一株汉逊德巴利酵母菌株及其在制备水果保鲜剂中的应用的制作方法

本发明属于农产品保鲜领域，具体涉及一株汉逊德巴利酵母菌株debaryomyceshansenii‘ndb-001’及其在制备水果保鲜剂中的应用。

背景技术：

水果在采摘、加工、贮藏以及运输过程中容易造成机械损伤，病原菌极易通过伤口侵染果实造成腐烂。我国每年约有8×10³万吨水果因采后病害而无法销售，损失高达800亿元。水果采后病害严重制约了我国水果产业的发展。目前，防治水果采后病害应用最广泛的仍然是化学药剂，但存在成本高、污染环境、危害人体健康和破坏生态平衡等不足。随着科学的发展和人们安全意识的提高，运用新型绿色、环保的生物防治技术控制果蔬采后病害已成为当下研究的热点。在多种生防菌中，酵母菌因具有遗传稳定、安全性高、营养需求低、增值速度快等优点，成为防治果蔬采后病害的主要生防菌，具有广阔应用前景。

大量研究表明，酵母菌作为拮抗菌的主要作用方式包括其对病原菌的寄生作用、分泌抗真菌化合物、诱导寄主产生抗性和营养与空间竞争。研究发现，某些酵母可以产生抑菌物质，在不接触植物组织的情况下直接抑制病原菌的生长从而达到防治水果采后病害的效果。拮抗酵母产生的抑菌物质包括挥发性和非挥发性两种。挥发性抑菌物质主要是一些醇类以及酯类物质。已有研究表明，柠檬克勒克酵母(kloeckeraapiculate)中分离到的2-苯基乙醇能够防治柑橘青霉病；安诺拉毕赤酵母(pichiaanomala)产生的挥发性抗菌物质(如乙醇和乙酸乙酯)能够抑制灰霉病菌；掷孢酵母(sporidioboluspararoseus)在培养基中产生的挥发性有机化合物能够显著抑制灰霉病菌分生孢子萌发以及菌丝体的生长。分泌抑菌物质的拮抗酵母克服了其在商业化应用过程中难以保持细胞活力和防治效果这一难题，同时产生挥发性抗菌物质的拮抗酵母为通过生物熏蒸防治水果采后病害提供了可能性，这为防治水果采后病害打开了新思路。

参考文献如下：

[1]胡浩.西藏罗伦隐球酵母对水果采后病害的防治效果及相关机制研究[d].杭州：浙江大学,2016.

[2]liup,chengy,yangm,liuy,chenk.mechanismsofactionfor2-penicillium,moldsofcitrusfruits[j].bmcmicrobiology,2014,14(1):242.

[3]huangr,chehj,zhangj,yangl,jiangdh,ligq.evaluationofsporidioboluspararoseusstrainycxt3asbiocontrolagentofbotrytiscinereaonpost-harveststrawberryfruits[j].biologicalcontrol,2012,62(1):53-63.

[4]kwasiborskia,bajjim,renautj,delaplacep,jijaklimh.identificationofmetabolicpathwaysexpressedbypichiaanomalakh6inthepresenceofthepathogenbotrytiscinereaonapple:newpossibletargetsforbiocontrolimprovement[j].plosone,2014,9(3):e91434.

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的具有水果保鲜作用的生防酵母菌及其应用，并给出了该生防菌的培养和使用方法。该菌株分类命名为汉逊德巴利酵母‘ndb-001’debaryomyceshansenii‘ndb-001’，于2020年5月7日送交中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctccno：m2020106。通过室内平板抑菌实验测定，结果表明：在很低的用量下，该生防酵母菌对引起水果腐烂病的葡萄孢菌具有很好的抑制作用。离体水果保鲜实验表明，该保鲜物质在很低的用量下可有效延缓苹果、水蜜桃、番茄等多种水果的衰老与病害，具有非常好的水果保鲜效果。该酵母菌能够用于制备低成本、无污染和无农药残留的天然保鲜剂。

本发明的目的可以通过以下技术措施得以实现：

一株具有水果保鲜功能的酵母菌菌株，该菌株分类命名为汉逊德巴利酵母‘ndb-001’debaryomyceshansenii‘ndb-001’，于2020年5月7日送交中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctccno：m2020106。

上述的酵母菌菌株在制备水果保鲜剂中的应用。

上述的应用，其在于采用上述酵母菌菌株的悬浮液制成水果保鲜剂。优选的，将上述的酵母菌菌株振荡培养48h后低温离心收集菌体。用无菌水悬浮菌体沉淀并调节至合适浓度后制成保鲜剂。

