纳多西烷缩合物及其制备方法和用途

本发明涉及纳多西烷型倍半萜缩合物，尤其是涉及一种采自于西沙lemnalia属珊瑚中提取的纳多西烷缩合物及其制备方法和用途。

背景技术：

海洋软珊瑚具有美丽的外表，极容易吸引那些掠食者，因此这些生物想要生存就必须拥有有效的自我保护方法，这就促使了一些特征代谢产物的产生。因此，软珊瑚是发现结构多样、具有潜在治疗应用价值的萜类化合物的丰富来源。近年来，从热带到极地的海洋，如台湾和南海海域，许多海洋软珊瑚的潜在生物活性化学成分已被研究。

lemnalia属软珊瑚（lemnaliasp.）属腔肠动物门（coelenterata），八放珊瑚亚纲（octocorallia），海鸡冠目（alcyonacea），棘软珊瑚科（nephtheidae）动物，属于低等原始海洋生物，其种类有30余种，其中大约只有15种的化学成分得到研究。lemnalia属的海洋软珊瑚提供了许多具有不同化学结构的新萜类化合物，包括倍半萜类、降倍半萜类、二萜类、二萜苷类和甾体。倍半萜类化合物是软珊瑚中最显著的代谢产物，常被认为是该属软珊瑚的化学分类学标记物。根据其化学结构的碳骨架，可以对其进行分类，如nardosinane型（纳多西烷型）、neolemnane型、ylangane型和其他类型的倍半萜。

在我们探索海洋生物活性次生代谢产物的过程中，通过水肺潜水技术在西沙群岛海域（7米深）处采集到了一种软珊瑚lemnaliasp.。对丙酮提取物进行了化学成分的研究，获得了2个新的纳多西烷型倍半萜缩合物nardosinoidsa(1)和b(2)。目前，尚未有此2个结构及其功能活性的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗菌、抗炎活性的纳多西烷缩合物及其制备方法和用途。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种纳多西烷缩合物，从中国南海的西沙群岛海岸深处采集的lemnalia属软珊瑚（编号xssc201915）所产生的次级代谢产物中分离得到，其化学结构通式如下所示：

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上述纳多西烷缩合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）粗浸膏的获得：将冷冻软珊瑚切成块冻干，用丙酮超声提取至无色，减压回收丙酮至干，然后用由等体积的水和乙醚组成的混合液重复萃取若干次，合并乙醚萃取液后减压浓缩，获得粗浸膏；

（2）将步骤（1）得到的粗浸膏用正相硅胶色谱分离，采用体积比为（50:1）~（1:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，合并得到5个组分；

（3）将步骤（2）得到的第3个组分进行反相中压柱色谱分离，采用甲醇含量为40wt%至100wt%的甲醇-水溶液为流动相进行洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从大到小排列，合并得到8个组分；

（4）将步骤（3）得到的第5个组分用正相硅胶色谱分离，采用体积比为（10:1）~（1:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱液进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，合并得到9个组分；

（5）将步骤（4）得到的第5个组分用反相半制备高效液相色谱进行分离，得到化合物1和化合物2。

步骤（2）中所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为50：1、20：1、10：1、5：1、2：1和1：1。

步骤（3）中所述的甲醇-水溶液的洗脱梯度为甲醇体积含量依次为40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%。

步骤（4）中所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为10：1、5：1、2：1和1：1。

步骤（6）中所述的反相半制备高效液相色谱的流动相为质量浓度95%的甲醇-水溶液，流速为2ml/min。

上述纳多西烷缩合物1和缩合物2在制备枯草芽孢杆菌抑制剂方面的用途。

上述纳多西烷缩合物2在制备金色葡萄球菌抑制剂方面的用途。

上述纳多西烷缩合物2在体外抗炎活性方面的用途。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明纳多西烷缩合物及其制备方法和用途，包括两种纳多西烷缩合物，其制备方法为，将采自于南海西沙群岛lemnalia属软珊瑚冻干，用丙酮超声提取6次至无色，减压回收丙酮至干，再用然后用等体积的水和乙醚重复萃取，合并萃取液后减压浓缩，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析，中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到化合物1和2，其中化合物1和2具有抗枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的作用，为研制新的抗菌药物提供了新的先导化合物。此外，化合物2对lps诱导巨噬细胞的no产生也有中等抑制作用。

附图说明

图1为本发明化合物1的核磁共振氢谱；

图2为本发明化合物2的核磁共振氢谱；

图3为本发明化合物1的核磁共振碳谱；

图4为本发明化合物2的核磁共振碳谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

从lemnalia属软珊瑚中提取分离到的2个新的纳多西烷型倍半萜缩合物nardosinoidsa(1)和b(2)，其化合物结构式如下所示：

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实施例2

纳多西烷缩合物的制备方法，步骤如下：

1、粗浸膏的获得：将冷冻软珊瑚切成块冻干，用丙酮超声提取至无色，减压回收丙酮至干，然后用由等体积的水和乙醚组成的混合液重复萃取若干次，合并乙醚萃取液后减压浓缩，获得粗浸膏；

