用于治疗火疫病的重组肽的制作方法

用于治疗火疫病的重组肽
1.交叉引用声明
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求于2020年3月31日提交的美国临时申请第63/003,134号的优先权，并且本临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本公开总体上涉及由通过接头/转角连接的至少两个螺旋结构域构成的重组肽。所公开的肽可以具有各种有益的农业性质和用途，例如，用于治疗和预防苹果和梨的火疫病。


背景技术：

4.提供了以下讨论以仅帮助读者理解本公开，并且以下讨论不承认描述或构成其现有技术。
5.火疫病是传染性疾病，其影响苹果和梨，以及蔷薇科(rosaceae family)的其它植物。这是世界各地(包含欧洲、澳大利亚、新西兰和日本等)，并且尤其是北美的苹果和梨生产商严重关注的问题。因果病原体是解淀粉欧文氏菌(erwinia amylovora)，其为肠杆菌目(enterobacterales)中的革兰氏阴性细菌。
6.大多数受感染的叶和枝尖迅速枯萎并变成棕色或黑色。叶死亡，但通常不会脱落，这使受感染的植物呈现出烧焦的外观。树木也会在树皮上发展出淡红色的水浸状病变。在温暖的日子里，这些病变可能会渗出橙棕色的液体。火疫病杀死个别的花朵、嫩芽、树枝，并且有时甚至会杀死整棵受感染的树。
7.火疫病的化学控制并不总是有效的，虽然修剪可以使受感染的树木保持活着，但其对防止疾病的进一步传播或治疗受感染的树几乎没有作用。
8.因此，本领域需要可以安全有效地治疗或预防苹果树和梨树的火疫病的化合物。本公开满足了此需要。


技术实现要素：

9.本文描述了新型重组肽和使用所述新型重组肽治疗或预防农业感染火疫病的方法。
10.一方面，本公开提供了一种重组肽，其包括通过接头结构域连接的至少两个螺旋肽结构域，其中所述至少两个螺旋结构域是从苹果或梨植物分离或得到的。
11.在一些实施例中，所述至少两个螺旋结构域的长度为约10个氨基酸至约20个氨基酸。在一些实施例中，所述接头结构域为约4个氨基酸。在一些实施例中，所述重组肽包括28个氨基酸或36个氨基酸。
12.在一些实施例中，每个螺旋肽结构域独立地选自seq id no:1-34中的任一个。在一些实施例中，所述至少两个螺旋肽包括相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述至少两个螺旋肽包括不同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述接头结构域包括seq id no:37。
13.在一些实施例中，所述重组肽包括seq id no:51-120中的任一个。在一些实施例中，所述重组肽包括与seq id no:51-120中的任一个具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的氨基酸序列。
14.在一些实施例中，所述重组肽包括选自seq id no:51、seq id no:55、seq id no:59和seq id no:117的氨基酸序列。
15.本公开还提供了包括根据前述方面或实施例中任一项所述的重组肽以及可接受的载体或稀释剂的调配物。在一些实施例中，所述载体是固体。在一些实施例中，所述载体是液体，如喷雾剂或气雾剂。
16.另一方面，本公开提供了治疗或预防蔷薇科的植物的火疫病感染的方法，所述方法包括向蔷薇科的植物上或附近的目标区域施用有效量的根据权利前述方面或实施例中任一项所述的重组肽或其调配物。
17.在一些实施例中，所述目标区域包括植物、植物的种子或所述植物的一部分。在一些实施例中，所述目标区域是蔷薇科的植物所生长的土壤、将进行种植的田地或植物所生长的结构。
18.在一些实施例中，施用包括用所述重组肽喷洒所述目标。
19.在一些实施例中，蔷薇科的所述植物是苹果植物或梨植物。
20.另一方面，本公开提供了治疗或预防蔷薇科的植物的火疫病感染的方法，所述方法包括使根据前述方面或实施例中任一项所述的重组肽在所述植物内表达。
21.在一些实施例中，蔷薇科的所述植物是苹果植物或梨植物。
22.在一些实施例中，所述重组肽的表达不需要改变植物基因组。
23.另一方面，本公开提供了根据前述方面或实施例中任一项所述的重组肽，其用于治疗或预防蔷薇科的植物的火疫病感染。在一些实施例中，蔷薇科的所述植物是苹果植物或梨植物。
24.另一方面，本公开提供了根据前述方面或实施例中任一项所述的重组肽用于治疗或预防蔷薇科的植物的火疫病感染的用途。在一些实施例中，蔷薇科的所述植物是苹果植物或梨植物。
25.上述总体说明以及以下详细说明是示例性且说明性的，并且旨在提供对如要求保护的本公开的进一步解释。根据以下附图说明和本公开的具体实施方式，其它目的、优点和新颖特征对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
26.图1示出了重组肽28p-2的序列以及螺旋结构域与来自苹果(apple/malus domestica)的肽的比对。
