一种α构型核苷及其在治疗猫冠状病毒感染的应用的制作方法

本发明涉及兽药领域，具体涉及一种α构型核苷及相应的前药、其溶剂合物、或药学上可接受的盐、包含所述化合物的药物组合物，以及在治疗猫或其他动物冠状病毒感染的应用。
背景技术：
：猫冠状病毒（fcov）在猫中广泛存在，全世界估计有40~80%的猫携带该病毒。在自然界中，fcov以两种不同的生物型存在：猫肠道冠状病毒（fecv）和猫传染性腹膜炎病毒（fipv），后者是前者的突变形式。fecv感染的猫大多数是无症状的，但fipv感染容易侵入其他器官，发展成传染性腹膜炎（fip）。此病好发于3-9个月的年轻猫，尤其常发于群聚饲养的猫群。病程可能是突发性（幼猫较常发生）或缓慢且持续数周。初期症状不明显，可能出现食欲减退、精神差、体重下降、持续发烧（39.5~40.6℃，黄昏时较高，入夜后会慢慢下降）。后期症状会明显分成干湿两型。本病致死率高达95%，前期诊断存在一定难度，一般相信唯有组织病理学检查才能100%确诊。在治疗上，目前没有针对fip的特效药物。一旦发现感染，一般采取支持疗法：强制进食（以食道或胃管），输液以矫正脱水，胸腔穿刺术以舒缓呼吸症状等。也常使用抑制免疫和抗炎症药物，如高剂量类固醇、细胞毒性药物等。因此，需要发明用于治疗猫传染性腹膜炎的药物。技术实现要素：要解决的技术问题：本发明的目的是提供用于通过化合物α构型核苷及相应的前药、其溶剂合物、或药学上可接受的盐、包含所述化合物的药物组合物，来治疗猫或其他动物冠状病毒感染的方法。技术方案：化合物α构型核苷及相应的前药、其溶剂合物、或药学上可接受的盐，其中，所述化合物具有式（ⅰ）所示结构：（ⅰ）其中：r1是h，或-cor’，或；r2、r3、r4分别独立的选自h，或-cor5；r5是c1-8直链或支链烷基或取代烷基，c3-8环烷基或取代环烷基，芳基或取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；w是oh，或，或nhchr6coor7；x是oh，或苯酚基，或萘酚基；r6是c1-8直链或支链烷基或取代烷基，c3-8环烷基或取代环烷基，芳基或取代芳基、杂芳基或取代杂芳基；r7是c1-8直链或支链烷基或取代烷基，c3-8环烷基或取代环烷基，芳基或取代芳基、杂芳基或取代杂芳基。优选的，其中r1、r2、r3、r4均为h。优选的，其中r1、r2、r3均为h，r4为-cor5。优选的，其中r4为h；r1为h，-cor’；或r2、r3分别独立的选自h，或-cor5；优选的，其中r1是。优选的，其中r1是。优选的，其中w是nhchr6coor7；x是oh，或苯酚基，或萘酚基。优选的，其中所述结构选自以下化合物之一：，，，，，，，，，。药物组合物，所述药物组合物包含上述的α构型核苷及相应的前药、其溶剂合物、或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料、载体、稀释剂或其他抗病毒药物。α构型核苷及相应的前药、其溶剂合物、或药学上可接受的盐，及其药物组合物在制备治疗猫或其他动物冠状病毒感染的药物的用途。附图说明：图1是化合物1对猫肾细胞的毒性试验结果；图2是化合物2对猫肾细胞的毒性试验结果；图3是化合物3对猫肾细胞的毒性试验结果；图4是化合物4对猫肾细胞的毒性试验结果；图5是化合物5对猫肾细胞的毒性试验结果；图6是化合物1-5对细胞的毒性试验。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。实施例1化合物1的合成氮气保护下，将化合物1a（25.16g，45.53mmol，1.0eq）溶于无水二氯甲烷（55ml，2.1倍）中，置0℃下搅拌，滴加tfoh（8.1ml，91.06mmol，2.0eq），滴加完毕后，搅拌10分钟。然后缓慢滴加tmsotf（17.3ml，95.61mmol，2.1eq），滴加完毕后，维持此温度下搅拌反应30分钟。缓慢滴加tmscn（22.8ml，182.11mmol，4.0eq），滴加完毕后，0℃以下搅拌2小时。tlc检测原料反应完全，慢慢滴加三乙胺22ml，滴完后，反应液升至室温，然后加入碳酸氢钠（34.42g），滴加水120ml，滴完后搅拌10分钟，分液，收集有机相，水相用二氯甲烷萃取（100ml×1），合并有机相，用水洗（100ml×1），无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得混合物1b。将混合物用柱层析分离得到化合物1c，浅黄色油状物（10.13g，收率：39.6%）。氮气保护下，将化合物1c（10g，17.80mmol，1.0eq）溶于无水二氯甲烷（100ml）中，置-78℃下搅拌，缓慢滴加三氯化硼的二氯甲烷溶液（1m，71.2ml，71.22mmol，4.0eq），期间控制内温不高于-45℃，滴加完毕后，升温至-40℃搅拌反应2小时。