2、化合物的分离纯化

（1）将上述粗浸膏用正相硅胶色谱（200-300目）分离，采用体积比为（50:1）~（1:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱，根据薄层板监测，按流分极性从小到大排列，依次收集合并得5个组分fr.1~fr.5，其中石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为50：1、20：1、10：1、5：1、2：1和1：1；

（2）再将步骤（1）得到的第3流分进行反相中压柱色谱分离，采用甲醇含量为40wt%至100wt%的甲醇-水溶液为流动相进行洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从大到小排列，依次收集合并获得8个组分，其中甲醇-水溶液的洗脱梯度依次为40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%；

（3）将步骤（2）得到的第5个组分（fr.3.5）经正相硅胶色谱分离，采用体积比为（10:1）~（1:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱液进行梯度洗脱，逐管收集洗脱液，按流分极性从小到大排列，得到9个组分（fr.3.5.1~fr.3.5.9），其中石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为10：1、5：1、2：1和1：1；

（4）将步骤（3）得到的第5个组分（fr.3.5.5）进行反相半制备高效液相色谱分离（95%甲醇-水溶液，流速2ml/min，等度50min），得化合物1（9.8mg）和化合物2（28.0mg），它们的化学结构通式如下所示：

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实施例3

化合物的结构鉴定及核磁信号归属：

nardosinoida（化合物1）：无色油状固体；[α]25d=-42(c0.1,meoh)；由正离子高分辨质谱(hresims)准分子离子峰提供的精确分子量m/z493.3293[m+na]⁺(计算值为c30h46o4na，493.3294)，给出该化合物的分子式c30h46o4，具有8个不饱和度。该化合物的¹h和¹³cnmr数据见图1和图3、表1。

nardosinoidb(化合物2)：无色油状固体；[α]25d=-66(c0.1,meoh)；由正离子高分辨质谱(hresims)准分子离子峰提供的精确分子量m/z493.3286[m+na]⁺(计算值为c30h46o4na，493.3294)，给出该化合物的分子式c30h46o4，具有8个不饱和度。该化合物的¹h和¹³cnmr数据见图2和图4、表1。

表1化合物1和2的¹hnmr和¹³cnmr(¹h600mhz,¹³c150mhz,cdcl3)

^aoverlappedsignals。

实施例4

化合物nardosinoidsa(1)和b(2)的抗菌活性检测及应用

1、实验样品

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物1和2的单体化合物，精密称取适量样品，分别用dmso配制1.28mg/ml溶液。该实验使用的指示菌为枯草芽孢杆菌，庆大霉素为阳性对照。

2、实验方法

使用96孔微孔板中的培养基微量稀释，对化合物1和2进行体外抗菌实验。将指定的甘油保种菌株分别吸取10μl放入肉汤培养基中，震荡培养活化。在无菌96孔微孔板中每个孔都加入100μl含2,3,5-氯化三苯基四氮唑(ttc)显色剂的mh培养基，第一排孔加入10μl的上述化合物和90μl的含ttc的mh培养基，并依次稀释，对应的测试化合物的最终浓度为256、125、64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/ml，再将50ml的mh培养基加入10μl的种子液，充分混匀，分别每孔加入100μl的菌液，37℃培养箱培养，18h，36h后观察颜色。

3、实验结果

表2化合物1和2的抗菌活性筛选结果

由表2可见，化合物1和2对枯草芽孢杆菌具有中等抑制作用，最低抑菌浓度（mic）为4-8μg/ml，其中化合物2对金色葡萄球菌也有抑制作用，最低抑菌浓度（mic）为16μg/ml。

实施例5

化合物nardosinoida(1)和b(2)的抗炎活性检测及应用。

1、实验样品

被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例2中分离纯化的所得化合物1和2纯品，精密称取适量样品，用dmso配制成20mm的母液50μl。该实验使用的阳性药为氢化可的松为阳性药。

2、实验方法

取raw264.7细胞株1×10⁴cells/well（腹腔巨噬细胞1×105cells/well）置96孔培养板中预贴壁成单层，设置alone孔（不用lps刺激，不加待测化合物）、control孔（lps终浓度100ng/ml，不加待测化合物）及检测孔（lps终浓度100ng/ml，加入待测各化合物10µmol/ml），置37℃，5%co2，培养24h，收集上清。

griess法检测no浓度，100µl培养上清加等体积griess试剂(1%sulfanilamide,0.1%n-(1-naphthyl)-ethylenediaminedihydrochloride,2%phosphoricacid)室温反应10min，酶标仪在540nm处测量每个孔的吸光度值，以亚硝酸钠标准曲线计算no浓度。

3、实验结果

表3化合物1和2的抗炎活性筛选结果

由表3可见，化合物2对lps诱导巨噬细胞的no产生具有中等抑制作用，其ic50为13.09μm。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。