27.图2示出了重组肽28p-4和28p-8的序列以及其相应的螺旋结构域与来自苹果的肽的比对。
28.图3示出了重组肽28p-2、28p-4和28p-2以及其相应的最小抑制浓度(mic)。(a)示出了重组肽28p-2、28p-4和28p-2的比对。(b)示出了重组肽28p-2、28p-4和28p-2中的每一个对解淀粉欧文氏菌atcc 49946的mic。
29.图4示出了重组肽36p的序列以及螺旋结构域与来自苹果的肽的比对。
30.图5示出了28p-2和36p的序列和结构的比较，以及28p-2和36p在杀死影响番茄、苹果和梨植物的若干种病原微生物方面的mic。mic表明36p与28p-2相比对于解淀粉欧文氏菌明显毒性更高。
31.图6示出了用于检测解淀粉欧文氏菌的细菌引物，这些引物用于扩增p29基因。
32.图7示出了来自用水或28p-2处理的叶样品的解淀粉欧文氏菌的p29基因的ct值。
33.图8示出了解淀粉欧文氏菌的ct值。顶图示出了针对106cfu/ml的细菌的100-105稀释所测得的ct值。底图示出了使cfu/ml与ct值相互关联的标准曲线。
34.图9示出了28p-2对来自叶浸测定中使用的单个树样品的解淀粉欧文氏菌的清除百分比。
35.图10示出了苹果参考基因的ct值的并排比较，在暴露于28p-2后，所述ct值保持不变。
具体实施方式
36.本公开提供了包括通过肽接头连接的至少两个螺旋肽结构域的重组肽。本公开还提供了使用所公开的重组肽治疗或预防苹果作物和梨作物的火疫病的方法。
37.所公开的重组肽通过改善/补充植物，特别是苹果和植物的内在先天免疫而发挥作用。所公开的重组肽可以用于治疗或预防各种农业疾病，如火疫病，这些疾病对全世界的苹果和梨产业构成迫在眉睫的威胁。
38.i.定义
39.应当理解，所述方法不限于所描述的特定实施例，并且因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。本发明技术的范围将仅由所附权利要求限制。
40.如本文所使用的，某些术语可以具有以下限定的含义。如在说明书和权利要求书中所使用的，单数形式的“一种/一个(a/an)”以及“所述(the)”包含单数和复数对象，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“肽”包含单一肽以及多种肽，包含其混合物。
41.如本文所使用的，术语“包括”旨在意味着组合物和方法包含所叙述的要素，但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应当意味着排除对所述组合物和方法具有任何重要意义的其它要素。“由...组成”应当意味着排除所要求保护的组合物的大于痕量要素的其它成分和大量方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本公开的范围内。因此，意图是所述方法和组合物可以包含额外的步骤和组分(包括)，或者可替代地包含不重要的步骤和组合物(基本上由...组成)，或者可替代地，仅意在所陈述的方法步骤或组合物(由...组成)。
42.如本文所使用的，“约”意指正或负10％以及所指定的数字。例如，“约10”应理解为“10”和“9-11”两者。
43.如本文所使用的，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且所述描述包含所述事件或情况发生的实例以及事件或情况没有发生的实例。
44.如本文所使用的，“有效量”意指提供特定药理作用的肽的量，所述特定药理作用
是化合物(例如，所公开的嵌合肽)被施用于需要此类治疗或保护的植物所要实现的药理作用，即，减少、改善、消除、清除或预防火疫病感染或火疫病感染的一种或多种病征或症状。需要强调的是，有效量的化合物在治疗火疫病中并不总是有效的，即使本领域的技术人员认为此类剂量是有效量。有效量可以基于施用途径和调配物、植物的大小、被治疗的细菌和感染的严重程度等因素而变化。
45.如本文所使用的，关于植物或农业感染的术语“治疗(treatment/treating)”是指减少、改善、消除或清除火疫病感染或火疫病感染的一种或多种病征或症状。
46.如本文所使用的，关于植物或农业感染的术语“预防”或“保护”意指阻止火疫病感染发生在有感染风险或已暴露于火疫病的植物或作物(例如，苹果或梨)中。
47.如本文所使用的，术语“火疫病”是指植物(优选地蔷薇科的植物，如苹果或梨)被细菌病原体解淀粉欧文氏菌感染。
48.ii.重组肽
49.本文提供了具有抗菌性质以及其它有益活性的新型重组肽。所公开的肽包括通过肽接头结构域连接的至少两个螺旋肽结构域。两个螺旋肽结构域可以是例如两亲性螺旋。所公开的包括螺旋-转角-螺旋(hth)结构的肽具有抗微生物活性，所述活性源于有效附着到、插入和破坏细菌膜的能力。
50.a.螺旋肽结构域
