一种病毒核酸的快速提取试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于生物工程领域，涉及一种检测试剂盒，具体来说是一种病毒核酸的快速提取试剂盒及其使用方法。

背景技术：

病毒的结构相对简单，由外面的衣壳蛋白和内部的核酸物质组成，根据核酸物质可以将病毒分为dna病毒或rna病毒。随着分子生物学的发展，对疾病相关病毒进行检测和分型是分子检测的一个重要应用领域，而从生物材料中高效、简便的提取和纯化目的核酸是分子检测的关键技术。目前病毒核酸纯化技术主要分为三种，分别为传统法、柱膜法和磁珠法。

传统的核酸纯化法主要是裂解细胞释放核酸后用苯酚、氯仿抽提去除蛋白等杂质，然后用醇类进行沉淀获得核酸，最后用水，tb或te缓冲液进行溶解，该方法步骤繁琐，重复性差，耗时较长，并且使用了有机试剂。柱膜法和磁珠法分别是利用硅胶膜和磁珠吸附、纯化核酸，首先利用裂解液将细胞裂解，释放核酸分子，在特定条件下用柱膜或磁珠吸附核酸，然后用洗涤液洗涤去除蛋白等杂质，最后用洗脱液将柱膜或磁珠上的核酸洗脱下来，柱膜法和磁珠法可以获得高质量的核酸，并且可以进行自动化操作，但是需要的样本量比较大，成本较高，耗时较长。煮沸法也是传统的病毒核酸提取方法之一，是通过加热的方法促进核酸的释放，但是该方法提取的核酸纯度较低，对检测的灵敏度影响较大。随着分子生物学技术的发展，尤其是抗逆性taq酶的广泛应用，快速病毒核酸提取试剂盒应用到市场中，快速病毒核酸提取试剂盒，是将病毒核酸释放剂和样本混合释放核酸作为检测的模板，该方法操作简单，成本低，需要的样本量较少，广泛应用于病毒的初筛过程中。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种病毒核酸的快速提取试剂盒及其使用方法，所述的这种病毒核酸的快速提取试剂盒及其使用方法要解决现有技术提取病毒核酸的过程中，样本需求量大、操作复杂、耗时长的技术问题。

本发明提供了一种病毒核酸释放剂，含有tris-hcl、edta、tritonx-100、tween-20、(nh4)2so4、0.1mg/mlpolya；在所述的核酸释放剂中，所述的tris-hcl的浓度为5-50mm，所述的tris-hcl的ph为8.0，所述的edta的浓度为1-5mm,所述的tritonx-100的体积百分比浓度为1-4％,所述的tween-20的体积百分比浓度为1-4％,所述的(nh4)2so4的浓度为50-200mm，所述的0.1mg/mlpolya的体积百分比浓度为0.1-0.5％。

进一步的，本发明还提供了上述的一种病毒核酸的快速提取试剂盒，包括上述的试剂。

本发明还提供了上述一种病毒核酸的快速提取试剂盒的使用方法，包括一个对血浆或血清中的病毒进行释放的步骤，在1.5ml离心管中加入50-100μl的血清或血浆样本，加入样本体积50％的核酸释放剂，涡旋振荡或吹打混匀，室温静置3min，12000rpm离心1min，取2-4μl进行扩增检测。

本发明的试剂盒的原理是：先用表面活性剂(tritonx-100，tween-20)裂解细胞释放核酸，tritonx-100和tween-20是常用的非离子表面活性剂，常用于细胞裂解液中，可以破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接，并且常作为pcr反应体系中的组分，用于提高taq酶的活性；(nh4)2so4可以沉淀样本中的蛋白、脂类等杂质，减少对pcr扩增体系的影响，tris-hcl和(nh4)2so4体系也是常用的pcr扩增体系之一，可以提高pcr扩增体系的稳定性。polya减少在提取过程中微量核酸的损失，提高检测的灵敏度。edta抑制核酸酶的活性，维持核酸的稳定性。

本发明的试剂盒操作简便，不需要使用有机试剂，安全无污染，核酸释放剂的成分和pcr扩增的体系组分很相近，既能有效的释放核酸，也不影响pcr的扩增检测，具有提高pcr检测效率的作用。本发明的试剂盒既可以进行手工操作也可以用于移液法自动化操作平台，可以用于病毒核酸的初筛，具有更加广阔的应用前景。

