一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌及其筛选方法和验证方法与流程

本发明涉及废弃资源再生利用领域，更具体地，涉及一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌及其筛选方法和验证方法。

背景技术：

餐厨垃圾俗称泔水，是居民在生活中形成的固体废弃物，食品浪费的数量正在随着经济社会的发展快速的增加。餐厨垃圾的主要成分包括了肉类，蔬菜，油脂，米饭等物质，由于餐厨垃圾产量巨大，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等多种有毒有害的病原微生物经常会在含有丰富营养物质的餐厨垃圾中滋生，如果不及时处理还会伴随着大量的带有臭味的气体nh3和h2s以及毒素等物质的产生。不仅会造成严重的环境问题，还会造成对人的健康和危害。所以，有必要对餐厨垃圾进行处理，以减少其不利影响。

现有技术中，为了避免其不利影响，产生了各种利用餐厨垃圾的方法，其中就包括微生物发酵技术，其应用在餐厨垃圾处理上不仅能够降解餐厨垃圾减少污染，更能利用餐厨垃圾中的糖类等物质产生一些高附加值的产品乙醇，提升了废弃资源的利用价值。且乙醇的适用范围广泛，能够应用于不同领域，所以通过微生物发酵技术处理餐厨垃圾产乙醇是一种能带来显著经济效益的废弃资源再利用方式。尤其是利用餐厨垃圾产乙醇作为一种可再生能源方式，能够缓解日益严重的石油危机。

但现有的应用于餐厨垃圾降解的微生物仍存在缺陷，餐厨垃圾的成分较为复杂，辣椒就是常常出现在餐厨垃圾中的一种成分，而辣椒的活性成分辣椒素则会对微生物的生长和发酵产生影响，在一定量辣椒素存在的情况下，微生物的生长和发酵都会明显受到抑制，阻碍了利用微生物对餐厨垃圾的直接发酵，降低了餐厨垃圾利用效果。所以微生物降解餐厨垃圾领域迫切需要一种耐受辣椒又能在含辣椒的环境中生长、高产乙醇的菌株。

酵母菌广泛分布于富含糖的环境中，如一些水果(葡萄、苹果、桃等)和植物分泌物(如仙人掌的汁)等，而甘蔗糖蜜作为制糖工业的副产物，其中含有大量的可发酵糖，是良好的发酵原料，所以甘蔗糖蜜中含有大量的自然界野生型酵母菌。由于甘蔗糖蜜自身较为粘稠且灰分和胶体类物质含量高的特点，在甘蔗糖蜜中存活的酵母往往具有渗透压耐受性强、适宜高温发酵，耐酸性强、酶活性强和酒精发酵能力强的优势，因此能够从甘蔗糖蜜中筛选出多种活性良好的酵母菌种。

技术实现要素：

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌的筛选方法，筛选出的菌株能够适应辣椒环境，能在辣椒存在的前提下生长并利用餐厨垃圾中常见组分高产乙醇。

本发明的又一目的是，提供一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌的验证方法，通过该验证方法能够对筛选出的耐受辣椒的乙醇高产酵母菌进行耐受辣椒验证，并在辣椒环境下对其生长、发酵能力进行验证，从而获得经验证的耐受辣椒且高产乙醇酵母菌，有助于其投入实际应用中。

本发明的再一目的是，提供一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌，能够适应辣椒环境并具有高效高产乙醇的能力，能够应用于餐厨垃圾的微生物降解中，从而解决现有技术中因辣椒素影响餐厨垃圾降解的技术问题。