51.至少两个螺旋肽结构域可以分离或来源于内源性植物蛋白或肽。例如，许多植物表达能够溶解病毒和细菌的两亲性螺旋肽作为其先天免疫系统的一部分。因此，所公开的重组肽的至少两个螺旋肽结构域可以从苹果植物、梨植物或任何其它作物或植物中分离或衍生。在一些实施例中，至少两个螺旋肽结构域分离或来源于所述肽旨在治疗或保护的植物相同类型的植物(例如，来自苹果或梨植物的抗菌螺旋肽可以用于治疗或预防苹果或梨的火疫病)。在一些实施例中，至少两个螺旋肽结构域分离或来源于与所述肽旨在治疗或保护的植物不同类型的植物(例如，来自除了苹果或梨植物的植物的抗菌螺旋肽可以用于治疗或预防苹果或梨的火疫病)。
52.至少两个螺旋肽结构域可以各自单独地包括5-20个、8-18个、10-16个或11-14个氨基酸。例如，每个螺旋结构域可以独立地包括5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。在一些实施例中，至少两个螺旋肽结构域可以各自单独地由50个、45个、40个、37个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、20个或更少的氨基酸组成。在一些实施例中，两个螺旋肽结构域中的每个螺旋肽结构域包括相同数量的氨基酸。在一些实施例中，两个螺旋肽结构域中的每个螺旋肽结构域包括不同数量的氨基酸。在一些实施例中，两个螺旋肽结构域中的每个螺旋肽结构域包括相同的氨基酸序列。在一些实施例中，两个螺旋肽结构域中的每个螺旋肽结构域包括不同的氨基酸序列；例如，在一些实施例中，一个螺旋肽序列可以是另一个螺旋肽序列的镜像或反转(例如，krivqrikdflr(seq id no:1)和rlfdkirqvirk(seq id no:2))。
53.在一些实施例中，至少两个螺旋肽结构域可以包括交替的非极性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，非极性残基选自由以下组成的组：甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)和异亮氨酸(i)。在一些实施例中，非极性残基选自由a、l和i组成的组。在一些实施例中，非极性氨基酸选自由l和i组成的组。在一些实施
例中，带正电荷的氨基酸残基选自赖氨酸(k)、精氨酸(r)和组氨酸(h)。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基选自k和r。
54.在一些实施例中，螺旋肽结构域中的任一个可以包括由0-4个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述氨基酸残基选自由以下组成的组：极性不带电荷的残基、带负电荷的残基和非极性芳香族残基。在一些实施例中，螺旋肽结构域可以各自单独地包括4个、3个、2个或1个或更少的极性不带电荷的残基、带负电荷的残基和/或非极性芳香族残基。在一些实施例中，极性不带电荷的残基选自由以下组成的组：丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、半胱氨酸(c)、脯氨酸(p)、天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)。在一些实施例中，带负电荷的残基选自由以下组成的组：天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)。在一些实施例中，非极性芳香族残基选自由以下组成的组：苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)。
55.在一些实施例中，螺旋肽结构域可以包括带正电荷的氨基酸残基与非极性氨基酸残基的混合物。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基与非极性氨基酸残基的比率为0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.9:1或1:1。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基与非极性氨基酸残基的比率为1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1或15:1。
56.适于用作所公开的重组肽的螺旋肽结构域可以来源于农作物，包含但不限于苹果植物和/或梨植物。
57.表1提供了来源于苹果植物和梨植物或其它农作物(例如，柑橘植物或葡萄植物)的示例性螺旋肽结构域。
58.表1-示例性螺旋肽结构域
59.[0060][0061]
表1中提供的螺旋肽结构域的列表并非旨在进行限制，并且技术人员将理解，其它类似的螺旋肽可以来源于其它植物并且被评估其裂解细菌膜的能力。另外地，在一些实施例中，所公开的重组肽可以包括一个或两个与seq id no:1-34同源但来源于其它植物的螺旋肽结构域。
[0062]
在一些实施例中，所公开的重组肽的螺旋肽结构域可以与表1中所公开的螺旋肽
中的任一个具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列同源性。