tlc检测原料反应完全，再次降温至-78℃，慢慢滴加甲醇20ml，三乙胺（30ml）的甲醇（40ml）溶液，控制温度不高于-40℃。滴完升至室温，浓缩后柱层析得化合物1，白色固体（3.70g，收率：71.4%）。1hnmr(500mhz,dmso-d6):7.90(s,1h),7.85–7.72(m,2h),6.88(d,j=3.5hz,1h),6.65(d,j=3.5hz,1h),5.50(d,j=4.5hz,1h),5.30(d,j=7.0hz,1h),4.99(t,j=5.0hz,1h),4.73(s,1h),4.36(s,1h),3.98(s,1h),3.76–3.74(m,1h),3.56–3.54(m,1h).ms（m/z）：292.13[m+1+]实施例2化合物2的合成将化合物1（0.5g，1.72mmol，1.0eq）混悬于10ml吡啶中，加入dmap（21mg，0.17mmol，0.1eq），室温下滴加异丁酸酐（870mg，5.49mmol，3.2eq）。滴加完毕后，室温搅拌过夜，tlc显示原料反应完毕，将反应液旋干，加入20ml二氯甲烷溶解，加入20ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌10分钟，分液，水相用二氯甲烷萃取（20ml×1），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析得化合物2，白色固体（689mg，收率：79.9%）。1hnmr(500mhz,dmso-d6):8.03(s,1h),7.93–7.81(m,2h),6.93(d,j=3.5hz,1h),6.72(d,j=3.5hz,1h),4.95(s,1h),4.53(s,1h),4.12(s,1h),3.96–3.94(m,1h),3.77–3.75(m,1h),2.63–2.53(m,1h),2.53–2.39(m,2h),1.18-1.12(m,18h).ms（m/z）：502.53[m+1+]实施例3化合物3的合成将化合物1（0.5g，1.72mmol，1.0eq）混悬于10ml吡啶中，缓慢滴加tmscl（653mg，6.01mmol，3.5eq），室温搅拌1小时。然后缓慢滴加辛酰氯（307mg，1.89mmol，1.1eq），室温搅拌至tlc显示原料反应完毕。将反应液旋干，加入20ml二氯甲烷溶解，加入20ml饱和碳酸氢钠溶液搅拌10分钟，分液，水相用二氯甲烷萃取（20ml×1），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，柱层析得化合物2，白色固体（480mg，收率：67.0%）。1hnmr(500mhz,dmso-d6):8.32(br,1h),8.13(s,1h),7.02(d,j=3.5hz,1h),6.81(d,j=3.5hz,1h),5.50(d,j=4.5hz,1h),5.30(d,j=7.0hz,1h),4.99(t,j=5.0hz,1h),4.73(s,1h),4.36(s,1h),3.98(s,1h),3.76–3.74(m,1h),3.56–3.54(m,1h),2.30(t,j=6.0hz,2h),1.56–1.53(m,2h),1.28–1.24(m,8h),0.85(t,j=6.0hz,3h).ms（m/z）：418.45[m+1+]实施例4化合物4的合成将化合物1（0.5g，1.72mmol，1.0eq）混悬于10ml丙酮中，加入2,2-二甲氧基丙烷（0.89g，8.58mmol，5eq），搅拌下滴加浓硫酸（0.26g，2.57mmol，1.5eq），室温搅拌至tlc显示原料反应完毕。加入碳酸氢钠固体1g搅拌30分钟，不再产生气体，浓缩，加入20ml二氯甲烷溶解，加入20ml水搅拌10分钟，分液，水相用二氯甲烷萃取（20ml×1），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得黄色油状物，化合物4a粗品，直接用于下一步反应。将上述黄色油状物（按100%收率算，1.72mmol，1.0eq）溶于20ml四氢呋喃，加入boc-l-丙氨酸（325mg，1.72mmol，1.0eq）、hobt（232mg，1.72mmol，1.0eq）、edci（495mg，2.58mmol，1.5eq）和三乙胺（261mg，2.58mmol，1.5eq），室温搅拌至tlc显示原料反应完毕。加入30ml乙酸乙酯稀释，依次用5%柠檬酸水溶液（30ml×1）、饱和碳酸氢钠水溶液（30ml×1）、饱和水盐水（30ml×1）洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得黄色油状物，化合物4b粗品，直接用于下一步反应。