用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物和鉴定方法

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物和鉴定方法。

背景技术：

杨树是杨属(populus)树种的统称，杨树具有生长快、成材早、产量高、易于更新等特点。杂交是林木遗传育种中最常用且最有效的方法。杨树的杂交已有100多年的历史，并选育出一批速生、抗病虫的优良品种而广泛应用于林业生产。杂交育种仍然是目前及今后更长时间培育杨树新品种的重要手段。远缘杂交可以把亲本双方的基因组整体融合，即把一个基因组有利性状的基因导入到另外一个树种中去，可以培育出速生、抗病虫、抗逆性强的新品种。种间杂交授粉过程中，由于室外套袋授粉容易引起种内花粉的污染，而杨树的选育周期较长，因此对杨树苗期杂交子代的真实性鉴定，对杨树种间杂交速生、抗病虫、抗逆等优良性状品种的选育具有重要的意义。

目前，杨树种间杂交子代鉴别技术主要有以下几种。(1)形态学标记：缺点是自然突变等获得具有特定形态特征所需的时间较长，遗传表达不稳定，表型还容易受环境条件的影响，因此，简便性和准确性远远不够；(2)细胞学标记：缺点是在杨树细胞学研究方面，目前研究只在染色体数目和核型分析层面，没有开发出对远缘杂交子代鉴定的细胞学标记；(3)生化标记：缺点是由于翻译后的修饰作用、组织特异性和发育的阶段性，特别是多态性位点较少，以及染色方法使用放射性材料，电泳条件因酶而异需要逐个调整，且谱带受材料和环境影响较大，鉴定结果不容易令人信服，因此其使用受到了一定的限制；(4)dna分子标记：以植物dna为研究对象，从植物基因组水平检测特异性dna片段的长度多态性，可以准确鉴定植物种、无性系以及品种，且检测不受植物发育时间的限制，也避免环境变化对植物的影响，从而提高了鉴别的准确性。

dna分子标记主要包括rflp、rapd、issr、aflp、ssr和snp这几种。

rflp标记具有共显性的特点，能够区别纯合与杂合基因型，不受显隐关系、环境条件和发育条件的影响，可以提供单个位点上的较完整的信息。然而rflp分子标记技术在实际的推广应用过程中仍然存在缺陷，标记数量少，其操作技术也较为复杂，采用的放射性标记对人体有害等缺点，因而很难被广泛的应用于植物品种遗传鉴别。

rapd和issr都是显性分子标记，由于引物是一段较短的随机序列，因此扩增检测结果容易受外源dna污染的影响，扩增重复性和稳定性较差，从而严重影响鉴别结果的可靠性。

aflp标记也是以pcr为基础来检测dna限制性片段的长度多态性，结合了rflp和rapd两种分子标记技术的特点，具有多态性高、重复性强等特点。根据孟德尔遗传定律，aflp标记可以用于种间杂交子代的鉴别。采用aflp标记进行子代真实性鉴别时，首先需要将亲本和子代的dna进行酶切、然后连接接头、预扩增和选择性扩增等，最后需要采用毛细管电泳检测，aflp检测操作复杂，耗时耗力。

ssr分子标记是一类由2～6核苷酸为串联重复单位组成串联重复序列，广泛分布于动植物的基因组中。ssr标记主要具有数量丰富、呈共显性遗传、扩增的特异性高、重复性好等优点，在广泛应用于植物的品种鉴别中。如张红莲(2010)等采用ssr对鹅掌楸属及其杂种鉴定时，从176对引物中只筛选出了1对引物可用于鹅掌楸种间杂交子代的鉴定。物种特异性的ssr分子标记开发耗时耗力，而且效率很低。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，简称snp)，是指基因组水平的单个核苷酸变异引起的dna序列多态性。snp是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。snp标记广泛存在于动植物的基因组中，这些多态性可能是由于rflp引起的，也可能是ssr变异引起的，但90％以上的差异是由snp造成的，因此snp作为第三代遗传标记进行研究显得尤为重要。随着第二代、第三代测序技术的飞速发展，使在全基因组水平上开发snp标记成为可能。snp作为新一代分子标记，逐渐被广泛的应用于遗传学的各个领域，也为植物品种分子鉴别、分子标记辅助选择育种等研究提供一种重要的工具。