本发明采用了独特的核酸释放剂，直接将核酸释放剂和样本按比例进行混匀，快速的裂解病毒粒子释放核酸，同时沉淀去除影响扩增检测的蛋白、脂类等抑制物质，降低对扩增检测的影响。充分裂解后，释放的核酸可以直接作为模板进行扩增检测。操作简单、高效，耗时短。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明与常规的病毒核酸提取方法相比较，操作步骤简单，需要的样本量少，高效，无需加热，无氯仿苯酚等有毒试剂。不需要单独分离出核酸物质，核酸释放剂与pcr扩增体系类似，可以用于pcr的直接扩增检测，整个流程不超过5min，安全无污染，适合于工业客户快速、高效、经济的提取病毒核酸。

附图说明

图1显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行qpcr后，为血浆中hbv基因扩增曲线图。

图2显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行qpcr后，为血浆中hcv基因扩增曲线图。

图3显示了采用本发明的试剂盒提取核酸后，对核酸进行qpcr后，为血清中hbv基因扩增曲线图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1血浆中hbv和hcv病毒的检测(与圣湘生物“样本核酸释放剂”进行比较))

(1)病毒核酸的提取

1)在1.5ml离心管中加入血浆50μl(阴性血浆中加入终浓度为50iu/ml的whohbv标准品和终浓度为100iu/ml的whohcv标准品)，加入25μl核酸释放剂，涡旋或吹打混匀，室温静置3min，12000rpm离心1min。

核酸释放剂中含有tris-hcl、edta、tritonx-100、tween-20、(nh4)2so4、0.1mg/mlpolya；所述的tris-hcl的浓度为5-50mm，所述的tris-hcl的ph为8.0，所述的edta的浓度为1-5mm,所述的tritonx-100的体积百分比浓度为1-4％,所述的tween-20的体积百分比浓度为1-4％,所述的(nh4)2so4的浓度为50-200mm，所述的0.1mg/mlpolya的体积百分比浓度为0.1-0.5％。

2)取离心后的上清4μl进行q-pcr检测pcr扩增检测(如图1,2)。

3)对照试剂盒的提取按照说明书的操作步骤进行。

(2)病毒基因的检测

pcr体系：

扩增程序为：

hbv引物和探针：

hbvfp：5'-aggaacctctatgtttccctcct-3'(seqidno.1所示)

hbvrp：5'-cctaaagcccaagatgatggga-3'(seqidno.2所示)

hbv-p：5'-cy5-ccaaaccctcggacggaaactgcac-bhq3-3'(seqidno.3所示)

hcv引物和探针：

hcvfp：5'-gaaccggtgagtacaccggaa-3'(seqidno.4所示)

hcvrp：5'-ggcagtaccacaaggccttt-3'(seqidno.5所示)

hcv-p：5'-fam-atttgggcgtgcccccgcragactg-bhq1-3'(seqidno.6所示)

将本发明和对照试剂盒提取获得的核酸，按照上述的pcr体系和扩增程序进行扩增检测，结果见表1和图1,2。

表1：血浆中hbv和hcv检测的平均ct；

结论：与对照试剂盒相比，本发明(快速核酸提取试剂盒)针对血浆中病毒核酸(hbv和hcv)的提取效率较高。

实施例2血清中hbv病毒的检测与上海科华“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)”(国械注准20163401197)比对,操作步骤参照说明书(核酸提取是煮沸法))。

(1)病毒核酸的提取

1)在1.5ml离心管中加入血清50μl(血清中加入终浓度为100iu/ml的whohbv标准品)，加入25μl核酸释放剂，涡旋或吹打混匀，室温静置3min，12000rpm离心1min。取离心后的上清4μl进行q-pcr检测pcr扩增检测(如图3)。

核酸释放剂中含有tris-hcl、edta、tritonx-100、tween-20、(nh4)2so4、0.1mg/mlpolya；所述的tris-hcl的浓度为5-50mm，所述的tris-hcl的ph为8.0，所述的edta的浓度为1-5mm,所述的tritonx-100的体积百分比浓度为1-4％,所述的tween-20的体积百分比浓度为1-4％,所述的(nh4)2so4的浓度为50-200mm，所述的0.1mg/mlpolya的体积百分比浓度为0.1-0.5％。

2)对照试剂盒的提取按照说明书的操作步骤进行(详见上海科华“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)”使用说明书)

(2)病毒基因的检测

分别用本发明和对照试剂盒提取病毒核酸，然后用对照试剂盒的核酸扩增部分进行pcr扩增检测，pcr体系和扩增程序参照上海科华“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)”说明书，检测hbv的平均ct值见表2：

表2：血清中hbv平均ct；

结论：与对照试剂盒相比，本发明(快速病毒核酸提取试剂盒)针对血清中病毒核酸(hbv)的提取效率较高。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。