将上述化合物4b粗品溶于10ml四氢呋喃，搅拌下滴加2ml浓盐酸，室温搅拌5小时，tlc显示原料反应完毕，加碳酸氢钠固体2.5g搅拌至无气体产生，过滤，滤液浓缩，柱层析分离得化合物4，白色固体（342mg，三步收率：54.9%）。1hnmr(500mhz,dmso-d6):8.56(br,2h),7.90(s,1h),7.85–7.72(m,2h),6.88(d,j=3.5hz,1h),6.65(d,j=3.5hz,1h),5.57(d,j=4.5hz,1h),5.38(d,j=7.0hz,1h),4.73(s,1h),4.36(s,1h),3.98(s,1h),3.76–3.74(m,1h),3.56–3.52(m,2h),1.27(d,j=5.5hz,3h)ms（m/z）：363.34[m+1+]实施例5化合物5的合成投料化合物1（0.5g，1.72mmol，1.0eq），参照实施例4的方法合成化合物4a，直接用于此步反应。将化合物4a溶于无水乙腈（10ml），加入化合物5a（0.93g，2.06mmol，1.2eq）、无水氯化镁（246mg，2.58mmol，1.5eq），置50℃下搅拌30分钟，然后滴加diea（556mg，4.30mmol，2.5eq），滴加完毕后50℃下继续搅拌1小时，tlc显示原料反应完毕，降至室温，浓缩，加入40ml乙酸乙酯溶解，依次用5%柠檬酸水溶液（30ml×1）、饱和氯化铵水溶液（30ml×1）、5%碳酸钾水溶液（30ml×1）、饱和食盐水（30ml×1）洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得黄色油状物，化合物5b粗品，直接用于下一步反应。将上述化合物5b粗品溶于10ml四氢呋喃，搅拌下滴加2ml浓盐酸，室温搅拌5小时，tlc显示原料反应完毕，加碳酸氢钠固体2.5g搅拌至无气体产生，过滤，滤液浓缩，柱层析分离得化合物5，白色固体（452mg，三步收率：43.6%）。1hnmr(500mhz,meod):7.85(s,1h),7.36(t,j=7.5hz,2h),7.30(d,j=7.5hz,2h),7.19(t,j=7.5hz,1h),6.90(d,j=4.0hz,1h),6.79(d,j=4.0hz,1h),4.98(d,j=3.5hz,1h),4.58(m,1h),4.49–4.46(m,1h),4.34–4.30(m,2h),4.11–4.06(m,2h),4.02(dd,j1=10.5hz,j2=5.5hz,1h),1.50–1.46(m,1h),1.39(d,j=7.0hz,3h),1.36–1.29(m,5h),0.87(t,j=7.0hz,3h).ms（m/z）：603.58[m+1+]实施例6化合物1-5对细胞的毒性试验试验方法：细胞制备：取生长状态良好的crfk细胞在补充有10%胎牛血清(fbs)的dmem培养基中生长。使用血球计数仪和台盼蓝排除法进行总细胞数和生存力百分数测定。用细胞生长液调整细胞密度为1×105/ml接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5%co2培养箱培养16h；16h后，弃去孔中培养基，1×pbs洗三次，甩干后用细胞维持液对化合物1-5进行2倍倍比稀释，使化合物1-5终浓度为1000μm、500μm、200μm、100μm、50μm、25μm、6.25μm，同时设置细胞对照；细胞活力检测：72h后，用celltiter-glo®试剂进行细胞活力检测。试验结果：结果见图1-5，测定细胞存活率能反应化合物1-5对crfk细胞的毒性作用，从图中可以看出，化合物1-5对crfk细胞的毒性作用较小，在低浓度药物作用下(<200μm)可以促进细胞生长，增加细胞活力，其半数细胞毒性浓度(cc50)大于1000μm。实施例7化合物1-5对猫冠状病毒抑制活性的测定细胞制备：取生长状态良好的crfk细胞在补充有10%胎牛血清(fbs)的dmem培养基中生长。使用血球计数仪和台盼蓝排除法进行总细胞数和生存力百分数测定。用细胞生长液调整细胞密度为1×105/ml接种96孔板，100μl/孔，放置于37℃、5%co2培养箱培养16h；病毒活性检测：将化合物1-5的系列稀释液与2.5×104拷贝的猫冠状病毒（fipv）混合，并一式六份添加至具有预先接种的crfk细胞的96孔板中。将板孵育72小时，然后用结晶紫染色细胞培养单层。通过视觉和使用盘式分析仪定量病毒诱导的细胞病变效应的水平。阳性对照孔包含没有化合物1-5的病毒。阴性对照孔缺乏病毒和各化合物1-5中两者。通过回归分析计算ec50，化合物1-5的ec50如表1所示：表1ec50化合物12.236μm化合物23.187μm化合物32.768μm化合物44.017μm化合物52.543μm实验结果：通过测定细胞存活率来计算药物对病毒的抑制率能反应出化合物1-5对fipv的抑制效果，从表1可以看出化合物1-5的半数最大效应浓度(ec50)为2.236-4.017μm。当前第1页12