一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用

本发明属于生物催化有机合成领域，具体涉及一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用。

背景技术：

脱羧酶是一种反应速度极其剧烈，且容易受到产物抑制的一类酶。多巴脱羧酶能够催化多巴（dp）脱羧产生多巴胺(da)。医学上，多巴胺可用于治疗休克，心力衰竭，支气管哮喘等疾病。此外，多巴胺在碱性条件下还可以自聚为聚多巴胺，拥有着良好的稳定性和水相容性，可用于对纳米材料的改性。但是多巴胺能严重抑制酶的活性，使其无法做到高效生产。

石墨烯具有巨大的比表面积、独特的二维结构及化学稳定性，有优异的电学、力学、热学及机械性质，已成为当前开发新型催化剂载体的新领域。石墨烯衍生物—氧化石墨烯(go)，包含多个基团，如羟基、羧基、环氧基团及羰基，易被化学修饰改性，并能在溶剂中很好地分散。脱羧酶表面有许多游离的羟基、酚羟基、羧基、氨基、巯基等功能基团，可与羧基、醛、酮等发生醚化、烷基化、酰化等反应，被共价修饰到石墨烯表面。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用，该方法选用高比表面积氧化石墨烯作为载体，运用共价结合法固定多巴脱羧酶技术，对氧化石墨烯表面进行修饰，在载体表面引入能够与酶发生特异性共价反应的功能基团，并在温和条件下与酶进行键合固定；所得固定化酶通过协同催化效应，提高反应转化率，稳定性高。另外，此制备技术环保无污染，后处理简单，转化率高，可重复利用，对拓展酶催化脱羧的工业化技术应用开发有重要意义。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：

一种制备石墨烯固定化酶的方法，包括以下步骤：

步骤1，取1mg/ml氧化石墨烯go水分散液，加入naoh和氯乙酸钠固体，使naoh和氯乙酸钠浓度保持在3-4mg/ml，水浴超声反应1-2h；用稀hcl中和，再用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥，得到表面羧基活化的氧化石墨烯粉体，密闭保存，备用；

步骤2，将上述所得酸活化氧化石墨烯粉体加至含交联剂的水溶液中，超声20-30min后，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）水溶液中,使得edc的终浓度维持在1.2-3mg/ml；常温下剧烈搅拌12-16h，使反应充分螯合后，离心分离，所得固体用去离子水反复洗涤，直至洗涤液ph呈中性；再在真空环境下干燥15-24h，得到表面活性基团修饰的功能化氧化石墨烯；

步骤3，取5mg表面活性基团修饰的功能化氧化石墨烯粉末加到5ml的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)中，超声5-10min后，加入含多巴脱羧酶（ddc）的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)中，使得混合液中多巴脱羧酶与功能化氧化石墨烯的初始浓度维持在0.2-0.6:1,在4℃下反应3-5h后，离心分离，洗涤，得到石墨烯固定酶催化剂颗粒，冷冻干燥后储存于-20℃下，即得石墨烯固定化酶。

作为改进的是，步骤2中所述交联剂为聚乙醇二胺（peg-nh2），6-臂聚乙醇二胺（6-br-peg-nh2）,甲氧基聚乙醇胺（mpeg-nh2）或n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）中一种。

上述所得石墨烯固定化酶在催化多巴（dp）脱羧产生多巴胺上的应用。

作为改进的是，具体的应用步骤如下：将石墨烯固定酶溶解于含有2mmol/l的辅酶磷酸吡哆醛plp的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)，在40℃下孵育5min后，加入底物多巴固体进行催化，控制底物多巴的浓度不超过10mg/ml，(底物浓度高，生成的产物浓度越高，会严重抑制酶活，影响酶的重复使用次数），反应10-15min后将固定化酶离心取出，重新溶解于含有辅酶磷酸吡哆醛plp的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)，再接着进行催化，每次反应10-15min后，将酶取出进行新一轮的催化，经过一段催化次数后，计算重复使用率。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用，具体优势如下：

通过应用本发明制备所得的功能化活性石墨烯固定酶催化剂可用于多巴的脱羧催化，具有转化率高、反应条件温和、产物易分离、环保等特点；该方法适于多种脱羧酶的固定化，所制得的固定化脱羧酶催化剂不易失活，不易脱落，反应转化率高，重复使用率高，特别在具有产物抑制的催化领域有广阔的应用前景。