一种水果保鲜剂，该水果保鲜剂为振荡培养上述酵母菌菌株，离心收集菌体沉淀，用无菌水悬浮后制成的。

一种水果保鲜方法，将上述酵母菌菌株的悬浮液置于水果箱进行水果保鲜。优选的，所述酵母菌悬浮液为用无菌水悬浮酵母菌菌体沉淀后制成的。

本发明所述的水果为苹果、水蜜桃、樱桃、草莓、葡萄、柑橘、桑葚或荔枝。

本发明技术方案的详细过程为：

(1)水果保鲜物质的制备

为了得到有高活性物质的保鲜物质，本发明将酵母菌振荡培养48h后，低温离心收集菌体。用无菌水悬浮菌体沉淀制成酵母菌悬浮液，调节至合适浓度即制成保鲜物质。

(2)水果保鲜物质对几种病原菌的室内平板抑制作用测定

为了测试保鲜物质对病原菌生长抑制作用的有效性，本发明量取一定量的保鲜物质，置于二分格培养皿的其中一半，另一半倒入培养基培养病原菌。以无菌水作为对照。通过菌丝生长速率法测定保鲜物质对病原菌的抑制效果。

(3)离体水果保鲜测试

为了测试保鲜物质对水果保鲜的有效性，本发明量取一定量的保鲜物质，置于接种有水果腐烂病菌水果的塑料盒中，以不放置本发明保鲜物质作为对照。保鲜膜封口后定期观察，并记录水果的发病情况。

(4)水果保鲜剂的开发

将该保鲜物质开发成天然商品保鲜剂。

本发明的有益效果：

本发明中的保鲜物质由能产生挥发性抑菌物质的汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’制备而来，材料易得，成本低廉；只需将该酵母菌进行振荡培养后离心，用无菌水悬浮菌体沉淀即得，工艺简单，操作方便，大大降低了生产成本。

室内平板抑制实验结果表明，100μl该保鲜物质(1x10⁸cfu/ml)即可完全抑制葡萄孢菌的生长，抑制率达100％。离体水果保鲜实验中，将30ml该保鲜物质置于装有苹果的塑料盒中即可显著抑制引起灰霉病的葡萄孢菌生长，大大降低了采后苹果的病害率，贮藏到第14天时好果率高达78.2％，保鲜效果显著；当将保鲜物质的量增加至60ml时，其好果率可达90.7％。使用该保鲜物质后大大降低了采后苹果的病害率，提高了好果率，起到了显著的保鲜效果。

实验结果表明，该保鲜物质对接种灰霉菌后的水蜜桃同样具有很好的防腐保鲜作用。将30ml该保鲜物质置于装有水蜜桃的塑料盒中即可显著抑制引起灰霉病的葡萄孢菌生长，大大降低了采后水蜜桃的病害率，贮藏到第7天时好果率高达62.6％，保鲜效果显著；用60ml该保鲜物质处理水蜜桃可显著抑制葡萄孢菌的生长，大大降低了采后水蜜桃的病害率，贮藏到第7天时好果率高达82.6％。

与其它保鲜方法相比，此方法具有诸多优点：a.该保鲜物质来源于微生物，无毒无害环保，满足人们对绿色饮食的需求，且材料易得，成本低廉；b.该保鲜物质在常温下就可达到显著的保鲜效果，无需低温，这进一步降低了保鲜成本，扩大了适用范围；c.本发明有效降低了苹果、水蜜桃等水果的发病率，延长了贮藏时间，为水果保鲜提供了一种新的方法。本发明对于延缓水果品质劣变，减少采后损失，促进该行业的可持续发展具有重要的意义。

附图说明

图1为汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’对葡萄孢菌的抑制效果。

图2为汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’对接种葡萄孢菌后苹果的保鲜效果(图片为处理第14天的结果)。

图3为汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’对接种葡萄孢菌后水蜜桃的保鲜效果(图片为处理第7天的结果)。

具体实施方式

鉴于天然保鲜剂及其保鲜技术因克服了物理保鲜技术成本高、难操作的缺点，避免了化学保鲜技术危害大、副作用大的劣势，凭借其安全环保、经济价值突出等优点成为水果保鲜的一个重要方向。因此，申请人利用筛选获得的汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’，制备了基于该酵母菌的保鲜物质，并对引起水果腐烂的主要病原菌进行了室内平板抑制实验和离体水果保鲜实验。结果表明，该保鲜物质具有显著的抑菌活性，能够用于制备天然保鲜剂。根据申请人所进行的资料检索，目前还未见文献报道。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例1汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’

