一种利用瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法及其应用
技术领域：
：[0001]本发明属于基因编辑领域，具体涉及一种利用瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法及其应用。
背景技术：
：：[0002]马克斯克鲁维酵母(分类命名为：马克斯克鲁维酵母kluyveromycesmarxianus)是一种耐高温、能利用多种底物的、目前已知生长最快的真核生物，其具有从生物质中生产高附加值产品的巨大潜力。然而，由于基因工程性能的局限性，例如马克斯克鲁维酵母的高效的非同源末端重组(nhej)能力，几乎完全阻止了同源重组(hr)能力，从而使针对马克斯克鲁维酵母的基因编辑效率十分低下，这大大限制了马克斯克鲁维酵母在工业生物
技术领域：
：中替代啤酒酵母。[0003]近来已有一些使用crispr/cas9基因组编辑系统来快速构建马克斯克鲁维酵母突变体的报道。但是，先前针对克鲁维酵母的crispr/cas9系统需要将cas9和sgrna基因整合到基因组中，或者每次针对不同的目标区域需要重新构建cas9-sgrna表达质粒，这些条件会限制crispr/cas9系统在耐热酵母中的应用。此外，这些报道仅关注crispr/cas9系统在构建基因敲除菌株中的高效率，而忽略了其在马克斯克鲁维酵母代谢工程中的潜在应用。此前因为缺乏有效和稳定的马克斯克鲁维酵母多拷贝附加型质粒复制系统，以往异源途径是通过整合质粒恢复宿主的生长缺陷而整合到马克斯克鲁维酵母染色体中的。然而，整合型质粒的方法增加了cas9在宿主菌株中的表达时间，从而增加了脱靶的可能性。此外，使用整合质粒进行的基因操作通常会在宿主基因组内部留下不必要的遗传痕迹，例如耐药基因、多个克隆位点和用于靶基因克隆的大肠杆菌复制子等。因此，利用一种快速且高效的方法对马克斯克鲁维酵母进行精确地基因组编辑是十分必要的。技术实现要素：[0004]本发明旨在提供一种利用瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法及其应用。本发明方法不需要构建cas9蛋白、sgrna的表达载体，在体外利用pcr的方法分别扩增出cas9蛋白、sgrna以及同源重组原件的表达框，混合后转化耐热酵母ku70基因缺陷型菌株即可对其基因组指定位点进行高效编辑。[0005]本发明以xyl2基因编码区为目标区域，提供了基于瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母进行基因敲除所需的同源臂长度，ku70基因的影响、转化效率、反应体系。[0006]本发明进一步示范了在基因组整合异源表达框的同时定位需要敲除的基因区域，从而达到快速改造和重构耐热酵母的代谢途径以合成高附加值化合物的目的。具体来说将重组脉孢霉木糖还原酶(ncxr)基因表达框用pcr扩增出来，与遗传筛选标记ura3基因一起转化yzb101菌株，并定位在xyl2基因区域，达到高效表达ncxr的同时敲除xyl2基因的目的，该菌株可以甘油为共培养底物提供还原力将木糖还原为木糖醇，其发酵能力与用传统方法构建的菌株一致，展示了本发明的技术方法在耐热酵母的基因功能研究和快速代谢工程改造中的应用潜力。[0007]本发明利用瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法，首先在体外通过pcr扩增分别获得cas9蛋白表达框、sgrna表达框以及同源重组原件，混合后转化耐热酵母ku70基因缺陷型菌株，即可对其基因组指定位点进行高效编辑。[0008]所述同源重组原件的组成为：上游同源区-筛选标记-下游同源区，针对耐热酵母基因组的目标编辑区域，上下游最短仅需要60bp的同源区，中间的筛选标记为营养筛选标记ura3基因。[0009]在对耐热酵母进行基因组编辑前需要首先敲除耐热酵母的ku70基因以阻断耐热酵母原本非常高效的非同源重组能力，从而提高其同源重组能力；其次敲除其ura3基因作为同源重组原件成功替换目标区域的遗传筛选标记。[0010]成功对耐热酵母基因组进行编辑后，不需要人工再次去除cas9的表达，因为转入的cas9基因表达框是线性的，其不会复制和遗传，细胞分裂后自动丢失，而且cas9蛋白表达时间短，因此该方法简化了基因编辑的流程，同时降低了基因编辑过程中的脱靶率。[0011]将上述方法用于耐热酵母xyl2基因的敲除，包括以下步骤：[0012]步骤1：从质粒p414-tef1p-cas9-cyc1t(市购获得，购自addgene公司)扩增cas9表达框tef1p-cas9-cyc1t片段；其中tef1p是控制cas9表达的启动子，cyc1t是控制cas9表达的终止子。[0013]步骤2：从质粒p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t(市购获得，购自addgene公司)中扩增snr52p启动子片段和grna.can1.y-sup4t-cyc1t片段，并将这两个片段分别连接到puc19质粒，得到质粒pzb089和pzb090；[0014]步骤3：利用融合pcr技术构建snr52p-grna.can1.y-sup4t-cyc1t重组片段，其中的grna序列是特异性针对xyl2基因的；[0015]步骤4：将tef1p-cas9-cyc1t片段、snr52p-grna.can1.y-sup4t-cyc1t片段、xyl2同源敲除片段混合(1μg:1μg:3μg)，乙醇沉淀纯化，化学转化yzb101菌株(构建过程已公开，zhanget.al.2020a)；[0016]步骤5：将转化后的菌液涂布于不含尿嘧啶的合成培养基平板，对长出的转化子复筛，并提取基因组做pcr鉴定和测序鉴定，对于单基因的敲除，其效率值在95％以上。