一种纤维素酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种纤维素酶及其突变体，更为具体地，本发明涉及一种来源于产胡萝卜素微杆菌(microbacteriumkitamiense)的纤维素酶、其耐热突变体及其应用。

背景技术：

将丰富的、可再生的纤维素资源转化为燃料和其它工业产品，对于社会的可持续发展意义巨大。纤维素可以转化成葡萄糖或者其他可发酵糖，进而转化成生物燃料或其他产品。纤维素可以在酶的催化作用下被分解，其中参与催化的水解酶可以被称作纤维素酶(cellulase)。纤维素酶是纤维素转化过程中的关键因素之一，而纤维素的彻底转化需要多种纤维素酶的参与，常常是复合物体系，又被称为纤维素酶系。纤维素酶属于糖苷水解酶(glycosidehydrolase，简称为gh)，可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，即纤维素分子中连接葡萄糖单位的化学键。纤维素酶的作用底物主要是纤维素、纤维素衍生物、纤维素糊精、纤维寡糖等，但一些纤维素酶也可以水解其他一些化合物，例如水解一些半纤维素成分；另外，有其他酶类(以糖苷水解酶为主)，例如一些木聚糖酶(xylanase)也可以部分水解纤维素。其中，嗜热纤维素酶在高温环境下有着独特的稳定性和高活力，因而具有无以比拟的优势。

纤维素酶存在广泛，主要来源有细菌、真菌和原生动物。微生物产生的纤维素酶对纤维素的降解，促进了植物等生物体的分解转化，是自然界中碳循环的主要组成部分。大多数动物自身不能产生纤维素酶，不能消化纤维素，但一些动物的消化道内存在的共生微生物可以产生纤维素酶，例如反刍动物(牛、羊、骆驼等等)，有一个瘤胃结构，瘤胃中的微生物可以分泌纤维素酶，帮助反刍动物消化纤维素类的食物。植物可以产生纤维素酶，对自身的纤维素进行适当的加工，在发育的不同阶段和不同部位产生纤维素酶，起到调节作用。

但目前市售的纤维素酶种类较少，且普遍存在催化效率不高、温度耐受范围窄、高温下酶活损失快等缺点，因此开发在高温下依然具备高效酶活的纤维素酶是工业生产的急切需求。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供如下的技术方案：

在一方面，本发明提供一种来自microbacteriumkitamiense的纤维素酶mkcel2，其氨基酸序列如seqidno.1所示；

在另一方面，本发明提供mkcel2的突变体，与野生型mkcel2相比，mkcel2的突变体存在第72和128位置的突变，更为具体地，所述突变为mkcel2/y72a和/或mkcel2/y128g，更进一步地，所述突变体具有改善的热稳定性。

在另一方面，本发明提供含有编码上述纤维素酶的核苷酸序列的重组表达载体。

在另一方面，本发明提供上述重组表达载体的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞优选为大肠杆菌。

在另一方面，本发明还提供一种制备纤维素酶的方法，所述方法包括以下步骤：(1)、用含有野生型或突变体的纤维素酶的编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；(2)、培养重组菌株，诱导所述纤维素酶表达；(3)、回收并纯化所表达的纤维素酶。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为mkcel2在cmc培养基上形成的透明水解圈；

图2为mkcel2热稳定性检测结果图；

图3为mkcel2最适ph值检测结果图；

图4为mkcel2/y128g突变型酶热稳定性检测结果图；

图5为mkcel2/y72a突变型酶热稳定性检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1纤维素酶mkcel2的克隆

具有纤维素强分解能力的菌株microbacteriumkitamiense由发明人所在研究室于废水厂采样获得。microbacteriumkitamiense是一种微杆菌属的革兰氏阳性菌，生长温度在25-42℃之间，生长ph6.0。

根据genbank已报道的microbacteriumkitamiense全基因组核苷酸序列(genbank登录号：pggu000000000)，用primerx引物设计程序分别设计特异性引物如下(方向5’→3’)：