本发明采取的技术方案是，一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌的筛选方法，包括以下步骤：

s1、筛选出甘蔗糖蜜中的乙醇高产酵母菌株，记为lsk1；优选的，步骤s1中先获取并确定甘蔗糖蜜中包含的多个酵母菌株，然后对各个酵母菌株进行发酵利用葡萄糖能力的测定，筛选出其中的乙醇高产菌株lskl，此处的乙醇高产菌株即为葡萄糖利用率高和发酵速度快的菌株。本发明先将甘蔗糖蜜加入至液体培养基中培养，培养一定时间后取出部分培养液并稀释，将稀释后培养液涂在固体培养基上培养一定时间直至长出单菌落，通过将该单菌落挑入液体培养基中培养并取单菌落菌液进行观察，从而获得和确定酵母菌株；通过对确定的各个酵母菌株进行发酵利用葡萄糖能力测定，从而获得其中发酵葡萄糖生成乙醇能力较强的菌株，即乙醇高产菌株，记为lsk1。酵母菌能够利用餐厨垃圾中葡萄糖等糖类物质进行发酵，而筛选出的乙醇高产酵母则能实现餐厨垃圾中葡萄糖的充分利用，避免利用率低而产生的资源浪费，且有助于餐厨垃圾的快速发酵，缩短其发酵时间。

s2、使lsk1菌株进行辣椒耐受的适应性进化，获得适应后菌株，记为lsk1pe；

本发明采用适应性进化，能够在较短时间内改变菌株的生理特性，且适应性进化基本不会影响除欲改变特性之外的特性，所以利用适应性进化有助于获得耐受辣椒且发酵能力基本不受影响的菌株。

在获得lsk1菌株后，通过辣椒耐受的适应性进化即能获得耐受辣椒的酵母菌株，有助于后续将其应用在辣椒环境中进行发酵和产出。尤其是对于包含辣椒的餐厨垃圾，该类餐厨垃圾包含辣椒的活性成分辣椒素，而现有技术常见的餐厨垃圾发酵菌种，往往受该类辣椒素影响而被抑制生长甚至不能生长，所以对应的餐厨垃圾发酵效率也被降低，也无法充分利用废弃资源，更无法实现快速发酵。而本发明通过耐受辣椒的适应性进化可以获得基于乙醇高产菌株的耐受辣椒菌株，从而有助于提供实际应用在餐厨垃圾的微生物发酵中以解决现有技术无法充分利用资源以及发酵效率低的问题的可能性或给予制备出能有效应用在餐厨垃圾发酵且耐受辣椒的菌种的菌种基础。

本发明还公开了包括上述筛选过程的一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌的验证方法，包括以下步骤：

s1、筛选出甘蔗糖蜜中的乙醇高产酵母菌株，记为lsk1；

s2、使lsk1菌株进行辣椒耐受的适应性进化，获得适应后菌株，记为lsk1pe；

s3、构建辣椒素存在的环境，基于同源菌株lsk1验证lsk1pe菌株的耐受辣椒能力。

其中，步骤s1、s2即为上述耐受辣椒的乙醇高产酵母菌的筛选方法，而本验证方法则是在筛选获得lsk1pe菌株后还进行进一步的耐受辣椒验证。通过构建辣椒素存在的环境，即辣椒环境，并通过比较辣椒环境下原未进行适应性进化的菌株lsk1以及经适应性进化后的菌株lsk1pe各自的生长状况、发酵能力来验证lsk1pe的耐受辣椒能力。所述构建辣椒素存在的环境，即通过加入含有辣椒素的辣椒或辣椒粉构建。通过耐受辣椒能力验证的菌株即具备耐受辣椒的特性，且在辣椒环境下仍可以进行发酵，所以验证方法有助于得到能够应用在含辣椒素的餐厨垃圾的微生物发酵的酵母菌。从而解决现有技术中辣椒素对餐厨垃圾发酵的限制，有助于提高废弃资源利用率并提高工业化发酵餐厨垃圾的效率。步骤s3中在已经获得乙醇高产菌株lsk1后利用lsk1作为对照验证lsk1pe的耐受辣椒以及辣椒环境下发酵能力，有助于基于同源菌株验证辣椒耐受能力是否提高以及辣椒耐受性的提高程度。