[0063]
在一些实施例中，所公开的重组肽的螺旋结构域可以不包括seq id no:1-34的精确序列，而是同源并维持螺旋结构的共有序列。例如，在一些实施例中，螺旋结构域可以包括至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个氨基酸并且包括以下序列：
[0064]
·
x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
，其中x1、x2、x4、x5、x8和x9是非极性残基，其中x3、x6、x
10
和x
11
是带正电荷的残基，并且其中x7是带正电荷的残基或带负电荷的残基。
[0065]
·
x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
，其中x2、x5、x6和x9是带正电荷的残基，其中x3、x4、x7、x8、x
10
和x
11
是非极性残基，并且其中x1是带正电荷的残基或带负电荷的残基。
[0066]
·
x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
12
，其中x1、x2、x6、x8和x
12
是带正电荷的残基，其中x3和x4是非极性残基，其中x5是极性不带电荷的残基，x7选自非极性残基和带正电荷的残基，x9是非极性残基或带负电荷的残基，x
10
是非极性残基或非极性芳香族残基，并且x
11
是非极性残基或极性不带电荷的残基。
[0067]
在一些实施例中，非极性残基选自由以下组成的组：甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)和异亮氨酸(i)。在一些实施例中，非极性残基选自由a、l和i组成的组。在一些实施例中，非极性氨基酸选自由l和i组成的组。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基选自赖氨酸(k)、精氨酸(r)和组氨酸(h)。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基选自k和r。
[0068]
在一些实施例中，螺旋结构域可以包括至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个氨基酸并且包括以下序列：(x
1n
x
2o
)
p
，其中x1是非极性氨基酸残基，x2是带正电荷的氨基酸残基，n为1-3，o为1-3，并且p为1-3；(x
1n
x
2o
)
p
，或其中x1是带正电荷的氨基酸残基，x2是非极性氨基酸残基，n为1-3，o为1-3，并且p为1-3。在一些实施例中，至少一个x1选自r和k。在一些实施例中，至少一个x2选自r和k。在一些实施例中，至少一个x2选自l和i。
[0069]
b.接头结构域
[0070]
连接至少两个螺旋结构域的柔性接头的长度通常为2-50个氨基酸，并且应允许重组肽作为整体维持螺旋-转角-螺旋(hth)结构。例如，在一些实施例中，接头的长度可以为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49或50个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度可以为3-15个、3-12个、3-5个、3-6个、4-10个、4-9个、4-8个、4-6个、4-5个、5-15个、5-10个、5-25个、10-20个、10-30个、10-40或15-25个氨基酸。在一些实施例中，接头可以是约4个氨基酸、至少4个氨基酸或由4个氨基酸组成。
[0071]
在一些实施例中，接头包括40％-80％不带电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，本文所公开的螺旋结构域包括包含35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％不带电荷的氨基酸残基的接头。
[0072]
在一些实施例中，接头包括10％-60％带正电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，
接头包括至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％带正电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，接头包括60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或更少的带正电荷的氨基酸残基。
[0073]
在一些实施例中，接头可以包括1-3个或2-3个氨基酸的重复，如甘氨酸-丝氨酸、精氨酸-色氨酸、丝氨酸-精氨酸-天冬氨酸等。接头可以包括极性氨基酸与非极性氨基酸的混合物，例如，极性氨基酸和非极性氨基酸的交替模式，并且极性氨基酸与极性氨基酸的比率可以是1:1、1:2或2:1。