[0017]本发明基于瞬时crispr/cas9系统可以实现耐热酵母木糖代谢途径的快速重构。具体来说，将两个需要重组表达的目的基因表达框定位于耐热酵母xyl2基因的位置，达到重组表达目的基因的同时敲除另一个基因的目的，具体包括如下步骤：[0018](1)利用上述方法分别获得tef1p-cas9-cyc1t片段和snr52p-grna.can1.y-sup4t-cyc1t片段；[0019](2)从质粒pzj011(构建过程已公开，zhanget.al.2014)扩增出ncxr的重组表达框，从质粒yeugap(构建过程已公开，zhanget.al.2014)扩增出ura3的表达框；将两个重组表达片段各自用pcr的方法扩增，两个重组表达片段间需要加上至少60bp重叠序列，两个末端加上至少60bp定位目标区域的同源臂。[0020](3)将tef1p-cas9-cyc1t片段、snr52p-grna.can1.y-sup4t-cyc1t片段、ncxr的重组表达框和ura3的表达框混合(1μg:1μg:3μg:3μg)，乙醇沉淀纯化，化学转化yzb101菌株(构建过程已公开，zhanget.al.2020a)；[0021](4)将转化后的菌液涂布于不含尿嘧啶的合成培养基平板，对长出的转化子复筛，并提取基因组做pcr鉴定和测序鉴定，得到的菌株命名为yzb205。对于两个基因的转入，其效率值在50以上。利用重构的菌株yzb205和用传统方法构建的菌株进行发酵比较。[0022]将通过上述方法构建的yzb205重组菌株过表达了脉孢霉来源的木糖还原酶，并定位于xyl2基因位置，从而达到重组表达基因并敲除目的基因的目的。从图4d可知，yzb205在42℃好氧条件下，分批发酵共利用40g/l甘油和100g/l木糖合成99.91g/l木糖醇，木糖醇合成速率为0.93g/l/h，合成效率为0.97g/g甘油，木糖转化率为最大理论值99％。[0023]本发明基于瞬时crispr/cas9系统的方法由于不需要构建载体，因而操作简便、实验周期短。由于将cas9基因线性表达框直接转入细胞，其不会复制和遗传，细胞分裂后自动丢失，因此不需要人工再次去除cas9的表达，进一步简化操作流程，由于cas9蛋白表达时间短，又降低了基因编辑过程中的脱靶率。附图说明[0024]图1是本发明所构建的质粒示意图。[0025]图2a是本发明利用瞬时crispr/cas9系统所需的定位于xyl2基因的sgrna构建过程pcr示意图；图2b是利用瞬时crispr/cas9系统构建xyl2基因的敲除菌原理示意图；图2c是利用瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母木糖代谢途径进行快速重构原理示意图。[0026]图3a是利用瞬时crispr/cas9系统敲除xyl2基因的pcr电泳结果，其中左边第一列为未编辑的对照菌株基因组pcr结果，结果显示基因敲除的成功率为100％；图3b是利用瞬时crispr/cas9系统将外源基因的表达框定位xyl2基因的pcr电泳结果，结果显示基因编辑的成功率为90％。[0027]图4a是利用传统方法对耐热酵母木糖代谢途径进行重构的过程示意图；图4b是利用瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母木糖代谢途径进行重构的过程示意图；图4c是野生型耐热酵母nbrc1777发酵结果；图4d是利用瞬时crispr/cas9系统构建的重组耐热酵母yzb205发酵结果。[0028]图5是本发明制备流程示意图。具体实施方式[0029]试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上纯度。其中，葡萄糖、酵母基本氮源、尿嘧啶、木糖、木糖醇、胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。t4dna连接酶购于大连宝生物公司。fastpfu和fasttaqdna聚合酶购于滁州吐露港生物公司。大肠杆菌escherichiacolixl10-gold菌株作为dna操作时使用的宿主菌(美国加利福尼亚stratagene公司)，包含100μg/ml氨苄青霉素的luria-bertani(lb)培养基用作培养e.coli。葡萄糖合成培养基(ynb葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶20mg/ml)主要用于转化。ypd培养基(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)用于酵母的前培养。ypgx(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨，40g/l甘油和100g/l木糖)用于木糖醇的合成发酵。[0030]实施例1：质粒的制备[0031]pzb089和pzb090的构建：[0032]以质粒p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t为模板，以snr52p-smai-f(序列1)、snr52p-smai-r(序列2)为引物，pcr扩增得到包含snr52p的片段；然后将基因片段和puc19载体用smai平末端酶切，然后连接从而得到pzb089载体。以质粒p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t为模板，以cyc1t-smai-f(序列3)、cyc1t-smai-r(序列4)为引物，pcr扩增得到包含can1.y-sup4t-cyc1t的片段，然后将基因片段和puc19载体用smai平末端酶切，然后连接从而得到pzb090载体(图1)。