目前，国内外基于杨树种间杂交分子鉴别的研究较少。在杨树分子鉴别方面，rahman(2002)等采用10个ssr位点对美洲黑杨、欧洲黑杨、香脂杨、毛果杨、大齿杨和辽杨的96个无性系进行鉴别，刘海琳(2017)等采用了10个ssr位点，对美洲黑杨的43个无性系进行鉴别，而上述这些研究只是对杨树种间个体进行区分。叶培忠(1959)等对杨树派间进行了大量的杂交实验，但对这些杂交子代的真实性判断仅限于形态学上的差异。彭儒胜(2018)等对美洲黑杨和山杨进行了正反交，但也只采用了形态学进行了杂交子代的鉴定。李毅等(2002)以箭杆杨为母本和胡杨进行杂交，采用了rapd标记对子代进行鉴别，确定了子代是箭杆杨和胡杨的杂种。杨成超(2015)等采用aflp技术对银白杨和白榆科间杂交进行了鉴定。而上述这些鉴别采用的都是常规的显性分子标记检测技术(如图1所示)，如果污染花粉和杂交父本基因型相同，那么种间杂交子代和污染花粉杂交子代相同，因此不能确定杂交是否为真实的，从而容易导致鉴别结果的可信度低。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物。

本发明的第二目的在于提供鉴别引物在鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代或制备用于鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的产品中应用。

本发明的第三目的在于提供一种试剂或试剂盒。

本发明的第四目的在于提供一种鉴别美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物，所述鉴别引物包括如下(a)和/或(b)：

(a)chr2_1f：5’-ttgtgcctttttgtttcacg-3’(seqidno.1)；

chr2_1r：5’-tgaacaaaagccaccatagc-3’(seqidno.2)；

(b)chr13_14f：5’-ggtgaccttcatcgtgaaaaa-3’(seqidno.3)；

chr13_14r：5’-agccccacatgtgcatactt-3’(seqidno.4)。

上述的鉴别引物在鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代中的应用。

上述的鉴别引物在制备用于鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的产品中应用。

进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。

一种试剂，包括上述的鉴别引物。

一种试剂盒，包括上述的鉴别引物或试剂。

一种鉴别美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的方法，利用上述的鉴别引物对目标基因组进行pcr扩增，检测扩增产物，出现两条带为美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代。

进一步地，(a)的鉴别引物：扩增产物出现一条128bp的条带，目标基因组为美洲黑杨；扩增产物出现一条139bp的条带，目标基因组为小叶杨。

进一步地，(b)的鉴别引物：扩增产物出现一条132bp的条带，目标基因组为美洲黑杨；扩增产物出现一条144bp的条带，目标基因组为小叶杨。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明使用生物信息学和分子生物学手段，筛选出美洲黑杨和小叶杨物种特异的引物序列，可代替传统分子标记用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交的快速检测。采用的引物具有以下优势：(1)筛选的引物分别采用两个物种自然群体50个个体进行检测，证明了该鉴别引物在美洲黑杨和小叶杨两种物种中扩增产物长度存在特异性；(2)两对引物分别位于第ii和第xiii染色体上，两个引物之间不存在共分离现象，两对引物任意一对都可以鉴定种间杂交子代，两对引物同时使用可以提高鉴别的准确性；(3)筛选出的引物特异性好，使用此引物进行鉴别可以直接排除花粉污染等造成的错误检测结果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明背景技术中常规分子标记检测原理图；

图2为本发明中物种特异分子标记检测原理图；

图3为本发明实施例1中引物通用性筛选；

图4为本发明实施例1中物种特异性引物验证；

图5为本发明实施例2中种间杂交子代真实性鉴别验证；

图6为本发明实施例1中物种特异性引物验证；

图7为本发明实施例2中种间杂交子代真实性鉴别验证。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物，鉴别引物包括如下(a)和/或(b)：

(a)chr2_1f：5’-ttgtgcctttttgtttcacg-3’(seqidno.1)；

chr2_1r：5’-tgaacaaaagccaccatagc-3’(seqidno.2)；

(b)chr13_14f：5’-ggtgaccttcatcgtgaaaaa-3’(seqidno.3)；

chr13_14r：5’-agccccacatgtgcatactt-3’(seqidno.4)。

本发明使用生物信息学和分子生物学手段，筛选出美洲黑杨和小叶杨物种特异的引物序列，可代替传统分子标记用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交的快速检测。采用的引物具有以下优势：(1)筛选的引物分别采用两个物种自然群体各50个个体进行检测，证明了该鉴别引物在美洲黑杨和小叶杨两种物种中扩增产物长度存在特异性；(2)两对引物分别位于第ii和第xiii染色体上，两个引物之间不存在共分离现象，两对引物任意一对都可以鉴定种间杂交子代，两对引物同时使用可以提高鉴别的准确性；(3)筛选出的引物特异性好，可以避免花粉污染等造成的错误检测结果。本发明中的鉴别引物鉴定原理如图2所示。

本发明中的鉴别引物可以用于鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代，也可以制备成产品，例如试剂或试剂盒。含有鉴别引物的试剂或试剂盒也属于本申请的保护范围，该试剂或试剂盒可以简便、准确地鉴定出杂交子代是美洲黑杨、小叶杨，还是小黑杨(小黑杨是小叶杨和黑杨的杂交种)。