[0074]
下表2提供了于合并到所公开的重组肽中的示例性接头。
[0075]
表2-示例性接头
[0076]
seq id no:序列35aaa36gggssgggsg37gpgr38rdtpvvks39akdgipaptnyhkkhrapvsctgpakm40gstappa41ranattlpkyyqnsrhpvsctdpsk42rw43srd44gstappa45gstappagstappa46qashtcvcefncapl47arkkasipnyynsnlqppvf csdqskm48yeqgagrgstappa49gsta50gggsgggtdgr
[0077]
表2中提供的接头肽的列表并非旨在进行限制，并且技术人员将理解，其它类似的肽可以用于可操作地连接至少两个螺旋肽结构域。
[0078]
在一些实施例中，接头肽可以与表2中所公开的接头肽中的任一个具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列同源性。
[0079]
c.示例性重组肽
[0080]
本公开的重组肽可以包括通过表2中的接头中的任何接头(或其同源物)连接的表1中所公开的两个螺旋结构域(或其同源物)的任何组合，只要所述重组肽可以维持hth结构。
[0081]
在一些实施例中，两个螺旋肽结构域相同。在一些实施例中，两个螺旋肽结构域不同。例如，在一些实施例中，第一螺旋肽结构域和第二螺旋肽结构域可以是彼此的镜像或反转(例如，krivqrikdflr(seq id no:1)和rlfdkirqvirk(seq id no:2))。在一些实施例中，
两个螺旋肽结构域可以从相同植物(例如，苹果或梨)分离或得到，而在一些实施例中，两个螺旋肽结构域可以从不同植物分离或得到。
[0082]
所公开的重组肽的长度为约20-50个、约20-45个、约20-40个、约20-35个、约20-30个、约20-25个、约25-50个、约25-45个、约25-40个、约25-35个、约25-30个、约30-50个、约30-45个、约30-40个或约30-35个氨基酸。例如，重组肽的长度可以为20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸。在一些实施例中，重组肽的长度为约28个氨基酸。在一些实施例中，重组肽的长度为约36个氨基酸。在一些实施例中，每个螺旋肽结构域可以是约10个至约18个氨基酸，并且接头可以是约4个氨基酸。在一些实施例中，接头是gpgr(seq id no:37)。
[0083]
下表3提供了适用于治疗苹果植物和梨植物的火疫病的示例性重组肽。
[0084]
表3-示例性重组肽
[0085]
[0086]
[0087][0088]
表3中提供的重组肽的列表并非旨在进行限制，并且技术人员将理解，其它类似的肽可以用于治疗苹果植物和梨植物的火疫病。
[0089]
在一些实施例中，重组肽可以与表3中所公开的重组肽中的任一个具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列同
源性。
[0090]
所公开的重组肽可以通过本领域已知的方式产生，例如，在合适的宿主细胞中重组表达。在一些实施例中，所公开的肽可以由人胚肾(hek)细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞或任何其它可用的细胞表达系统表达。可替代地，肽可以由期望保护或治疗的植物或在期望保护或治疗的植物中重组地表达。
[0091]
iii.公开的重组肽的调配物
[0092]
适用于本文所描述的方法的调配物可以与所公开的重组肽中的一种或多种重组肽以及可接受的载体或稀释剂一起调配。调配的组合物中的重组肽的含量可以为约0.01％至约95％。通过与固体载体、液体载体或气体载体以及任选的表面活性剂、其它调配物添加剂混合，可以将重组肽调配成各种类型的组合物，包含但不限于油溶液、可乳化浓缩物、可湿性粉末、可流动剂(水性悬浮液或水性乳液)、颗粒剂、粉尘等。
[0093]
可以用于包括所公开的重组肽的调配物中的固体载体的非限制性实例包含无机载体，如粘土(例如，高岭土、硅藻土、合成水合氧化硅、膨润土、富波萨米粘土(fubasami clay)、酸性粘土)、滑石、陶瓷、绢云母、石英和碳酸钙。液体载体的实例包含水、醇(例如，甲醇、乙醇、高级醇)、酮(例如，丙酮、甲基乙基酮)、芳香烃(例如，苯、甲苯、二甲苯、乙苯、甲基萘)、脂肪烃(例如，己烷、环己烷、煤油、气油)、酯(乙酸乙酯、乙酸丁酯)、亚硝酸盐(例如，乙腈、异丁腈)、醚(例如，二异丙醚、二噁烷)、酰胺(例如，n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺)、卤代烃(例如，二氯甲烷、三氯乙烷、四氯化碳)、二甲基亚砜和植物油(例如，大豆油、棉籽油)。液化气载体的实例包含碳氟化合物、氟代烃、lpg(液化石油气)、二甲醚和二氧化碳。
[0094]