[0033]具体操作如下：[0034](1)以质粒p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到snr52p基因片段；然后将snr52p基因片段插入puc19载体，从而得到pzb089载体。[0035]snr52p基因片段的pcr体系：[0036][0037]pcr程序：[0038][0039]对snr52p基因片段和puc19质粒用smai平末端酶进行酶切和连接。[0040]snr52p基因片段的酶切体系：[0041][0042]puc19质粒的酶切体系：[0043][0044]snr52p基因片段和puc19质粒的连接体系：[0045][0046]将获得的质粒puc19-snr52p命名为pzb089。[0047](2)以质粒p426-snr52p-grna.can1.y-sup4t为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到can1.y-sup4t-cyc1t基因片段；然后将can1.y-sup4t-cyc1t基因片段插入puc19载体，从而得到pzb090载体。[0048]can1.y-sup4t-cyc1t基因片段的pcr体系：[0049][0050]pcr程序：[0051][0052]对can1.y-sup4t-cyc1t基因片段和puc19质粒用smai平末端酶进行酶切和连接。[0053]can1.y-sup4t-cyc1t基因片段的酶切体系：[0054][0055][0056]puc19质粒的酶切体系：[0057][0058]can1.y-sup4t-cyc1t基因片段和puc19质粒的连接体系：[0059][0060]将获得的质粒puc19-snr52p命名为pzb090。[0061]实施例2：利用瞬时crispr/cas9系统构建耐热酵母xyl2基因敲除菌[0062]以质粒p414-tef1p-cas9-cyc1t为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到cas9蛋白的编码基因片段，使用的引物为m13-f和m13-r(序列5和序列6)；以质粒pzb089为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到snr52p-sgrna(xyl2)基因片段，使用的引物为snr52-smai-f和xdh-snr52-r(序列1和序列7)，以质粒pzb090为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t基因片段，使用的引物为xdh-cyc1t-f和cyc1t-smai-r(序列8和序列4)；使用引物snr52-smai-f和cyc1t-smai-r融合片段snr52p-sgrna(xyl2)和sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t得到snr52p-sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t片段；以质粒yeugap为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到xyl2(up)-ura3-xyl2(down)基因片段，使用的引物为xdh60-f和xdh60-r(序列9和序列10)。[0063]具体操作如下：[0064]1)cas9基因片段的pcr体系：[0065][0066]pcr程序：[0067][0068]2)snr52p-sgrna(xyl2)基因片段的pcr体系：[0069][0070]pcr程序：[0071][0072]3)sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t基因片段的pcr体系：[0073][0074]pcr程序：[0075][0076]4)sgrna启动子和终止子部分分别扩增[0077]使用引物snr52-smai-f和cyc1t-smai-r融合片段snr52p-sgrna(xyl2)和sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t得到snr52p-sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t片段，pcr体系为：[0078][0079]sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t片段[0080]ddh2oꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ补足至50μl[0081]pcr程序：[0082][0083][0084]5)sgrna片段融合[0085]xyl2(up)-ura3-xyl2(down)基因片段的pcr体系：[0086][0087]pcr程序：[0088][0089]6)将外源dna导入耐热酵母，酵母化学转化步骤如下：[0090]①待转菌株在ypd平板上划线，37℃培养24h。[0091]②挑取单菌落接种5ml液体ypd,37℃，250rpm，培养18h。[0092]③取1ml培养物转接于装入9ml液体ypd的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。[0093]④取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。[0094]⑤配制1ml转化缓冲液：800μl50％peg4000；50μl4m醋酸锂；50μlddh2o；100μl1mdtt(溶于10mm醋酸钠,ph5.2)。