黄曲霉菌的RPA引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置

本发明涉及食品安全检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种黄曲霉菌的rpa引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置。

背景技术：

黄曲霉菌(aspergillusflavus)是真菌的一种，以寄生或腐生方式生存。其特点是菌丝体较为发达，无较大的子实体。黄曲霉菌可产生孢子进行繁殖和传播，其在温暖潮湿的环境下繁殖迅速。黄曲霉菌可在作物的种植、收获、储藏、运输和加工等各个环节进行侵染，使食品发生霉变失去食用价值，造成了巨大的浪费和经济损失。同时在其生长过程中可产生有毒的次级代谢产物——黄曲霉毒素。黄曲霉菌和其产生的黄曲霉毒素对食品安全和人类健康带来了巨大威胁，也越来越引起人们的关注和重视。因此建立快速检测方法，掌握食品中黄曲霉菌的污染情况以便及时采取控制措施，对控制黄曲霉菌污染的扩散具有积极意义。

目前，针对食品中黄曲霉菌的快速检测技术较少。传统的检测方法主要依赖于形态学特征观察和鉴别培养基的鉴定，按照真菌的形态、生理特点、培养条件、产生毒素的种类等特征加以区分对比，但这种方法操作繁琐、检测周期长且灵敏度差，其检测结果受操作人员的主观影响较大，存在一定的误检率。随着生物化学、遗传信息学及分子生物学等的飞速发展，人们对产毒真菌的产毒机制认识日益深入，越来越多的分子生物学、免疫学的鉴定方法被应用于霉菌的检测方面，但这些方法仍存在着检测时间较长，依赖昂贵的实验仪器等限制，不能满足快速检测的需求。因此，需要一种灵敏、快速、现场的检测方法。

重组酶聚合酶等温扩增技术(rpa)是一种快速、灵敏的核酸等温扩增技术。在rpa反应中，重组酶/引物复合物通过扫描模板dna以寻找同源序列，在链置换dna聚合酶(bsu)的作用下发生链置换反应，启动dna合成，被置换下来的dna链与单链结合蛋白(gp32)结合，防止进一步替换，通过此过程的循环实现目的片段的指数式扩增。rpa可以在相对较低的温度下，在30分钟内扩增目的dna，非常适合快速现场检测。近年来rpa已应用于转基因作物、病毒、细菌等检测，但在食品中黄曲霉菌的检测方面还未见报道。

dna的提取作为分子生物学检测的基础，直接影响着检测的可行性和灵敏度。因霉菌具有较厚的细胞壁，其dna不易提取，目前常用的dna提取方法主要是试剂盒法和ctab法，但这些方法均存在操作繁琐、耗时，且对黄曲霉菌孢子dna提取效果较差等问题。导致了目前已有的分子生物学检测方法普遍存在着灵敏度不高的问题。且目前的研究多集中在dna的扩增阶段，对dna的快速高效提取的方法研究较少。

因此，设计一种黄曲霉菌的rpa引物和试剂盒，并建立一种以rpa技术为基础的能够现场快速检测黄曲霉菌的方法与装置，成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种黄曲霉菌的rpa引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置，解决了现有食品中黄曲霉菌生物学检测方法操作繁琐、耗时长、灵敏度不高且无法现场化操作的问题。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种黄曲霉菌的rpa引物，包括：

正向引物，所述正向引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列：

5’-gcctgtccgagcgtcattgctgcccatc-3’；

反向引物，所述反向引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列：

5’-cctacagagcgggtgacaaagccccatacg-3’。

本发明还提供了试剂盒，其包括上述黄曲霉菌的rpa引物。

本发明还提供了黄曲霉菌的检测方法，包括以下步骤：现场提取样品的dna，以所述dna为模板，利用权利要求1中所述的rpa引物进行rpa快速扩增，获得dna扩增产物，根据所述dna扩增产物的荧光现象判断样品中是否存在黄曲霉菌污染。