在所公开的调配物中任选使用的表面活性剂的非限制性实例可以包含烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、烷基芳基醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚乙二醇醚、多元醇酯和糖醇衍生物。
[0095]
其它调配物助剂由粘合剂、分散剂和稳定剂例示。粘合剂和分散剂的非限制性实例包含酪蛋白、明胶、多糖(例如，淀粉粉末、阿拉伯树胶、纤维素衍生物、海藻酸)、木质素衍生物、膨润土、糖和合成水溶性聚合物(例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸)。稳定剂的非限制性实例包含酚类抗氧化剂，如bht(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)和bha(2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和3-叔丁基-4-甲氧基苯酚的混合物)、胺类抗氧化剂，如二苯胺、有机硫类抗氧化剂，如2-巯基苯并咪唑、pap(酸性磷酸异丙酯)、植物油、矿物油、表面活性剂、脂肪酸和脂肪酸酯。
[0096]
可流动调配物(水性悬浮液或水性乳液)可以包括所公开的重组肽中的一种或多种重组肽、分散剂、悬浮助剂(例如，保护性胶体或产生触变性的化合物)、合适的助剂(例如，消泡剂、防锈剂、稳定剂、显影剂、渗透助剂、防冻剂、杀菌剂、杀真菌剂等)和水。保护性胶体的非限制性实例包含明胶、酪蛋白、树胶、纤维素醚和聚乙烯醇，并且产生触变性的化合物的实例包含膨润土、硅酸铝镁、黄原胶和聚丙烯酸。使用在一些情况下可以溶解所公开的重组肽的油来代替水可以提供油包悬浮液(suspension-in-oil)调配物。
[0097]
以上获得的可乳化浓缩物、可湿性粉末、可流动剂等调配物可以用水或其它合适的载体稀释，并以重组肽浓度的0.1-10000ppm施用。油溶液、颗粒剂、粉尘等调配物可以原样直接施用于目标植物、种子、树干或叶。
[0098]
在一些实施例中，可以将所公开的重组肽中的一种或多种重组肽或其液体调配物
和推进剂的混合物装入带有喷嘴的压力容器中，以提供所公开的重组肽的气雾剂。用于气雾剂的推进剂的非限制性实例包含丙烷、丁烷、异丁烷、二甲醚、甲基乙基醚和甲缩醛。
[0099]
在一些实施例中，可以将重组肽应用(例如，喷雾或以其它方式分散)在期望预防特定疾病(例如，火疫病)的传播或治疗患病植物种群的一般目标区域，而不是将所公开的重组肽中的一种或多种重组肽应用于特定植物。例如，目标区域可以是已知感染部位或正在种植农作物的田地。
[0100]
可以根据调配物的类型、时间、地点和应用方法、目标植物的种类以及期望的使用类型(例如，治疗或预防)适当地设计所公开的重组肽应用于给定植物或目标区域的应用量和浓度。
[0101]
iv.使用所公开的重组肽治疗和预防火疫病的方法
[0102]
所公开的重组肽可以用于各种农业应用，但如本文所公开的，尤其可用于治疗或预防蔷薇科的植物，并且特别是苹果作物和梨作物的火疫病。火疫病影响蔷薇科的植物，包含果园、苗圃和景观种植中的树木和灌木。受影响的植物包含唐棣属(amelanchier/serviceberry)、木瓜属(chaenomeles/flowering quince)、栒子属(cotoneaster/cotoneaster)、山楂属(crataegus/hawthorn)、枇杷属(eriobotrya/loquat)、苹果属(malus)(苹果和红果)、石楠属(photinia/photinia)、李属(prunus)(开花杏、李子和樱桃)、火棘属(pyracantha/pyracantha)、梨属(pyrus)(梨)、蔷薇属(rosa)(玫瑰)以及绣线菊属(spirea/spirea)。这些宿主植物中的任一种都可以根据以下方法利用所公开的重组肽进行治疗。
[0103]
一方面，本公开提供了使用所公开的重组肽中的一种或多种重组肽治疗或预防植物(例如，苹果或梨植物)的火疫病感染的方法。一种或多种重组肽可以相同(即，包括相同的螺旋结构域和接头结构域)或不同(即，包括一个或多个不同的螺旋结构域或接头结构域)。可以将一种或多种重组肽施用于植物、植物上的靶位点、或植物附近的目标位点(例如，藤蔓正在生长或打算生长的根部或栅栏、乔木或其它结构周围的泥土)或打算培养植物的地方(例如，种植农作物之前的田地)。另外地或可替代地，通过将编码一种或多种肽的基因或表达载体引入到目标植物中，一种或多种重组肽可以由旨在治疗或保护其免受火疫病影响的目标植物来表达。
[0104]
所公开的重组肽通过利用来源于植物的两亲性螺旋裂解肽穿透细菌膜并通过裂解破坏细菌来改善目标植物的先天抗微生物防御。许多细菌具有可以被本文所公开的重组肽裂解的膜，并且鉴于这种作用机制的非特异性性质，所公开的重组肽被认为具有广谱抗菌活性，但对火疫病特别有效。
[0105]