[0095]⑥使用200μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。[0096]⑦用100μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入经乙醇沉淀的5μl待转基因片段的混合物(1μg:1μg:3μg),轻微震荡30sec。[0097]⑧在47℃条件下水浴15min。[0098]⑨将菌体涂布于不含尿嘧啶的合成培养基，37℃培养1-2天。[0099]⑩挑取板上单菌落在液体ypd中培养，提取基因组，并通过pcr和测序鉴定转化结果。[0100]7)对转化子进行基因组抽提和pcr检测：[0101][0102]pcr程序：[0103][0104]用引物xdh-f和xdh-750-r对转化子的基因组进行pcr检测，对照菌株的pcr结果大小应该为750bp，xyl2基因被敲除的菌株pcr大小应该为1850bp。由图3a可知，基因编辑的成功率达100％(左边第一列为对照菌株基因组pcr结果)。[0105]实施例3：利用瞬时crispr/cas9系统对耐热酵母木糖代谢途径进行快速重构[0106]以质粒p414-tef1p-cas9-cyc1t为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到cas9蛋白的编码基因片段，使用的引物为m13-f和m13-r(序列5和序列6)；以质粒pzb089为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到snr52p-sgrna(xyl2)基因片段，使用的引物为snr52-smai-f和xdh-snr52-r(序列1和序列7)，以质粒pzb090为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t基因片段，使用的引物为xdh-cyc1t-f和cyc1t-smai-r(序列8和序列4)；使用引物snr52-smai-f和cyc1t-smai-r融合片段snr52p-sgrna(xyl2)和sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t得到snr52p-sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t片段；以质粒pzj011为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到uhs-kmtdh3p-ncxyl1-sctdh3p-ncxyl1-t-l基因片段，使用的引物为xdh-m13f-f/m13-r(序列11和序列6)，以质粒yeugap为模板，使用fastpfudna聚合酶进行pcr扩增得到l-ura3-dhs基因片段，使用的引物为19m13r-m13f-f/xdh-m13r-r(序列12和序列13)。其中cas9基因的扩增，snr52p-sgrna(xyl2)-can1.y-sup4t-cyc1t片段的融合与实施例2相同。[0107]1)uhs-kmtdh3p-ncxyl1-sctdh3p-ncxyl1-t-l基因片段的pcr体系：[0108][0109]pcr程序：[0110][0111]2)l-ura3-dhs基因片段的pcr体系：[0112][0113]pcr程序：[0114][0115]3)将外源dna导入耐热酵母，酵母化学转化步骤如下：[0116]①待转菌株在ypd平板上划线，37℃培养24h。[0117]②挑取单菌落接种5ml液体ypd,37℃，250rpm，培养18h。[0118]③取1ml培养物转接于装入9ml液体ypd的50ml三角瓶内，37℃，250rpm，摇床培养5h。[0119]④取出培养物，常温下离心5000rpm，3min，弃上清液，保留菌体。[0120]⑤配制1ml转化缓冲液：800μl50％peg4000；50μl4m醋酸锂；50μlddh2o；100μl1mdtt(溶于10mm醋酸钠,ph5.2)。[0121]⑥使用200μl转化缓冲液重悬菌体，5000rpm，离心3min，去上清。[0122]⑦用100μl转化缓冲液重悬浮菌体，加入经乙醇沉淀的5μl待转基因片段的混合物(1μg:1μg:3μg:3μg),轻微震荡30sec。[0123]⑧在47℃条件下水浴15min。[0124]⑨将菌体涂布于不含尿嘧啶的合成培养基，37℃培养1-2天。[0125]⑩挑取板上单菌落在液体ypd中培养，提取基因组，并通过pcr和测序鉴定转化结果。[0126]4)转化子基因组的pcr检测体系：[0127][0128]pcr程序：[0129][0130]用引物xdh-f和xdh-r对转化子的基因组进行pcr检测，对照菌株的pcr结果大小应该为1200bp，外源基因成功定位xyl2基因的菌株pcr大小应该为5kb左右。由图3b可知，基因编辑的成功率达90％。[0131]实施例4：构建的工程菌株发酵情况[0132]本实施例用于测试工程菌株共利用甘油和木糖发酵生产木糖醇的效果。结果表明利用瞬时crispr/cas9系统重构耐热酵母的木糖代谢途径得到的工程菌株可以在高温下(42℃)以甘油为共培养的底物，好氧发酵高效生产木糖醇，发酵效率与用传统方法构建的菌株相当(zhanget.al.,2014)。[0133]1、在ypd培养基平板上复苏菌株yzb205，37℃培养1天。[0134]2、挑取单克隆，接于5ml液体ypd培养基，37℃、250rpm，过夜。[0135]3、配制50mlypgx(40g/l甘油和100g/l木糖)培养基于250ml锥形瓶中，灭菌待用。