优选的是，所述dna的提取方法为：

步骤a、洗下样品中污染的黄曲霉菌孢子和菌丝；

步骤b、合并所述步骤a中所得的洗涤液，抽滤，得到滤饼；

步骤c、用naoh溶液重溶所述步骤b中获得的滤饼，将重溶液研磨，取研磨后的溶液稀释于te缓冲液中，完成dna的提取。

优选的是，所述步骤a中洗下样品中污染的黄曲霉菌孢子和菌丝的方法为：无菌称取颗粒状的样品置于一次性注射器内，吸取无菌水后，剧烈震荡，将水排出，再次吸取干净的无菌水，震荡，将水排出，重复2-3次。

优选的是，所述rpa快速扩增的方法为：

取2μldna模板、0.3μm正向引物、0.3μm反向引物、29.5μl反应缓冲液、1μlcelfinder^tm荧光染料和超纯水加入如权利要求2所述的试剂盒提供的rpa酶冻干粉反应管中，取2.5μl醋酸镁加入到反应管的盖子内表面，旋紧盖子混匀后，将反应管置于36±1℃的条件下反应10min，即获得dna扩增产物。

优选的是，将所述dna扩增产物置于蓝光灯下观察其绿色荧光现象，若有荧光，则样品中存在黄曲霉菌污染，且荧光越强污染程度越重；若无荧光，则样品未被黄曲霉菌污染。

优选的是，所述样品的采样方法为：

对于无包装散堆食品，按三层五点法进行代表性取样，根据样品面积大小划分为若干方块，每块为一区，每区按上、中、下分三层，每层设中心、四角共五个点，按区按点，先上后下用取样器各取少量样品，再按四分法处理取得的样品；

对于有完整包装的食品，按公式

确定取样件数，进而进行采样，式中：n为取样件数，n为总件数。

本发明还提供了用于所述黄曲霉菌的检测方法的装置，其特征在于，包括：

便携式抽滤器，其包括：上筒体、下筒体和微孔滤膜，所述上筒体的一端旋接有上端盖，另一端的内壁连接设置有直径逐渐减小的收口，所述下筒体的一端旋接有下端盖，另一端内径向设置有网格，所述下筒体靠近所述网格的一端侧壁上开设有抽滤口，所述上筒体的直径大于所述下筒体的直径，所述下筒体的直径大于所述收口的小口端的直径，所述上筒体扣接在所述下筒体上方，所述网格上放置微孔滤膜，所述收口的小口端压在所述微孔滤膜的上表面；

简易研钵，其包括由水砂纸制成的盒体和钵杵，所述钵杵由水砂纸折叠而成；

其中，所述上筒体用于盛放所述洗涤液，所述抽滤口与一次性注射器的注射口相匹配，所述注射口插接在所述抽滤口外周，利用一次性注射器进行抽气；

所述水砂纸制成的盒体用于盛放重溶液，利用水砂纸折叠而成的钵杵进行研磨。

优选的是，所述微孔滤膜的直径为25mm，孔径为0.8μm。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、特异性强：本发明根据黄曲霉菌的特异性基因序列设计引物seqidno.1和seqidno.2，该引物对经过blast特异性比对和实际特异性检测表明具有良好的检测特异性，克服了传统的基于形态特征的检测方式所存在的容易误检、特异性不高的问题；

第二、灵敏度高：采用本发明所述的试剂盒检测样品中的黄曲霉菌具有非常高的灵敏度，可以达到10个孢子每克样品的检出限，表明该试剂盒可在污染程度较低的情况下准确地检测出黄曲霉菌；

第三、操作简便：本发明提供了一种新的dna的快速简便提取方法，结合所提供的体温下rpa反应，克服了已有黄曲霉菌生物检测方法操作复杂、费时费力，依靠实验仪器无法实现现场化检测的问题，本发明建立了从采样到检测的全过程检测体系，实现了37℃等温条件下，30min准确、快速、高效地检测到黄曲霉菌，同时对实验场所要求简单，不需要复杂仪器，十分适合基层样品抽检；

第四、本发明可实现对食品是否已污染黄曲霉菌，以及污染黄曲霉菌的程度进行提前排查，有利于控制黄曲霉菌的进一步传播，减少黄曲霉毒素的污染，有利于保护食品品质，维护消费者的健康。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述便携式抽滤器的结构示意图；

图2为琼脂糖凝胶电泳检测结果与本发明的荧光检测结果对比图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实例1>