附图说明

图1为不同种类的交联剂对固定化酶催化的影响；

图2为功能化活性石墨烯固定酶的电镜图片，（a）固定酶前的石墨烯，（b）固定酶后的石墨烯；

图3为功能化活性石墨烯固定酶的催化结果，（a）固定化酶的连续催化结果，下降的虚直线表示固定化酶每次反应底物的消耗，上升的实直线表示每次反应产物的生成，（b）游离酶的催化结果，下降的直线表示游离酶连续催化反应中底物的消耗，上升的折线表示产物的生成。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

以下实施例中材料、未提及的技术手段均为本领域常规的，无需特殊说明。

实施例1功能化氧化石墨烯的制备

称取100mg的氧化石墨烯go，溶解于100ml的去离子水中，并超声1h，制成1mg/ml的水分散液；加入4g的naoh和3g氯乙酸钠，水浴超声30min；加入100ml0.1mol/lhcl中和，再用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥，得到表面羧基活化的氧化石墨烯粉体。

选择了4种固定化所需的交联剂，分别为peg-nh2，6-br-peg-nh2,mpeg-nh2,nhs。取上述所得酸活化氧化石墨烯粉体10mg加至10ml含不同交联剂（交联剂浓度20mg/ml）的水溶液中，超声30min；再将上述水溶液加入10ml10mg/ml的edc水溶液中，25℃下，800rpm搅拌16h，使螯合反应充分进行；将溶液离心分离，所得固体用去离子水反复洗涤，直至洗涤液ph呈中性；再真空干燥24h，得到表面活性基团修饰的功能化氧化石墨烯粉末。

实施例2石墨烯固定酶催化剂的制备

以peg-nh2-go-ddc的为例说明石墨烯固定酶催化剂的制备的过程，取10mgpeg-nh2修饰的功能化氧化石墨烯粉末加入到10ml的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)中，超声分散20min后，加入1ml浓度为4mg/ml的多巴脱羧酶的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)中，在4℃下,200rpm搅拌反应4h后，4000rpm离心分离，洗涤，得到石墨烯固定酶催化剂颗粒，冷冻干燥24h后储存于-20℃下备用。功能化氧化石墨烯粉末固定酶前、后的电镜照片如图2所示。

实施例3制备功能化活性石墨烯固定酶催化剂进行催化反应

取1mg不同交联剂制备功能化活性石墨烯固定酶催化剂和等量的游离酶粉进行催化反应。反应体系和检测方法除连续催化步骤外均与实施例4相同。不同的交联剂制备的石墨烯固定酶催化剂与游离酶的相对活力如图2所示。

实施例4固定化酶的连续高效催化

取1mgpeg-nh2修饰的功能化氧化石墨烯固定酶催化剂颗粒溶解于1ml含有5mmol/lplp的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)中,在35℃下孵育5min后，加入10mg多巴固体进行催化，反应10min后，4℃，6000rpm离心2min,倒出上清，将固定化酶取出，重新溶解于1ml含有5mmol/lplp的pbs缓冲液(50mmol/l，ph7.0)中，重复上述催化步骤，连续催化10次后，结束反应。将每次反应的上清液吸取400μl加入到800μl的1%（v/v）的三氟乙酸溶液中终止反应。利用高效液相色谱法（采用agilenttc-c18色谱柱（150mm×4.6mm,5μm）；以0.1%三氟乙酸溶液-乙腈（96:4）为流动相；流速1.0ml·min^-1;检测波长为280nm;柱温:室温）检测多巴胺的生成量。重复使用10次后，多巴胺的累计产量达到64.02g/l,酶活力保持为原来的68.25%（图3（a）所示)。等量的游离酶进行的催化结果如图3（b）所示，当多巴胺的浓度达到21.8g/l时，多巴脱羧酶的活力受到严重抑制，反应终止。

本发明通过功能性氧化石墨烯与多巴脱羧酶的共价结合的方式，将酶固定在不溶性材料上，方便将酶从反应体系中取出，有效减缓了产物抑制的作用。此外，筛选了合适的交联剂，不仅能够将酶以共价交联的方式固定住，还能与底物多巴的羟基通过电荷作用，使其靠近多巴脱羧酶，促进了酶的脱羧反应的快速进行，宏观表现上为没有表现出常规固定后的活性降低。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。