优选的，上述筛选方法或验证方法中步骤s2具体包括：

s21、将步骤s1中获取到的lsk1菌株按一定百分比浓度接种量接种至含葡萄糖的培养基中，并加入初始百分比浓度辣椒粉至培养基中，培养直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株；将lsk1菌株接种至含葡萄糖培养基中后，通过加入辣椒粉至培养基构建辣椒环境，从而在辣椒的选择压力下进行菌株的培养，有助于获得适应辣椒环境的酵母菌种。且为了保证该特性能够稳定维持，所以还需培养直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定耐受菌株，所述稳定耐受菌株通过在同一百分比浓度辣椒条件下进行连续传代培养获得。

s22、将上一步骤获得的稳定菌株按与上一步骤同样百分比浓度接种量转移至另一含同样浓度葡萄糖的培养基中，即含与上一步骤同样浓度的葡萄糖的培养基，并加入较上一步骤更高百分比浓度的辣椒粉，在与上一步骤同样的条件下培养，直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株；因辣椒素浓度的不同会对发酵菌种呈现不同程度的影响，且餐厨垃圾中辣椒含量并不确定，有可能存在较多辣椒，所以在步骤s21后执行s22步骤能够基于s21已经获得的适应低浓度辣椒菌株增大辣椒选择压力，从而获得适应更高浓度辣椒素的菌株，有助于增大耐受辣椒素浓度，提高菌株在实际应用中耐受能力。

s23、在预设辣椒粉浓度梯度范围内重复步骤s22直至获得适应高辣椒浓度的菌株，记为lsk1pe。步骤s21获得的稳定菌种经过一次s22步骤处理后即获得了耐受辣椒能力相对提高的菌株，但为了成功获得进化后的存活菌株，往往单次提高的辣椒浓度较小，即经过一次s22步骤提高辣椒浓度处理后的菌株其耐受辣椒能力提升并不明显，所以需要重复步骤s22多次即进行持续浓度增高的适应性进化，以获得在不断提高辣椒浓度过程中持续适应性进化的菌株。本发明通过预设辣椒浓度范围，以步骤s21中的初始百分比浓度为最低的适应性进化浓度，并依据预设辣椒浓度范围设定辣椒粉百分比浓度梯度，从而重复步骤s22将上一步骤获得的适应新辣椒粉浓度的菌株放置更高辣椒粉百分比浓度下培养，从而持续提高辣椒粉百分比浓度至预设范围最高浓度，以获得适应高浓度辣椒粉的耐受辣椒酵母菌株，有助于扩大菌株的适应范围，提高菌株存活能力，也便于后续将其投入餐厨垃圾发酵的实际应用中。此处，s1步骤后重复步骤s22的过程，即第一次进行步骤s22获得较s21适应更高辣椒粉浓度的菌株后，就不断在s22获得的适应新的更高辣椒粉浓度基础上持续重复步骤s22，直至辣椒粉百分比浓度至预设范围最高浓度，以获得适应预设范围内最高辣椒粉浓度的酵母菌株。

优选的，步骤s21和s22中培养直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株具体步骤包括：

(1)将菌株按一定百分比浓度接种量接种至含葡萄糖的培养基中，并加入当前百分比浓度辣椒粉至培养基后，进行一个适应性进化周期的培养；

(2)将上一步骤中经过一个适应性进化周期培养后的菌株按与上一步骤相同百分比浓度接种量转移至另一含同样浓度葡萄糖的培养基中，并加入与上一步骤相同百分比浓度辣椒粉至培养基中，再进行一个适应性进化周期的培养；

(3)重复步骤(2)多次直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株。

即本发明在每个辣椒粉百分比浓度下培养均采用多次转接以获得耐受当前辣椒百分比浓度的稳定菌株，所述稳定菌株即能在当前辣椒百分比浓度下维持较稳定的生长状况和耐受性，所述生长状况包括菌体量和生长速率。通过多次转接培养获得稳定菌株，有助于获得和维持其稳定的表型，有助于为后续接种至更高辣椒粉百分比浓度的环境下培养提供基础。

优选的，步骤s2中预设浓度梯度范围为1％～25％，初始百分比浓度为1％，重复步骤(2)至少2次，适应性进化周期至少为48h。优选的，浓度梯度依据预设范围1％～25％设定，能够涵盖常见的餐厨垃圾含辣椒浓度，通过该范围能够获取到适用常见餐厨垃圾的发酵酵母菌。优选的，辣椒粉百分比浓度梯度设置包括1％、2％、3％、4％、5％、8％、10％、13％、15％、20％、25％；步骤s2中的初始百分比浓度即为预设浓度梯度范围中的最低浓度。步骤s2中重复步骤(2)至少2次有助于获取进化后稳定菌株，优选的，重复步骤(2)2次，即能缩短整个适应性进化的时间，并且重复2次基本能获得稳定菌株。

