起子保护剂配方及其用途的制作方法

1.本发明涉及关于一种起子(starter)保护剂配方，尤其可同时适用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的起子保护剂配方。


背景技术：

2.由于天然的微生物的菌数通常不达实际使用所需的数目，并且在保存上也十分不易，时常受到环境的刺激或多代培养后产生突变，故多以经热风燥或冷冻干燥处理过的“起子”(starter)形式进行使用与流通。以食品工业为例，由于其操作体积庞大，在工艺中若需使用微生物进行发酵时，无法直接使用天然的菌进行。往往会利用已被驯化的起子先行扩培，达足够菌数后才进行后续工艺。实际的产业应用范围包括如需要酵母作为原料的产业，如：啤酒的发酵与面包的烘焙产业。另外如应用于农业的生物制剂产业中，所生产的生物制剂产品也面临高且能够稳定维持的活菌数的要求，因此也适用于以起子先行扩培。因此在发掘特色潜力菌株后，需要一种起子配方，其可达到高稳定性与高活菌数的目的，藉以增加工艺中的应用弹性。同时也可以将菌体以起子的形式贩卖，增加产品革新的速度与多元性。
3.cn106244459a揭示一种假单胞菌干粉及其制备方法，该假单胞菌干粉包含假单胞菌和保护剂，其中该保护剂包括脱脂奶粉，甘露醇，麸氨酸钠或甘氨酸，玉米淀粉和海藻糖。
4.cn107828683a揭示一种延长酸乳保质期的植物乳杆菌冻干粉及制备方法，其通过将植物乳杆菌菌株和乳化保护剂混合并冻干来制备植物乳杆菌冻干粉，其中植物乳杆菌菌株被保存在中国通用微生物培养物收集中心（cgmcc）中，保藏编号为cgmcc no. 10453。该制备方法包括菌株活化，菌株繁殖，发酵培养和冻干的步骤。植物乳杆菌冻干粉对发酵乳制品中的主要腐败霉菌和酵母具有抑制作用。
5.目前的起子保护剂配方存在着培养时活菌数偏低的缺点，尤其在起子保护剂配方于制备完成后经过一段时间才被使用时，活菌数更是大幅下降。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种起子保护剂配方，其可以改善活菌数及存活率偏低的缺点，尤其一种具有改良的稳定性的起子保护剂配方，其在储藏一段时间后与刚制备完成的起子保护剂配方相较仍然具有可相比拟的活菌数。
7.依本发明目的所完成的一种起子保护剂配方包含：1.125
±
10%重量份的海藻糖；2.25
±
10%重量份的脱脂奶粉；1.125
±
10%重量份的甘露醇；0.0225
±
10%重量份的维生素c；0.225
±
10%重量份的麸氨酸钠；及0.225
±
10%重量份的甘油。
8.本发明的其它较佳实施例包括但不限于以下申请专利范围所描述者。
9.本发明的起子保护剂配方具有一个特点，即无论被用于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的培养都具有改善的活菌数及存活率。
附图说明
10.图1示出以本发明实施例1的表1中的各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的活菌数。
11.图2至图4分别示出以本发明实施例1的表1中的各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的活菌数。
12.图5示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的活菌数。
13.图6示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的活菌数。
14.图7示出以本发明实施例1的表1中的各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的存活率。
15.图8至图10分别示出以本发明实施例1的表1中的各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的存活率。
16.图11示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的存活率。
17.图12示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的存活率。
18.图13示出以本发明实施例1的表1中的各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子及其于25℃与54℃保存14天后于30℃培养72小时后的活菌数。
具体实施方式
19.本发明及其改良之处将藉由以下的实施例及对照例被进一步了解。于以下的实施例及对照例使用下列的材料及仪器。
20.材料脱脂奶粉merck酪蛋白merck甘油sigma维生素csigma海藻糖sigma蔗糖sigma麸氨酸钠(味精)味全span60sigmaymbrothgibicopseu f 琼脂培养基配方胰蛋白胨1%merck胰化蛋白1%merck
磷酸氢二钾(k2hpo4)0.15%sigma硫酸镁(mgso4)0.15%sigma琼脂（agar）sigma仪器恶臭假单胞菌培养方式选定恶臭假单胞菌ylw01 (pseudomonas putida)为实验菌株。ylw01培养于含有1% molasses、1% msg、1.5 g/l k2hpo4与1.5 g/l mgso
4.
7h2o的培养基(50 ml培养基/250 ml三角瓶)，于30℃、150 rpm培养42 hr。待培养结束后于4℃以8000 rpm离心10分钟，舍弃上清液后以水清洗并再次离心，且重复两次此清洗法。之后取出离心后的菌泥并放置于冰箱保存。
21.酵母菌培养方式选定酵母菌21849、20405、22745为实验菌株。酵母菌21849、20405、22745培养于ym broth (becton dickinson and company)培养基(50 ml培养基/250 ml三角瓶)，于25℃、250 rpm培养48 hr。待培养结束后于4℃以8000 rpm离心10分钟，舍弃上清液后以水清洗并再次离心，且重复两次此清洗法。之后取出离心后的菌泥并放置于冰箱保存。
22.保护剂配方/保护液的配制保护液以表1的保护剂配方溶于22.5 ml的水进行配置，并搅拌30分钟直至溶解均匀后，以下列的磷酸盐溶液（由碱性往酸性调整）或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（由酸性往碱性调整）进行ph调整至7或8。
