黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置

文档序号:24557177发布日期:2021-04-06 12:07阅读:来源:国知局

技术特征:

1.黄曲霉菌的rpa引物,其特征在于,包括:

正向引物,所述正向引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列:

5’-gcctgtccgagcgtcattgctgcccatc-3’;

反向引物,所述反向引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列:

5’-cctacagagcgggtgacaaagccccatacg-3’。

2.试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的黄曲霉菌的rpa引物。

3.黄曲霉菌的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:现场提取样品的dna,以所述dna为模板,利用权利要求1中所述的rpa引物进行rpa快速扩增,获得dna扩增产物,根据所述dna扩增产物的荧光现象判断样品中是否存在黄曲霉菌污染。

4.如权利要求3所述的黄曲霉菌的检测方法,其特征在于,所述dna的提取方法为:

步骤a、洗下样品中污染的黄曲霉菌孢子和菌丝;

步骤b、合并所述步骤a中所得的洗涤液,抽滤,得到滤饼;

步骤c、用naoh溶液重溶所述步骤b中获得的滤饼,将重溶液研磨,取研磨后的溶液稀释于te缓冲液中,完成dna的提取。

5.如权利要求4所述的黄曲霉菌的检测方法,其特征在于,所述步骤a中洗下样品中污染的黄曲霉菌孢子和菌丝的方法为:无菌称取颗粒状的样品置于一次性注射器内,吸取无菌水后,剧烈震荡,将水排出,再次吸取干净的无菌水,震荡,将水排出,重复2-3次。

6.如权利要求3所述的黄曲霉菌的检测方法,其特征在于,所述rpa快速扩增的方法为:

取2μldna模板、0.3μm正向引物、0.3μm反向引物、29.5μl反应缓冲液、1μlcelfindertm荧光染料和超纯水加入如权利要求2所述的试剂盒提供的rpa酶冻干粉反应管中,取2.5μl醋酸镁加入到反应管的盖子内表面,旋紧盖子混匀后,将反应管置于36±1℃的条件下反应10min,即获得dna扩增产物。

7.如权利要求3所述的黄曲霉菌的检测方法,其特征在于,将所述dna扩增产物置于蓝光灯下观察其绿色荧光现象,若有荧光,则样品中存在黄曲霉菌污染,且荧光越强污染程度越重;若无荧光,则样品未被黄曲霉菌污染。

8.如权利要求3所述的黄曲霉菌的检测方法,其特征在于,所述样品的采样方法为:

对于无包装散堆食品,按三层五点法进行代表性取样,根据样品面积大小划分为若干方块,每块为一区,每区按上、中、下分三层,每层设中心、四角共五个点,按区按点,先上后下用取样器各取少量样品,再按四分法处理取得的样品;

对于有完整包装的食品,按公式

确定取样件数,进而进行采样,式中:n为取样件数,n为总件数。

9.用于如权利要求3~8任一项所述黄曲霉菌的检测方法的装置,其特征在于,包括:

便携式抽滤器,其包括:上筒体、下筒体和微孔滤膜,所述上筒体的一端旋接有上端盖,另一端的内壁连接设置有直径逐渐减小的收口,所述下筒体的一端旋接有下端盖,另一端内径向设置有网格,所述下筒体靠近所述网格的一端侧壁上开设有抽滤口,所述上筒体的直径大于所述下筒体的直径,所述下筒体的直径大于所述收口的小口端的直径,所述上筒体扣接在所述下筒体上方,所述网格上放置微孔滤膜,所述收口的小口端压在所述微孔滤膜的上表面;

简易研钵,其包括由水砂纸制成的盒体和钵杵,所述钵杵由水砂纸折叠而成;

其中,所述上筒体用于盛放所述洗涤液,所述抽滤口与一次性注射器的注射口相匹配,所述注射口插接在所述抽滤口外周,利用一次性注射器进行抽气;

所述水砂纸制成的盒体用于盛放重溶液,利用水砂纸折叠而成的钵杵进行研磨。

10.如权利要求9所述的装置,其特征在于,所述微孔滤膜的直径为25mm,孔径为0.8μm。


技术总结
本发明公开了一种黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置,所述RPA引物和试剂盒特异性强,灵敏度高,检测结果准确。本发明还提供了一种能够现场化快速检测食品中黄曲霉菌的方法和装置,黄曲霉菌的检测方法包括以下步骤:现场快速提取样品的DNA,以所述DNA为模板,利用RPA引物进行RPA快速扩增,获得DNA扩增产物,根据所述DNA扩增产物的荧光现象判断样品中是否存在黄曲霉菌污染。所述黄曲霉菌的检测装置,包括自制便携式抽滤器和简易研钵。本发明所述DNA提取方法快速高效,结合体温下就能进行的RPA快速扩增,实现了37℃等温条件下,30min准确、快速、高效地检测到黄曲霉菌,同时对实验场所要求简单,不需要复杂仪器,十分适合基层样品抽检。

技术研发人员:邢福国;刘启君;靳婧;李旭
受保护的技术使用者:中国农业科学院农产品加工研究所
技术研发日:2021.01.13
技术公布日:2021.04.06
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