优选的，步骤s3中通过构建辣椒素存在的环境，并比较辣椒环境下lsk1与lsk1pe的生长状况、利用葡萄糖发酵的能力、利用淀粉发酵的能力来验证lsk1pe的耐受辣椒能力。在获取经适应性进化后的菌株后，通过比较lsk1和lsk1pe在辣椒环境下的生长状况有助于突出lsk1pe的辣椒耐受性以及相比同源菌株lsk1在辣椒环境下的生存能力，验证lsk1pe相比于lsk1是否获得在辣椒环境包括高辣椒浓度环境下的适应生长能力，从而有助于应用至餐厨垃圾中，避免辣椒素抑制菌种生长的现象发生。而比较辣椒环境下lsk1与lsk1pe利用葡萄糖发酵能力则能验证lsk1pe在获得耐受辣椒特性后仍可以发酵葡萄糖，且通过与同源菌株lsk1的比较还能验证辣椒环境下lsk1pe相比于lsk1发酵葡萄糖能力是否提高。有助于验证获得辣椒环境下相比未适应性进化菌株具有更高发酵能力的菌株lsk1pe，所述发酵能力包括发酵速度，有助于应用于工业生产中缩短发酵时间提升菌体发酵效率。而比较辣椒环境下lsk1和lsk1pe利用淀粉发酵能力则能获取lsk1、lsk1pe在辣椒环境下对于除能被直接利用的葡萄糖外的糖类物质的适应能力，有助于验证lsk1pe在辣椒环境下利用淀粉发酵相比于lsk1是否具有更快的适应期，具有更高的效率。

优选的，步骤s3中将获取的lsk1和lsk1pe菌株在同样的条件下进行培养，并取样稀释获得多组不同稀释倍数下的菌液，同时制备含有不同百分比浓度辣椒粉培养基，从各组稀释倍数菌液取样加入至各个不同百分比浓度辣椒粉培养基中，经一定时间培养后获取各个培养基中的lsk1、lsklpe菌株生长状况，验证辣椒环境下lsklpe相对于lsk1菌株生长能力是否提高。将获取的lsk1和lsk1pe菌株培养后，分别取少量培养液，并从同一初始od稀释多个倍数，获得稀释菌液后再将各个稀释倍数取样添加至各个不同百分比浓度辣椒粉培养基中并培养观察。

通过比较lsk1或lsk1pe单一稀释倍数菌液在不同百分比浓度辣椒粉培养基中的生长，有助于直接观察到在当前稀释倍数菌液下不同辣椒百分比浓度对菌体生长的影响。通过比较lsk1或lsk1pe同一百分比浓度辣椒粉培养基下不同稀释倍数菌液的生长状况，有助于直接观察到lsk1pe相比lsk1的耐受能力是否提高。

优选的，步骤s3中通过分别将lsk1、lsk1pe菌株加入至含一定百分比浓度辣椒粉以及葡萄糖的培养基中测定其在辣椒环境下的利用葡萄糖发酵能力，验证辣椒环境下lsk1pe相对于lsk1菌株葡萄糖发酵能力是否提高。培养好lsk1和lsk1pe酵母后，分别取同一初始od量转接入含辣椒粉、葡萄糖培养基并进行多个时间点的葡萄、乙醇含量的测定，依据各个时间点的葡萄糖、乙醇含量绘制lsk1和lsk1pe生长曲线，从而比较验证lsk1pe在辣椒环境下葡萄糖发酵能力以及发酵能力是否强于lsk1。

优选的，步骤s3中通过分别将lsk1、lsk1pe加入至含同浓度的糖苷酶、一定百分比浓度辣椒粉以及淀粉的培养基中测定其在辣椒环境下的利用淀粉发酵能力，验证辣椒环境下lsk1pe相对于lsk1菌株利用淀粉发酵的能力是否提高。利用淀粉发酵则是测定辣椒环境中在淀粉存在且同样被水解的条件下，lsk1、lsk1pe对应发酵过程中葡萄糖、乙醇含量的变化，通过比较lsk1、lsk1pe两者的含量变化曲线验证lsk1pe在辣椒环境下能否更快适应淀粉水解并基于此发酵，有助于验证lsk1pe在其他糖类物质基础上的发酵能力并获得经确认的能以其他糖类物质为基础发酵的lsk1pe。