1.现场化快速提取玉米样品的dna

1)按三层五点法进行代表性取样：根据样品面积大小划分为若干方块，每块为一区。每区按上、中、下分三层，每层设中心、四角共五个点。按区按点，先上后下用取样器各取少量样品，再按四分法处理取得样品。

2)对上述得到的玉米样品进行dna的提取：无菌称取25g待测样品置于50ml一次性注射器内，吸取无菌水后，剧烈震荡3min，将水排出，再次吸取干净的无菌水，震荡30s后排出，重复2次，以洗下样品上可能污染的黄曲霉菌孢子和菌丝；

取出便携式抽滤器，将微孔滤膜100置于下筒体102的网格上，拧紧下端盖104，将上筒体101倒扣在下筒体102上方，使上筒体101的收口105压紧所述微孔滤膜100，拧开上端盖103，将上述所得洗涤液合并，倒入上筒体101中，拧紧上端盖103，将一次性注射器插接在所述抽滤口106外周，利用一次性注射器进行抽气，抽滤完成后，取下上筒体，在微孔滤膜上得到滤饼；

用200μl0.5m的naoh溶液重溶滤饼，将重溶液加入到水砂纸制成简易研钵的盒体中，利用水砂纸制成的钵杵研磨60s，取研磨后的溶液2μl十倍稀释于te缓冲液中，完成dna的提取。

2.检测样品中黄曲霉菌的污染程度

1)利用上述提取的dna为模板，以及如seqidno.1所示的正向引物和如seqidno.2所示的反向引物进行rpa快速扩增：取2μldna模板、0.3μm正向引物、0.3μm反向引物、29.5μl反应缓冲液、1μlcelfinder^tm荧光染料，加超纯水至50μl，将上述反应体系加入到包括有本发明所述rpa引物的试剂盒提供的rpa酶冻干粉反应管中，取2.5μl醋酸镁加入到反应管的盖子内表面，旋紧盖子混匀后，将反应管置于手上(36±1℃)反应10min，即获得dna扩增产物。

2)将上述获得的dna扩增产物置于蓝光灯下观察产生绿色荧光情况，如果有荧光，表示待测样品中存在黄曲霉污染，且荧光越强污染程度越重，如果没有荧光，则表示待测样品未被黄曲霉污染。

<引物特异性试验>

表1检测结果

anrrl：美国伊利诺伊州北部地区研究实验室

baccc:中国农业微生物菌种保藏管理中心

cx(x):中国农业科学院农产品加工研究所实验室

dcgmcc：中国普通微生物菌种保藏管理中心

分别以25中常见谷物污染真菌的dna为模板，采用包括有本发明所述正向引物seqidno.1和反向引物seqidno.2的试剂盒进行rpa扩增反应，进行特异性验证，验证结果如表1所示，结果显示只有8株黄曲霉菌可观察到阳性反应，而其他非目标菌株的反应均呈阴性。

<灵敏度试验>

将玉米样品用70％乙醇浸泡2min，然后用1％次氯酸钠溶液处理10min制成无菌样品，按100μl孢子液/g样品添加浓度10⁷-10²个孢子/ml的孢子液，混匀，制成含量为10⁶～10¹个孢子/g的人工侵染样品。

将上述人工侵染的样品按本发明实例1中采用的方法提取dna、进行rpa扩增反应，置于蓝光灯下观察产生绿色荧光情况；

另外，采用琼脂糖凝胶电泳方法检测上述人工侵染样品。琼脂糖凝胶电泳检测结果(a)和上述荧光检测结果(b)的对比图如图2所示。检测结果表明，利用本发明所述黄曲霉菌的检测方法和装置，可以得到和琼脂糖凝胶电泳检测相似的结果，且污染程度越重荧光越强，证明了本发明的准确性。另外，本发明的最低检出限(lod)达到10¹个孢子/g样品，灵敏度高。并且本发明从采样到检测的全过程，可在37℃等温条件下实现，同时30min准确、快速、高效地检测到黄曲霉菌，对实验场所要求简单，不需要复杂仪器，十分适合基层样品抽检。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

sequencelisting

<110>中国农业科学院农产品加工研究所

<120>黄曲霉菌的rpa引物、试剂盒、及黄曲霉菌的检测方法与装置

<130>2021-01-12

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