一种海藻酸铜负载漆酶、介体ABTS复合生物催化剂的制备方法

本发明属于酶催化剂技术领域，具体涉及一种海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的制备方法。

背景技术：

漆酶是一种环境友好的多铜氧化酶，具有催化能力强、效率高和作用底物的范围广等优点，应用在印染废水脱色、纸浆漂白、污水除毒及生物修复等过程。现有技术中，具有生物酶-介体abts(2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)复合催化剂的制备及循环利用工艺复杂、催化活性低，残留的abts有一定的环境毒害性，不利于周围环境的绿色发展，而且制得的生物酶-介体催化剂不能多次循环使用，不能有效催化底物。但是，在印染废水有机污染物治理过程中abts介体呈游离状态，故每次重复使用过程中需重新添加生物酶介体abts，造成介体abts不能回收利用，增加了生产成本。

与游离酶相比，固定化漆酶提高了生物酶的热稳定性、化学稳定性、重复利用性以及易分离等性能，已被广泛应用于印染废水脱色、纸浆漂白、污水除毒及生物修复等众多领域。介体物质abts的化学性质和循环利用的特点对固定化漆酶的催化活性及应用推广起着关键的作用。由于介体abts是增强漆酶催化活性的关键中间物质，选择合适的材料和方法将其固定化成为一个关键问题。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的制备方法。本发明采用包埋和交联的固载技术，通过铜离子配位交联作用，由天然生物质海藻酸分子配位键合后，生物酶再互相交联形成的固定化的生物酶催化剂，在印染工业中蒽醌染料活性蓝kn-r催化降解脱色反应表现出优异的催化活性，将大分子生物酶固载后，可循环利用，使用寿命长，降低了工业应用成本。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、将海藻酸钠粉末溶解在去离子水中制得质量分数为1.5wt％-3wt％的海藻酸钠水溶液，然后进行超声波处理；

s2、将无水硫酸铜溶于去离子水中，配制成0.1mol/l-0.2mol/l的硫酸铜溶液；

s3、向步骤s1获得的海藻酸钠水溶液中加入介体物质abts获得溶液a，然后进行超声波处理；

s4、向步骤s1获得的海藻酸钠水溶液中加入漆酶获得溶液b，然后进行超声波处理；

s5、将步骤s3的溶液a逐滴加入步骤s2的硫酸铜溶液中，并搅拌至反应结束，制得固定化的介体物质abts胶珠；

s6、将步骤s4的溶液b逐滴加入步骤s2的硫酸铜溶液溶液中，并搅拌至反应结束，制得固定化的漆酶胶珠。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤s1中超声波处理在温度40-50℃和频率100hz条件下，超声波处理的时间为10-20min。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤s3中介体物质abts的浓度为0.1mmol/l-5mmol/l，步骤s4中漆酶的浓度为2.5g/l-10g/l。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤s3和步骤s4中超声波处理在温度25℃和频率50hz条件下，超声波处理的时间为10-20min，超声处理完成后取出备用，以胶管中气体均匀上升为溶液混匀。

作为本发明的一种优选技术方案，所述复合催化剂的直径为1-3mm，且海藻酸钠负载2.5g/l-10g/l的漆酶活性。

本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：

本发明制备的海藻酸铜负载的漆酶-介体abts复合生物催化剂是采用海藻酸钠绿色生物质材料为模板，再利用铜离子的配位络合作用，将游离的漆酶和介体abts分别形成圆球形的复合生物酶催化剂。

本发明制备的海藻酸铜负载的漆酶-介体abts复合生物催化剂由生物质海藻酸铜分别与酶分子和abts分子络合后，进行生物质材料负载催化，在印染废水难降解有机污染处理的环境治理中表现出优异的催化活性。将大分子生物酶和介体abts固定化后，可循环利用，使用寿命长，重复5次后仍能保持80％以上的活性艳蓝kn-r降解分率及75％以上的刚果红降解率，降低了生产成本，具有良好的工业应用前景。

本发明的制备工艺简单、反应温和、原材料易得、价格低廉、对环境无污染。

附图说明

图1是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂在印染废水中难降解染料的循环再利用对活性艳蓝的脱色率的示意图一；

图2是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂在印染废水中难降解染料的循环再利用对活性艳蓝的脱色率的示意图二；

图3是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的sem图片一；

图4是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的sem图片二；

图5是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的sem图片三；

图6是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的sem图片四；

图7为介体物质abts固定化测试示意图；

图8为生物酶漆酶固定化测试示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的制备方法，包括以下步骤：

s1、将海藻酸钠粉末溶解在去离子水中制得质量分数为1.5wt％-3wt％的海藻酸钠水溶液，然后进行超声波处理；其中，超声波处理在温度40-50℃和频率100hz条件下，超声波处理的时间为10-20min；