本发明还提供一种上述方法中获得的耐受辣椒的乙醇高产酵母菌，包括筛选方法获得或经验证方法确认获得的耐受辣椒的乙醇高产酵母菌，所述酵母菌为基于甘蔗糖蜜中筛选出的并经辣椒耐受适应性进化获得的乙醇高产菌株，用于含辣椒素的餐厨垃圾的微生物发酵。除此之外，也可用于不含辣椒素的餐厨垃圾的微生物发酵。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过筛选方法能够获得经辣椒适应性进化的乙醇高产酵母菌，且适应性进化基本不会影响除欲改变特性之外的特性，所以通过筛选方法获得的酵母菌有助于应用在含辣椒的餐厨垃圾的微生物发酵。而验证方法则能进一步对筛选获得的耐受辣椒且乙醇高产酵母进行耐受辣椒验证，有助于获得验证确认后的酵母，便于后续投入实际应用。验证辣椒环境下的生长状况则能分别验证lsk1pe能否在辣椒环境下生存以及生存能力是否提高；验证辣椒环境下的利用葡萄糖发酵能力则能验证lsk1pe仍保留其发酵能力以及辣椒环境下相比lsk1的利用葡萄糖能力是否提升；验证辣椒环境下的利用淀粉发酵能力则能验证lsk1pe以其他糖类物质为基础的发酵能力以及辣椒环境下相比lsk1的利用淀粉的适应期是否缩短，是否具有更高的效率；通过上述验证有助于获得验证确认后的耐受辣椒且具有应用在实际工业生产中发酵含辣椒素餐厨垃圾的潜力菌株。

附图说明

图1为含不同浓度辣椒的酵母适应性进化的液体培养基实验图。

图2为酵母lsk1在不同浓度辣椒平板的生长情况实验图。

图3为酵母lsk1pe在不同浓度辣椒平板的生长情况实验图。

图4为辣椒环境下酵母lsk1和酵母lskipe利用葡萄糖发酵过程中的葡萄糖、乙醇含量变化图。

图5为辣椒环境下酵母lsk1和酵母lsk1pe利用淀粉发酵过程中的淀粉、乙醇含量变化图。

具体实施方式

本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

实施例1

一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌的筛选方法，包括以下步骤：

s1、筛选出甘蔗糖蜜中的乙醇高产酵母菌株，记为lsk1；

具体的，本实施例中取甘蔗糖蜜5g加入到含2％葡萄糖的ypd液体培养基中，震荡过夜培养24h后，取出1ml培养液，用无菌水稀释10^-610^-8倍，分别涂在含有含有2％葡萄糖的ypd固体培养基平板上，培养12h，待长出单菌落，挑入液体培养基中培养12h，取少量菌液在显微镜下观察菌落形态确定酵母菌株，之后对各个酵母菌株发酵利用葡萄糖的能力进行测定，选出其中生产乙醇能力较强的菌株，将其命名为lsk1菌株。

s2、使lsk1菌株进行辣椒耐受的适应性进化，获得适应后菌株，记为lsk1pe；

步骤s2具体包括：

s21、将步骤s1中获取到的lsk1菌株按一定百分比浓度接种量接种至含葡萄糖的培养基中，并加入初始百分比浓度辣椒粉至培养基中，培养直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株；s22、将上一步骤获得的稳定菌株按与上一步骤同样百分比浓度接种量转移至另一含同样浓度葡萄糖的培养基中，并加入较上一步骤更高百分比浓度的辣椒粉，在与上一步骤同样的条件下培养，直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株；s23、在预设辣椒粉浓度梯度范围内重复步骤s22直至获得适应高辣椒浓度的菌株，记为lsk1pe。