[0136]4、将1ml种子培养基接入50ml发酵培养基中，置于42℃摇床发酵，设置转速220rpm。[0137]5、定时取样，并取上清通过hplc检测分析(图4d)。[0138]6、从图4可知，yzb205在42℃好氧条件下，分批发酵共利用40g/l甘油和100g/l木糖合成99.91g/l木糖醇，木糖醇合成速率为0.93g/l/h，合成效率为0.97g/g甘油，木糖转化率为最大理论值99％，而作为对照的野生型菌株优先利用木糖，不利用甘油，产生约40g/l木糖醇(图4c)。[0139]参考文献[0140]cernakp,estrelar,poddars,skerkerjm,chengyf,carlsonak,chenb,glynnvm,furlanm,ryanow,donnellymk,arkinap,taylorjw,catejhd(2018)engineeringkluyveromycesmarxianusasarobustsyntheticbiologyplatformhost.mbio9(5)doi:10.1128/mbio.01410-18[0141]hongj,wangy,kumagaih,tamakih(2007)constructionofthermotolerantyeastexpressingthermostablecellulasegenes.jbiotechnol130(2):114-123doi:10.1016/j.jbiotec.2007.03.008[0142]leemh,linjj,linyj,changjj,kehm,fanwl,wangty,liwh(2018)genome-widepredictionofcrispr/cas9targetsinkluyveromycesmarxianusanditsapplicationtoobtainastablehaploidstrain.scirep8(1):7305doi:10.1038/s41598-018-25366-z[0143]liuk,yuanx,lianglm,fangjp,chenyq,hewj,xuet(2019)usingcrispr/cas9formultiplexgenomeengineeringtooptimizetheethanolmetabolicpathwayinsaccharomycescerevisiae.biochemengj145:120-126doi:10.1016/j.bej.2019.02.017[0144]lobsak,engelr,schwartzc,floresa,wheeldoni(2017)crispr-cas9-enabledgeneticdisruptionsforunderstandingethanolandethylacetatebiosynthesisinkluyveromycesmarxianus.biotechnolbiofuels10:164doi:10.1186/s13068-017-0854-5[0145]lobsak,schwartzc,thorwalls,wheeldoni(2018)highlymultiplexedcrisprirepressionofrespiratoryfunctionsenhancesmitochondriallocalizedethylacetatebiosynthesisinkluyveromycesmarxianus.acssynthbiol7(11):2647-2655doi:10.1021/acssynbio.8b00331[0146]mink,ichikaway,woolfordca,mitchellap(2016)candidaalbicansgenedeletionwithatransientcrispr-cas9system.msphere1(3)doi:10.1128/msphere.00130-16[0147]nambu-nishiday,nishidak,hasunumat,kondoa(2017)developmentofacomprehensivesetoftoolsforgenomeengineeringinacold-andthermo-tolerantkluyveromycesmarxianusyeaststrain.scirep7(1):8993doi:10.1038/s41598-017-08356-5[0148]tsaics,kong,ii,lesmanaa,milliong,zhanggc,kimsr,jinys(2015)rapidandmarker-freerefactoringofxylose-fermentingyeaststrainswithcas9/crispr.biotechnolbioeng112(11):2406-11doi:10.1002/bit.25632[0149]williamsdl,schuckelj,vivierma,buffettof,zietsmanajj(2019)grapepomacefermentationandcellwalldegradationbykluyveromycesmarxianusy885.biochemengj150:107282doi:10.1016/j.bej.2019.107282[0150]zhangb,renl,wangh,xud,zengx,lif(2020a)glyceroluptakeandsynthesissystemscontributetotheosmotictoleranceofkluyveromycesmarxianus.enzymemicrobtechnol140:109641doi:doi.org/10.1016/j.enzmictec.2020.109641[0151]zhangb,renl,wangy,xud,zhangs,wanghn,wangh,zengx,xinb,lif(2020b)glycerolproductionthroughtpi1defectivekluyveromycesmarxianusathightemperaturewithglucose,fructose,andxyloseasfeedstock.biochemengj161:107689doi:org/10.1016/j.bej.2020.107689[0152]zhangb,zhangj,wangdm,hanrx,dingr,gaoxl,sunlh,hongj(2016)simultaneousfermentationofglucoseandxyloseatelevatedtemperaturesco-producesethanolandxylitolthroughoverexpressionofaxylose-specifictransporterinengineeredkluyveromycesmarxianus.bioresourtechnol216:227-237doi:10.1016/j.biortech.2016.05.068[0153]zhangb,zhuyl,zhangj,wangdm,sunlh,hongj(2017)engineeredkluyveromycesmarxianusforpyruvateproductionatelevatedtemperaturewithsimultaneousconsumptionofxyloseandglucose.bioresourtechnol224:553-562doi:10.1016/j.biortech.2016.11.110[0154]zhangj,zhangb,wangdm,gaoxl,hongj(2014)xylitolproductionathightemperaturebyengineeredkluyveromycesmarxianus.bioresourtechnol152:192-201doi:10.1016/j.biortech.2013.10.109[0155]zhangj,zhangb,wangdm,gaoxl,sunlh,hongj(2015)rapidethanolproductionatelevatedtemperaturesbyengineeredthermotolerantkluyveromycesmarxianusviathenadp(h)-preferringxylosereductase-xylitoldehydrogenasepathway.metabeng31:140-152doi:10.1016/j.ymben.2015.07.008[0156]序列1-16为引物[0157]序列1snr52p-smai-f[0158]5′-tcccccgggtctttgaaaagataatgtatg-3′[0159]序列2snr52p-smai-r[0160]5′-tcccccgggatcatttatctttcactgc-3′[0161]序列3cyc1t-smai-f[0162]5′-tcccccgggttttagagctagaaatagc-3′[0163]序列4cyc1t-smai-r[0164]5′-tcccccgggcaaattaaagccttcgagc-3′[0165]序列5m13-f[0166]5′-cgccagggttttcccagtcacgac-3′[0167]序列6m13-r[0168]5′-agcggataacaatttcacacagga-3′[0169]序列7m13-rxdh-snr52-r[0170]5′-gtcttcttgatgtgaaccttgatcatttatctttcactgc-3′[0171]序列8xdh-cyc1t-f[0172]5′-aaggttcacatcaagaagacgttttagagctagaaatagc-3′[0173]序列9xdh60-f[0174]5′-atgaccaacactcaaaaagccgttgttttgaagaagcaaggagagattgctttcgaagagtatttagaaaaataaacaaatag-3′[0175]序列10xdh60-r[0176]5′-ccattggttctttgacaacaaagtcaccaatagcaccatgagtatagtagtgaacatcagaatgcgtacttatatgcgtc-3′[0177]序列11xdh-m13f-f[0178]5′-atgaccaacactcaaaaagccgttgttttgaagaagcaaggagagattgctttcgaagagagggttttcccagtcacgac-3′[0179]序列1219m13r-m13f-f[0180]5′-gcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctagggttttcccagtcacgac-3′[0181]序列13xdh-m13r-r[0182]5′-tcattctggaccatcaatgatagtcttgacaacttcattaccgtgatctctgttgaaattagcggataacaatttcacac-3′[0183]序列14xdh-f[0184]5′-atgaccaacactcaaaaagc-3′[0185]序列15xdh-750-r[0186]5′-cctcagctcctgagcaatca-3′[0187]序列16xdh--r[0188]5′-tcattctggaccatcaatgatag-3′当前第1页1 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