因此，所公开的治疗或预防目标植物的火疫病感染的方法可以应用于治疗或预防蔷薇科的植物的感染。在一些实施例中，蔷薇科的所述植物是苹果植物或梨植物。所公开的治疗和预防方法适用于所有苹果品种和所有梨品种，因为这些相应品种共享显著的遗传同源性。例如，所公开的方法可用于治疗苹果品种，包含但不限于蛇果(red delicious)、金冠(golden delicious)、红玉(jonathan)、乔纳金(jonagold)、嘎啦(gala)、蜜脆(honeycrisp)、布瑞本(braeburn)、克里普斯(cripps)、罗马(rome)、考克斯黄苹果(cox's orange pippin)、爱达红(idared)、陆奥(mutsu)、艾尔斯塔(elstar)、宇宙脆(cosmic crisp)、金娇(ginger gold)、可得兰(cortland)、宝拉红(paula red)、泽斯塔(zestar)、醇
露(winesap)、北派(northern spy)、粉红女士(pink lady)、太平洋玫瑰(pacific rose)、富士(fuji)、tentation(delblush)、神仙果(ambrosia)、初香恋爵士(jazz)(科鲜(scifresh))、日落(sundowner)、爱妃(envy)、甜哥(sweetango)以及奥罗拉(aurora)。所公开的方法可用于治疗苹果品种，包含但不限于威廉姆斯(williams)、博斯克(bosc)、青啤梨(d'anjou)、考密斯(comice)、阿巴特(abate fetel)、会议(conference)、冬香(winter nelis)、红安久(red anjou)、绿安久(green anjou)、巴特利特(bartlett)、红巴特利特(red bartlett)、康考得(concorde)、佛瑞尔(forelle)、塞克尔(seckel)以及红星(starkrimson)。
[0106]
出于所公开方法的目的，重组肽可以一天三次或更多次、一天两次或一天一次应用于植物(例如，苹果或梨植物)、种子或植物的一部分。在一些实施例中，可以一天一次、隔天一次、一周三次、一周两次、一周一次、每隔一周一次、每三周一次、一个月一次、每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次或更不频繁应用重组肽。在一些实施例中，重组肽可以与一种或多种额外的杀虫剂、杀幼虫剂、杀真菌剂、抗生素、抗微生物剂、除草剂或节肢动物驱避剂一起依次或同时应用于植物。
[0107]
出于所公开方法的目的，重组肽以任何合适的形式，如喷雾剂、气雾剂、液体、凝胶、粉末或固体形式应用于预期的植物(例如，苹果或梨植物)、种子或植物的一部分。可以将重组肽调配成固体、液体或气体(例如，使用蒸气递送系统)并将其应用于植物、种子或植物的一部分。可替代地或另外地，可以通过转基因或非转基因技术将编码所公开的重组肽的一种或多种表达载体引入到植物(例如，苹果或梨植物)中，使得期望的重组肽由目标植物表达以预防或治疗火疫病。
[0108]
例如，本文所描述的重组肽可以通过多种调配物类型应用，包含分离的重组肽，其可以进一步与以下偶联：可喷粉末(dp)、可溶性粉末(sp)、水溶性颗粒剂(sg)、水分散颗粒剂(wg)、可湿性粉末(wp)、颗粒剂(gr)(缓释或快释)、可溶性浓缩物(sl)、油混溶液体(ol)、超低容量液体(ul)、可乳化浓缩物(ec)、可分散性浓缩物(dc)、乳液(水包油(ew)和油包水(eo)两者)、微乳液(me)、悬浮浓缩物(sc)、油基悬浮浓缩物(od)、气雾剂、雾化/烟雾调配物、胶囊悬浮液(cs)以及种子/植物治疗调配物。
[0109]
在一些实施例中，可以通过不同途径将重组肽递送到植物(例如，苹果植物或梨植物)。重组肽可以合适地作为气雾剂施用，例如通过喷洒到叶或其它植物体上。重组肽也可以通过注射施用，例如直接注射到植物中，如注射到茎中。在某些实施例中，将重组肽施用于根部。这可以通过用组合物喷洒或浇灌植物根部来实现。在一些实施例中，将重组肽引入到木质部或韧皮部，例如通过注射或包含在供给木质部或韧皮部的供水中。对植物的茎或叶的应用可以通过喷洒于植物的期望区域或其它直接应用来进行；然而，可以使用本领域已知的任何方法。可以用喷雾器将含有一定剂量活性成分的重组肽的溶液或媒剂应用于茎或叶直到径流以确保完全覆盖，并在生长季节重复三次或四次。可以根据植物、施用途径和正在治疗或预防的火疫病而改变浓度、体积和重复治疗。
[0110]
本发明的额外的实施例包含包括可以编码本文所描述的重组肽中的一种或多种重组肽的核酸序列的多核苷酸。例如，一些实施例可以包含包括编码seq id no:51-120中的一个或多个的核酸序列或与seq id no:51-120中的任一个具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、