具体的，在上述步骤s21和s22中培养直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株具体步骤包括：(1)将菌株按一定百分比浓度接种量接种至含葡萄糖的培养基中，并加入当前百分比浓度辣椒粉至培养基后，进行一个适应性进化周期的培养；(2)将上一步骤中经过一个适应性进化周期培养后的菌株按与上一步骤相同百分比浓度接种量转移至另一含同样浓度葡萄糖的培养基中，并加入与上一步骤相同百分比浓度辣椒粉至培养基中，再进行一个适应性进化周期的培养；(3)重复步骤(2)多次直至获得当前百分比浓度辣椒粉条件下的稳定菌株。

具体的，本实施例中步骤s2具体包括为：

将得到酵母lsk1菌株，按1％的接种量，接种到50ml含2％葡萄糖的ypd培养基中，培养基中额外加入1％的辣椒粉末，震荡培养48h后，按1％的接种量取样重新转入到新的50ml含2％葡萄糖，1％辣椒粉末的ypd培养基中，培养48h后，再以同样的接种量转移到新的50ml含2％葡萄糖，1％辣椒粉末的ypd培养基中，培养48h，所述的48h即本实施例中一个适应性进化周期。

以上即为获得1％辣椒粉浓度下稳定菌株的过程。然后在浓度范围预设浓度梯度范围为1％～25％中分别设定辣椒粉浓度1％，2％，3％，4％，5％，8％，10％，13％，15％，20％，25％不同浓度梯度，每个相同的辣椒粉浓度下按相同1％的接种量重复转接三次，即完成上述获得当前稳定菌株的过程；通过不断的提高辣椒粉浓度并再次过程中转接适应低浓度辣椒菌株至较高辣椒浓度下，最后得到适应高辣椒浓度的菌株，本实施例中即获得适应25％高辣椒浓度的菌株，将其命名为lsk1pe，其培养过程以及培养基内生长状况如图1所示。

实施例2

一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌的验证方法，包括以下步骤：

sl、筛选出甘蔗糖蜜中的乙醇高产酵母菌株，记为lsk1；

s2、使lsk1菌株进行辣椒耐受的适应性进化，获得适应后菌株，记为lsk1pe；

s3、构建辣椒素存在的环境，基于同源菌株lsk1验证lsk1pe菌株的耐受辣椒能力。

其中本实施例中s1、s2与实施例1中相同，在此不再赘述。其中步骤s3构建辣椒素存在的环境，基于同源菌株lsk1验证lsk1pe菌株的耐受辣椒能力，包括比较辣椒环境下lsk1与lsk1pe生长状况、利用葡萄糖发酵的能力、利用淀粉发酵的能力来验证lsk1pe的耐受辣椒能力。

其中，比较辣椒环境下lsk1与lsk1pe生长状况进行验证过程包括：将获取的lsk1和lsk1pe菌株在同样的条件下进行培养，并取样分别稀释获得多组不同稀释倍数下的菌液，同时制备含有不同百分比浓度辣椒粉培养基，从各组稀释倍数菌液取样加入至各个不同百分比浓度辣椒粉培养基中，经一定时间培养后获取各个培养基中的lsk1、lsk1pe菌株生长状况，验证辣椒环境下lsk1pe相对于lsk1菌株生长能力是否提高。

具体的，本实施例中将得到的lsk1pe和lsk1分别接种于含有5ml的ypd培养基中，培养24h，之后取少量的培养液，按初始od＝3起始分别稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5倍后各自吸取1ul分别点在含5％，10％，15％，20％，25％辣椒粉的ypd培养基中，在30℃条件下，培养15h后，观察菌株的生长状况，结果如图2，图3所示。

由图2可知，随着固体培养基中辣椒浓度的逐渐升高，lsk1的生长逐渐受到抑制，在5％和10％的辣椒浓度条件下，大约在10^-4稀释倍数下，菌体的生长完全受到抑制，当辣椒浓度超过20％，lsk1的生长完全被抑制。相比较图3可知，经过适应性进化过的lsk1pe较lsk1的生长状况得到了明显的改善，在5％的辣椒浓度下，菌体在稀释10^-6倍后仍能看到微小的菌落，随着辣椒浓度的逐渐提升，菌体受抑制程度逐渐提升，这个变化趋势与lsk1相同，但抑制程度明显好于lsk1，。可以看到当辣椒浓度达到25％时高浓度时10^-1和10^-2稀释倍数的条件下，仍有lsk1pe菌体可以生长，所以经过适应性进化过的lsk1pe相较于lsk1已经获得了在高浓度辣椒存在下的适应生长的能力，相比于lsk1菌株对辣椒更耐受，辣椒环境下生存能力提高，且能在较高浓度辣椒粉环境下生存。