申请人自广东的芒果中分离筛选到一株酵母菌株，该菌株在不同培养平板上的菌落形态都较类似，单细胞为卵圆形或圆形，细胞为多边芽殖。在平板上形成的菌落呈卵圆形，乳白色，表面光滑，质地均匀且粘稠，中心隆起较高，呈突脐状，菌落边缘较整齐。在培养基上可形成子囊孢子，细胞与其出芽接合形成子囊，一个子囊产生1-4个球形子囊抱子。以上形态特征和文献中所描述的德巴利氏酵母菌的特征相似，该菌株的its1核苷酸序列如seqidno.1所示；因此该菌株分类命名为汉逊德巴利酵母‘ndb-001’debaryomyceshansenii‘ndb-001’。将该酵母菌菌株于2020年5月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，保藏编号：cctccno：m2020106。研究过程中发现该酵母菌在水果保鲜中效果显著。

该菌株its1序列(seqidno.1)：

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实施例2：水果保鲜物质的制备

为了得到保鲜物质，本发明振荡培养该酵母菌48h后(ypd液体培养基，培养温度20～30℃)，低温(4℃)离心收集菌体。用无菌水悬浮菌体沉淀，制成酵母菌悬浮液，调节浓度至1x10⁸cfu/ml即制成保鲜物质。

实施例3：水果保鲜物质对病原菌的室内平板抑制测定

为了测试保鲜物质对病原菌生长抑制的有效性，本发明量取该保鲜物质，置于二分格培养皿的其中一半。另一半倒入培养基培养病原菌，置于25℃恒温培养箱，黑暗培养，观察并用十字交叉法测量菌落直径。通过下述公式计算出保鲜物质对病原菌的抑制率：

具体方案如下：

(1)供试菌株的准备：将培养7天左右的葡萄孢菌(botrytiscinerea)接种于含有pda培养基的二分格培养皿其中一格的中央；另一格中倒入用于培养酵母菌的ypd培养基。

(2)分别量取100μl不同浓度的酵母菌悬浮液(1x10⁴cfu/ml、1x10⁶cfu/ml、1x10⁸cfu/ml)，放于已接菌二分格培养皿的另一格，用涂布棒涂匀。

(3)将培养皿封口后置于25℃恒温培养箱，黑暗培养。以加无菌水作为对照。每个处理3个重复。

(4)待对照菌落扩展至距离培养皿边缘0.5-1.0cm时，测量菌落直径，计算保鲜物质对所测病原菌的生长抑制率。结果见图1和表1：

表1汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’保鲜物质对水果产后主要病原菌的抑制率

实施例4：离体水果保鲜测试

a.汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’保鲜物质对苹果的保鲜测试：

(1)挑取新鲜完好的苹果，置于塑料盒(规格：30.5cm×23.5cm×11.5cm)，每个塑料盒分装6个。

(2)用无菌针头在每个水果上造一个小伤口，将培养了5-7d的水果灰霉病菌菌饼接种于小伤口。

(3)量取一定量(30ml、60ml)浓度为1x10⁸cfu/ml的酵母菌悬浮液于一次性塑料杯(规格：3.3cm×5.2cm×5.0cm)，将其置于盛有苹果的盒子，用保鲜膜密封水果盒后放置于室温。每个处理3个重复。

(4)定期观察，测定水果发病直径，拍照并记录结果。结果见图2和表2：

表2汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’保鲜物质对产后苹果的保鲜效果

b.汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’保鲜物质对水蜜桃的保鲜测试：

(1)挑取新鲜完好的水蜜桃，置于塑料盒(规格：30.5×23.5×11.5cm)，每个塑料盒分装6个。

(2)用无菌针头在每个水果上造一个小伤口，将培养了5-7d的水果灰霉病菌菌饼接种于小伤口。

(3)量取一定量(30ml、60ml)浓度为1x10⁸cfu/ml的酵母菌悬浮液于一次性塑料杯(规格：3.3cm×5.2cm×5.0cm)，将其置于盛有水蜜桃的盒子，用保鲜膜密封水果盒后放置于室温。每个处理3个重复。

(4)定期观察，测定水果发病直径，拍照并记录结果。结果见图3和表3：

表3汉逊德巴利酵母debaryomyceshansenii‘ndb-001’保鲜物质对产后水蜜桃的保鲜效果

离体水果保鲜实验中，用60ml该保鲜物质处理苹果可显著抑制引起灰霉病的葡萄孢菌生长，大大降低了采后苹果的病害率，贮藏到第14天时好果率高达90.7％，保鲜效果显著；用60ml该保鲜物质处理水蜜桃可显著抑制葡萄孢菌的生长，大大降低了采后水蜜桃的病害率，贮藏到第7天时好果率高达82.6％，保鲜效果显著。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一株汉逊德巴利酵母菌株及其在制备水果保鲜剂中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>607

<212>dna

<213>汉逊德巴利酵母‘ndb-001’(debaryomyceshansenii‘ndb-001’)

<400>1

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