步骤1中浓缩液用乙酸乙酯反复萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙 脂萃取物； 步骤3、将步骤2中乙酸乙脂萃取物经硅胶柱层析分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱得 到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并显色的洗脱部位，将合并后的洗脱部位 经减压浓缩至干，备用； 步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅 胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将 各显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用； 步骤5、将步骤5中所得各浓缩物经预处理的Sephadex LH-20(羟丙基葡聚糖凝胶），分 别以甲醇-水等度洗脱得到来源于马齿苋新骨架生物碱化合物。5. 如权利要求1所述提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中水煎煮提取两次，每次煎 煮2小时，水用量为药材的8~16倍。6. 如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的 预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平 衡。7. 如权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中浓缩液用乙酸乙酯萃 取3次，乙酸乙酯与浓缩液的体积比为10:1。8. 如权利要求4所述的化合物用于制备抗炎、镇痛和抗肿瘤的药物或保健品。
【文档编号】A61P35/00GK106008502SQ201610398734
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】英锡相, 英哲铭, 张文洁, 李翠玉
【申请人】辽宁中医药大学