其中，比较lsk1、lsk1pe菌株在辣椒环境下利用葡萄糖发酵能力的验证过程包括：分别将lsk1、lsk1pe菌株加入至含一定百分比浓度辣椒粉以及葡萄糖的培养基中测定其在辣椒环境下的利用葡萄糖发酵能力，验证辣椒环境下lsk1pe相对于lsk1菌株葡萄糖发酵能力是否提高。

具体的，本实施例中分别配制50ml的ypd培养基，加入葡萄糖起始浓度为50g/l，按总含量的15％加入辣椒粉，将培养好的酵母lsk1pe和lsk1以初始od＝0.5的量转接入培养基中，分别在3h，6h，9h，12h，24h时间间隔处取出少量样品，对其中的葡萄糖含量和蛋白质含量用hplc检测，同时对乙醇含量也进行检测，结果如图4所示。

由图4可知，在含有50g/l葡萄糖存在下的ypd培养基中，菌株lsk1和lsk1pe都可以对培养基中的葡萄糖进行发酵生产乙醇，但是由于辣椒的存在，lsk1pe的发酵能力明显强于lsk1的发酵能力，在6h时，lsk1pe生成的乙醇含量为2.377g/l，大约是lsk1生成酒精含量0.683g/l的3.45倍；在12h时lsk1pe已将葡萄糖基本消耗完，而lsk1则需要24h才能将葡萄糖消耗完成，所有在辣椒存在的条件下，lsk1pe的发酵能力明显强于lsk1，在工业生产时，缩短时间可以提升菌体的发酵效率。

其中，步骤s3中比较lsk1、lsk1pe菌株在辣椒环境下利用淀粉发酵能力的验证过程包括：分别将lsk1、lsk1pe加入至含糖苷酶、一定百分比浓度辣椒粉以及淀粉的培养基中测定其在辣椒环境下的利用淀粉发酵能力，验证辣椒环境下lsk1pe相对于lsk1菌株利用淀粉发酵的能力是否提高。

具体的，本实施例中分别配制50ml的ypd培养基，加入起始淀粉浓度为20g/l，按总含量的15％加入辣椒粉，并额外添加0.5mg/g的糖苷酶将培养好的酵母lsk1pe和lsk1以初始od＝0.5的量转接入培养基中，分别在12h，24h，36h，48h，60h时间间隔处取出少量样品，对其中的葡萄糖含量和蛋白质含量用hplc检测，结果如图5所示。

由图5可知，在lsk1pe菌株的发酵瓶中0-24h随着糖苷酶对淀粉的水解，葡萄糖浓度逐渐升高，24h时葡萄糖浓度达到最高18.12g/l，lsk1pe在0-24h时，发酵速度较慢，乙醇的含量缓慢的增加，在24-36h时，发酵速率显著的提升，葡萄糖含量显著的下降，在36h时，葡萄糖基本被消耗完，在36h以后的发酵乙醇在一定范围内波动；葡萄糖浓度的变化在lsk1菌株表现出相似的变化，但lsk1菌株发酵需要的适应期较长，在36h后才开始缓慢的发酵，直到60h，葡萄糖浓度才基本被利用完成，整体的速率较慢。综上，在利用淀粉发酵方面，lsk1pe和lsk1菌株相比，在含有辣椒的培养基中可以明显的缩短发酵的适应期，并且从发酵的速率方面lsk1pe相比lsk1也没有受到影响，可以保持较快的发酵速率。

实施例3

一种耐受辣椒的乙醇高产酵母菌，通过实施例1筛选方法筛选或实施例2验证方法验证获得的菌株，是基于甘蔗糖蜜中筛选出的并经辣椒耐受适应性进化获得的乙醇高产菌株，至少能够用于含辣椒素的餐厨垃圾的微生物发酵，或作为构建更优良菌种的基础菌株。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。