s2、将无水硫酸铜溶于去离子水中，配制成0.1mol/l-0.2mol/l的硫酸铜溶液；

s3、向步骤s1获得的海藻酸钠水溶液中加入浓度为0.1mmol/l-5mmol/l的介体物质abts获得溶液a，然后进行超声波处理；

s4、向步骤s1获得的海藻酸钠水溶液中加入浓度为2.5g/l-10g/l的漆酶获得溶液b，然后进行超声波处理；超声波处理在温度25℃和频率50hz条件下，超声波处理的时间为10-20min，超声处理完成后取出备用，以胶管中气体均匀上升为溶液混匀；

s5、将步骤s3的溶液a逐滴加入步骤s2的硫酸铜溶液中，并搅拌至反应结束，制得固定化的介体物质abts胶珠；超声波处理在温度25℃和频率50hz条件下，超声波处理的时间为10-20min，超声处理完成后取出备用，以胶管中气体均匀上升为溶液混匀；

s6、将步骤s4的溶液b逐滴加入步骤s2的硫酸铜溶液中，并搅拌至反应结束，制得固定化的漆酶胶珠。

实施例1

(1)海藻酸铜载体固定化介体物质abts的制备

将2.5g海藻酸钠粉末加入100ml去离子水中，室温下剧烈搅拌约30min至完全溶解。然后，在频率100hz条件下，室温超声约10min，制得质量分数为2.5wt％的海藻酸钠水溶液。往上述溶液中，加入介体物质abts(5mmol/l)，然后频率50hz条件下，常温超声约10min，制得均匀的溶液。将上述溶液逐滴加入100ml硫酸铜溶液中(0.1mol/l)，并同时搅拌至反应结束，制得固定化的介体物质abts胶珠。

(2)海藻酸铜载体固定化漆酶的制备

将2.5g海藻酸钠粉末加入100ml去离子水中，室温下剧烈搅拌30min，至完全溶解。然后，在频率100hz条件下，常温超声约10min，制得质量分数为2.5％的海藻酸钠水溶液。往上述溶液中，加入漆酶(10g/l)，然后在频率50hz条件下，常温超声约10min，制得均匀的溶液。将上述溶液逐滴加入100ml硫酸铜溶液中(0.1mol/l)，并同时搅拌至反应结束，制得固定化的漆酶胶珠。

实施例2

固定化漆酶的酶活测定

以缓冲液和abts混合，取5g海藻酸铜载体固定化漆酶，加入10mlabts(0.1mmol·l-1)和40ml醋酸-醋酸钠缓冲溶液(ph＝4.6)，反应20min后冰浴停止，取上清液过滤后测420nm处的吸光度。

固定化漆酶的酶活计算公式如下：

u/ml＝((δav/εdt)/v0)×105。

δa＝1.43u＝u/l＝99.39μmol/mg/min99.39/422.23＝23.54％。

实施例3

催化剂性能测试：

将实施例1和2中所得的生物酶-固定化abts复合催化剂用于印染废水难降解有机物染料的处理中，具体使用步骤为：

将5g固定化介体物质abts(0.1mmol/l)和5g固定化漆酶(10g/l)加入100ml活性艳蓝kn-r(75mg/l)，溶液ph约为6.5-7，在温度35-45℃下，搅拌反应1小时，进行染料催化降解反应实验。反应完成后，过滤并用蒸馏水洗涤三次，得到循环再生的复合催化剂，接着投入相同条件下第二轮循环降解反应中。同样的步骤，循环利用5次实验。用普析紫外可见分光光度计tu-1901进行检测。

所有活性数据均经过三次以上重复实验，误差范围在5％以内。

图1-图2是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂在印染废水中难降解染料的循环再利用对活性艳蓝的脱色率的示意图，脱色率≥96％。

图3-图6是本发明所制备的海藻酸铜负载漆酶、介体abts复合生物催化剂的sem图片，从照片中可见所得样品呈核壳结构形貌(20-200μm)。

本发明利用电子探针显微分析仪(epma)分别对海藻酸铜负载漆酶-介体abts复合生物催化剂进行了物质成分测试和结构表征，支撑了本专利制备方法的可行性。如图7为介体物质abts固定化测试示意图(如图中元素s的特征峰所示)。如图8为生物酶漆酶固定化测试示意图(如图中元素n,o的特征峰所示)。

本发明制备的生物酶-化学复合催化剂用于蒽醌染料活性艳蓝kn-r的催化降解反应，表现出优异的催化性能，且催化寿命长，可重复使用5次以上仍能保持较高的染料脱色率。酶的固载以及循环使用，更是降低了生产成本。说明本发明制备的复合催化剂不仅具备绿色天然生物质的环境友好特点，还具有将大分子酶固定化以循环利用，显示出良好的工业应用前景。

本发明制备的催化剂以包埋法为主合成生物酶催化剂，该生物酶催化剂为核壳结构，壳层为海藻酸铜，内核为包埋了生物酶和介体的空腔结构。本发明采用包埋和交联的固载技术，通过铜离子配位交联作用，由天然生物质海藻酸分子配位键合后，生物酶再互相交联形成的固定化的生物酶催化剂，在印染工业中蒽醌染料活性蓝kn-r催化降解脱色反应表现出优异的催化活性，将大分子生物酶固载后，可循环利用，使用寿命长，降低了工业应用成本。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。