23.表1：保护剂配方(g)/保护液(g/vol %)
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制：50 ml甘氨酸水溶液(0.2m)与8.8 ml氢氧化钠水溶液(0.2m)混合均匀后定量至200 ml。
24.磷酸盐溶液配制：87.7 ml磷酸二氢钠水溶液(0.2m)与12.3 ml磷酸一氢钠水溶液(0.2m) 混合均匀后定量至200 ml。
25.实施例1起子的配制将前述制备的菌泥从冰箱取出，以7.5 g菌泥与表1的各保护液分别进行混合，搅拌30分钟至混合均匀后，于-20℃预冻后进行冷冻干燥得到起子。
26.将刚制备好的冻干起子取1 g起子回溶至10 ml水中，并进行适当倍率的系列稀释，取100 μl的起子稀释液涂抹至pseu f培养基上，置放30℃进行72小时培养后进行菌落记数。
27.对照例1以前述cn106244459与cn107828683的配方进行起子的配制。取表2及表3的保护液22.5 ml与前述制备的菌泥7.5 g分别进行混合，搅拌30分钟至混合均匀后，于-20℃预冻后进行冷冻干燥得到对照例1的起子。
28.将刚制备好的冻干起子取1 g起子回溶至10 ml水中，并进行适当倍率之系列稀
释，取100 μl的起子稀释液涂抹至pseu f培养基上，置放30℃进行72小时培养后进行菌落记数。
29.表2 cn106244459保护液(g/vol %)
组别海藻糖(%)脱脂奶粉(%)甘露醇(%)酵母粉(%)味精(%)span60(%)甘氨酸(%)玉米淀粉(%)cn106244459-11250.513230.1cn106244459-25125301152
表3 cn107828683保护液(g/vol %)
组别海藻糖(%)脱脂奶粉(%)甘油(%)甘露醇(%)蔗糖(%)抗坏血酸水cn107828683681240.578.5
结果图1示出以实施例1的表1中的各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的活菌数。于图1中可发现恶臭假单胞菌活菌数皆维持在10
9 cfu/g以上，显示本发明的保护剂具有良好的保护效果。其中又以组别2具有最高的活菌数达6.3x10
9 cfu/g。
30.图2至图4分别示出以实施例1的表1中的各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的活菌数。酵母菌21849、20405、22745的活菌数最高分别为3.44x10
9 cfu/g (图2组别5)、3.75x10
9 cfu/g (图3组别7)与5x10
9 cfu/g (图4组别3)。
31.图5示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的活菌数。于图5中可发现恶臭假单胞菌活菌数分别为5.8x107、8.8x108与2.6x10
8 cfu/g。
32.图6示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的活菌数。培养效果均不佳，大多活菌数在10
8 cfu/g，最高活菌数的组别为酵母菌22745使用cn106244459-2的配方，达1.99x10
9 cfu/g。
33.图7示出以实施例1的表1中的各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的存活率。存活率计算方法如下：存活率(%) = [冻干后活菌数(cfu) /冻干前添加之菌数(cfu)]*100%于图7中可发现恶臭假单胞菌活菌数皆维持在15%以上，其中又以组别2具有最高的存活率达约78%。图7中各组别的存活率的表现与图1中之活菌数的表现类似。
[0034]
图8至图10分别示出以实施例1的表1中的各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的存活率。酵母菌21849、20405、22745的存活率最高分别为53.22%(图8组别3)、47.2%(图9组别3)与47.41%(图10组别3)。
[0035]
图11示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于30℃培养72小时后的存活率。于图11中可发现恶臭假单胞菌的存活率分别为0.07%、1.02%与0.3%。
[0036]
图12示出以对照例1的表2及表3中各保护液组别制备的酵母菌21849、20405、22745起子于25℃培养72小时后的存活率。图12示出的存活率与图6的活菌数具有相同的趋势，大约在2%左右，其中最高的组别为cn106244459-1于酵母菌20405的培养。
[0037]
从以上图1至图12可以看出，以恶臭假单胞菌及3种酵母菌(21849、20405、22745)进行本发明之配方与前案的配方的测试，可发现本发明之配方其活菌数与存活率相较于前案配方cn106244459-1、cn106244459-2 与cn107828683都有显著性的提高。证明本发明具
有出乎意料的增进功效。
[0038]
实施例2：冻干起子稳定性测试将实施例1制备的冻干起子放置于25℃与54℃进行14天保存后，取1 g起子回溶至10 ml水中，并进行适当倍率的系列稀释，取100 μl的恶臭假单胞菌起子稀释液涂抹至pseu f培养基上，置放30℃进行72小时培养后进行菌落记数。
[0039]
结果被示于图13，其中同时显示刚制备好的冻干起子的活菌数。图13显示出以本发明实施例1的表1中的各保护液组别制备的恶臭假单胞菌起子于25℃保存14天后于30℃培养72小时后，多数配方组别的活菌数明显下降，又以组别2下降幅度最大，但活菌数仍维持在2 x 10
8 cfu/g。组别4的下降幅度最小，活菌数达1.2 x 10
9 cfu/g，并维持在87%以上的存活率（未显示于图中）。从图13中于54℃保存14天后的培养结果可发现活菌数大幅度下降，多数组别的活菌数已降至10
7 cfu/g以下，仅组别3、4与7仍然维持在10
7 cfu/g以上，又以组别7之活菌数最高，达6.2 x 10
7 cfu/g。本发明的冻干起子具有良好的稳定性，于25℃环境下存放14天仍可维持2 x 10
8 cfu/g以上的活菌数，比刚制备好的冻干起子只低约一个对数值。