约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％氨基酸序列同源性的同源物的多核苷酸。此类序列可以进一步可操作地连接到启动子以产生表达载体并进一步引入到植物，例如，苹果或梨植物。在此实施例中，此类转化的植物或植物细胞可以在体内产生重组肽。此类转化的植物可以对任何数量的细菌或病毒表现出增强的抗性。在一些实施例中，转化的植物可以表现出减少的细菌负荷和/或减少的火疫病或其它细菌性或病毒性疾病的症状或进展。稳定和短暂植物转化的方法、系统和技术，如根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)介导的转化、基于碳纳米管(cnt)的转化等是本领域已知的并且包含在本公开的范围内。
[0111]
简而言之，用于使重组肽在作为治疗或保护目标的植物(例如，苹果植物或梨植物)内体内表达的转化方法可以包含但不限于原位转化法(in planta method)，即，递送不涉及改变植物(例如，苹果或梨)基因组(即，非gmo途径)的重组肽基因，如基于碳纳米管(cnt)和非传染性glrav-7的递送系统。
[0112]
出于基于cnt的方法的目的，单壁cooh-cnt可以连接到带正电荷的聚乙烯亚胺(pei)，其上可以通过静电相互作用结合编码重组肽中的一种或多种重组肽的高拷贝puc质粒dna。编码重组肽的基因含有n端分泌信号以及上游2x35s camv和下游nos终止子。cnt-pei-dna的长度可以为约10nm至约20nm，以允许纳米粒子穿透细胞外基质并进入植物细胞。cnt-pei-dna颗粒可以通过各种途径引入到目标植物中，如通过无针注射器注射到叶中。在目标植物中表达经转化的重组肽后，蛋白质将发挥抗菌活性。
[0113]
出于非传染性glrav-7途径的目的，可以将含有携带glrav-7(其具有编码所公开的重组肽中的一种或多种重组肽的一个或多个基因)的双元载体的农杆菌(agrobacterium)渗入叶中。这允许重组肽在整个植物中或在植物的目标植物组织中持续地原位递送和运送。病毒基因盒和重组基因可以由例如2x35s camv启动子和nos终止子驱动。
[0114]
给出以下实例以说明本发明。然而，应当理解的是，本发明并不限于这些实例中描述的具体条件或细节。
[0115]
实例
[0116]
实例1-示例性重组肽的最小抑制浓度
[0117]
通过将解淀粉欧文氏菌(atcc 49946)暴露于这些示例性重组肽的系列稀释液，计算重组肽28p-2、28p-4和28p-8(图3的a)的最小抑制浓度。这些测定表明，所有三种肽都对火疫病的因果病原体具有活性，其中28p-2是经测试的最具活性的28个氨基酸长的重组肽(图3的b)。
[0118]
除了28个氨基酸长的重组肽28p-2、28p-4和28p-8，还制备和测试了36个氨基酸长的重组肽。这种被称为36p(参见图4)的肽示出，除了解淀粉欧文氏菌，对引起番茄斑点的穿通黄单胞菌(xanthomonas perforans)和真泡黄单胞菌(xanthomonas euvesicatoria)、引起番茄小点的丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)以及引起番茄青枯病的青枯雷尔氏菌(ralstonia solanaeceum)的显著活性。另外地，atcc-r、bl21-r和k12-r是三种大肠杆菌(e.coli)菌株，其已经进化出对天然存在的单螺旋的抗性，但其对所公开的hth重组肽易感。图5示出了用于测定这些微生物的28p-2和36p的mic的测定结果。应当注意，在一些情况下，由于尚未完成确切值的测定，因此仅给出了一系列mic。空白空间表示mic值尚未测定。
[0119]
实例2-分离叶测定
[0120]
对受感染的苹果品种红玉和蛇果进行的分离叶测定表明，通过20mm 28p-2实现对解淀粉欧文氏菌的100％清除。水用作对照。将受感染的叶浸入1ml的肽溶液中，持续4小时，以允许溶液被吸收。通过qpcr提取和分析基因组dna。细菌特异性引物用于测量ct值(图6)，ct值越高，细菌越少。治疗后，ct值增加，并且因此使用28p-2的治疗示出对于杀死解淀粉欧文氏菌是有效的。参见图7。也测量了106cfu/ml的细菌的100-105稀释下的ct值(图8，顶图)。这给出了使cfu/ml与ct值相互关联的标准曲线(图8，底图)。图9示出了28p-2对解淀粉欧文氏菌的100％清除。还测量了苹果参考基因的ct值，在治疗后，所述ct值的水平保持不变(图10)，这指示细菌清除并且不是核酸的整体减少。因此，叶浸测定的结果表明，28p-2在治疗解淀粉欧文氏菌中是有效的，而不会损害或改变经治疗的苹果植物中基因的表达。
[0121]
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[0122]
说明书中提及的所有专利和出版物指示了本公开所属领域的普通技术人员的水平。所有专利和公开案均以引用的方式并入本文中，其程度如同每一个别公开案专门地且单独地指示为将以引用的方式并入。
[0123]
进一步地，本领域的技术人员容易地理解，本公开内容非常适于实现所述目标并获得所提到的目的和优点，以及其中固有的目的和优点。本领域的技术人员将想到其中的修改和其它用途。这些修改涵盖在本公开的精神内，并且由权利要求的范围限定，所述权利要求的范围阐述了本公开的非限制性实施例。