16-f：gggaattccatatgaggaaagccatgatcaggat；

16-r：ccccaagcttgagcgctccggcccggtggcccta。

以microbacteriumkitamiense基因组作为模板，利用设计好的引物进行pcr扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳回收产物进行鉴定，将克隆的基因命名为mkcel2,基因大小为1443bp。将mkcel2基因pcr回收产物与pet-28a(+)质粒同时使用特定的限制性内切酶ndeι和hindiii进行双酶切，酶切产物用t4连接酶连接后转化进入e.colidh5α感受态细胞，挑取平皿上的单菌落培养至浑浊，利用质粒提取试剂盒重新提取重组质粒，并用ndeι和hindш对其进行双酶切进行验证。确认质粒中插入片段正确后，将获得的重组质粒转化大肠杆菌e.colirosetta(de3)中。将转化好的菌液涂布于双抗(kan/cam)平板上，挑取成功生长的单菌落于试管中(5ml含5μlkan和5μlcam双抗lb液体培养基)过夜培养，将培养物与甘油混合均匀后置于-80℃保存。扩大培养按照100：1的无菌双抗培养基与菌液比例进行接种，37℃恒温摇床至od590值为0.5-0.6左右，加入终浓度为0.1mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导剂进行诱导，培养20h。将培养液经低温高速离心机离心后，收集菌体沉淀，采用超声破碎获得细胞内容物，离心后分开留存液体和沉淀，进行sds-page电泳，检测蛋白可溶性。通过生物信息学分析可知，mkcel2基因编码的蛋白质由473个氨基酸组成，其序列如seqidno.1所示，该蛋白为包涵体。

实施例2酶学性质鉴定

1.包涵体复性与纯化：根据现有技术中常用的复性方法对mkcel2包涵体进行纯化复性；

2.刚果红染色法观察酶活：

刚果红染料可渗透到纤维素分子的网状结构中使其呈现红色，若纤维素被酶分解则会出现淡黄色透明圈。取5μl蛋白溶液滴于鉴定培养基上，25℃放置1h，接下来以纯水冲洗平板，倒入刚果红溶液浸没平板表面10-20min，倒掉染液，用纯水冲洗后，倒入1mnacl溶液洗去浮色，观察透明圈。由图1可见，mkcel2可在cmc培养基上形成透明水解圈。

3.纤维素酶的活性测定：

按照标准酶活力的测定方法测定mkcel2酶的标准酶活力，mkcel2的标准酶活力为516.6u/mg，对纤维素有较强的亲和力和催化能力。

4.热稳定性测试：

将最适温度测定的数据用origin软件处理后如图2所示，mkcel2的最佳反应温度为30℃，在20-50℃保持较高活性。

5.最适ph值测试：

经纯化的mkcel2酶在不同的ph下进行酶促反应以测定其最适ph。所用缓冲液为ph2.0-7.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲体系。在不同ph的缓冲体系、30℃下测定的最适ph，如图3所示，mkcel2酶的最适ph为6.0。

实施例3筛选热稳定性提高的突变体

使用在线分析网站clustalw(http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行多序列比对。选取现有技术已知的耐热纤维素酶cel5和cel74,与rol进行多序列比对，以鉴定可增强rol热稳定性的潜在位点。每个序列都以fasta格式上传，结果上传到espript3.0(http://espript.ibcp.fr/espript/cgi-bin/espript.cgi)并绘制以进行更直观的对齐。为了得到特定氨基酸突变的酶蛋白，我们利用定点突变技术，尝试将第72位点的酪氨酸突变成丙氨酸(y72a)，以及将第128位点的酪氨酸突变成甘氨酸(y128g)。接着加入限制酶dpni于37℃下作用，将未突变的野生型模板去除。把限制酶dpni处理后的质粒转入至大肠杆菌感受态细胞中，并通过测序确认突变成功的突变基因，将突变成功的mkcel2基因转化到大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(competentcells)内，并且进行与如上所述的野生型mkcel2纤维素酶蛋白的相同的表达与纯化步骤而分别得到mkcel2/y72a纤维素酶突变体蛋白和mkcel2/y128g纤维素酶突变体蛋白。

实施例4突变体的酶活检测及热稳定性检测

纤维素酶的活性测定方法：按照实施例2中的方法测定mkcel2酶突变体的标准酶活力，mkcel2/y72a纤维素酶突变体的标准酶活力为508.4u/mg，mkcel2/y72a纤维素酶突变体的标准酶活力为522.7u/mg，与mkcel2野生型酶活力相当。

1.酶蛋白的最适温度(热稳定性)测试：按照实施例2中的方法对突变型纤维素酶进行检测。结果分别如图4-5所示，分析结果可知，mkcel2/y72a和mkcel2/y128g突变型酶热稳定性均得到显著提升，mkcel2/y72a在85℃时仍具有高纤维素酶活性。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>黑龙江中医药大学

<120>一种纤维素酶及其应用

<130>cp2020214

<141>2020-12-14

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>473

<212>prt

<213>microbacteriumkitamiense

<400>1

metaspglnservalserasnvalasplysserseralaphepheglu

151015

tyrasnlysmetileglyhisglyileasnmetglyasnalaleuglu

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