本发明还保护一种鉴别美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的方法，利用鉴别引物对目标基因组进行pcr扩增，检测扩增产物，出现两条带为小黑杨。在本发明中，可以利用上述(a)中引物对或(b)中引物对，以及(a)和(b)的引物对进行检测，利用两种引物对对目标基因组进行检测，可以提高鉴定的准确性。

例如，利用(a)的鉴别引物时：扩增产物如果出现一条128bp的条带，目标基因组为美洲黑杨；扩增产物如果出现一条139bp的条带，目标基因组为小叶杨；扩增产物如果同时出现上述2条条带，目标基因组为小黑杨。

例如，利用(b)的鉴别引物：扩增产物如果出现一条132bp的条带，目标基因组为美洲黑杨；扩增产物如果出现一条144bp的条带，目标基因组为小叶杨；扩增产物如果同时出现上述2条条带，目标基因组为小黑杨。

例如，利用(a)和(b)的引物时：用(a)中引物对和(b)中引物对分别对目标基因组进行pcr扩增，扩增结果参见上述结果，当二者结果一致时，可以得到鉴定结果。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1引物的筛选

分别以美洲黑杨和小叶杨自然群体中20个个体的重测序序列，将重测序结果比对到小叶杨或美洲黑杨基因组，选取美洲黑杨20个个体都和参照基因组存在相同长度的indel，而在20个小叶杨个体都和参照基因组没有差异的位点；或者小叶杨20个个体都和参照基因组存在相同长度的indel，而在20个美洲黑杨个体都和参照基因组没有差异的位点，这些位点被认为是物种特异的序列。提取这些位点上下游各200bp的序列，采用pirmer3进行引物设计，将设计的引物采用seqhunter2与美洲黑杨和小叶杨基因组比对，鉴别出两个物种通用的引物序列。

对上述检测出来的通用性引物，采用小叶杨和美洲黑杨各一个样品的dna进行pcr扩增，结合urea-page电泳结果进行通用性和多态性检测。结果如图3所示，图中psi2-1、psi10-2、psi11-7、psi11-8、psi12-12和psi13-14是六对引物的扩增结果，从图3中可以看出，psi2-1和psi13-14在小叶杨和美洲黑杨中扩增的条带存在长度差异，因此被确定为多态性引物。

psi2-1的引物序列具体如下：

chr2_1f：5’-ttgtgcctttttgtttcacg-3’(seqidno.1)；

chr2_1r：5’-tgaacaaaagccaccatagc-3’(seqidno.2)；

扩增产物出现一条128bp的条带，目标基因组为美洲黑杨；扩增产物出现一条139bp的条带，目标基因组为小叶杨。

psi13-14的引物序列具体如下：

chr13_14f：5’-ggtgaccttcatcgtgaaaaa-3’(seqidno.3)；

chr13_14r：5’-agccccacatgtgcatactt-3’(seqidno.4)；

扩增产物出现一条132bp的条带，目标基因组为美洲黑杨；扩增产物出现一条144bp的条带，目标基因组为小叶杨。

选取上述多态性引物，再用美洲黑杨和小叶杨各50个自然群体进行物种特异性验证。如图4中为psi2-1引物对扩增小叶杨和美洲黑杨的部分结果，左侧12个条带为小叶杨自然群体12个个体扩增结果，右侧12个条带为美洲黑杨自然群体12个个体扩增结果。如图6中为psi13-14引物对扩增小叶杨和美洲黑杨的部分结果，左侧12个条带为小叶杨自然群体12个个体扩增结果，右侧12个条带为美洲黑杨自然群体12个个体扩增结果。筛选出美洲黑杨和小叶杨自然群体种内50个个体条带一致，而种间存在差别的引物，这些就为物种特异性条带。我们共选取五个通用性引物进行多态性验证，共获得两个物种特异的多态性引物。

实施例2特异性验证

将上述实施例1中的物种特异的多态性引物psi2-1，采用美洲黑杨、小叶杨和小黑杨进行验证。

如图5所示，左侧10个条带为小叶杨，中间4个条带为小黑杨，最右侧10个条带为美洲黑杨，所有小叶杨和黑杨都扩增出了物种特异的条带，而小黑杨同时继承了小叶杨和美洲黑杨的条带，证明了小黑杨是种间杂交的真实性，同时也验证了这些物种特异引物可以用于美洲黑杨和小叶杨杂交子代的鉴别。

将上述实施例1中的物种特异的多态性引物psi13-14，采用美洲黑杨、小叶杨和小黑杨进行验证。

如图7所示，左侧10个条带为小叶杨，中间4个条带为小黑杨，最右侧10个条带为美洲黑杨，所有小叶杨和黑杨都扩增出了物种特异的条带，而小黑杨同时继承了小叶杨和美洲黑杨的条带，证明了小黑杨是种间杂交的真实性，同时也验证了这些物种特异引物可以用于美洲黑杨和小叶杨杂交子代的鉴别。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

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