甘草酸应用及可体外定向获得免疫细胞的方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体是甘草酸应用及可体外定向获得免疫细胞的方法。


背景技术：

2.甘草(licorice)，是一种豆科glycyrrhiza glabra属的具有重要药用价值的草本植物。 在世界各地都有悠久的使用历史，享有“植物之祖”的称号。甘草的使用历史可以追溯到 古亚述、埃及、中国和印度。甘草生长在干旱至半干旱的砂质土壤，沙漠边缘和海拔150-1400 米测定黄土丘陵地区。这些地区具有充足的光线，最少的降雨，炎热的夏季，寒冷的冬季 以及昼夜间的大温差是甘草喜欢的环境因素。据记载，国内的甘草分布主要集中在甘肃、 宁夏、山西、内蒙古、陕西，零星的分布在青海、河北、山东等地。其中，乌拉尔甘草(g. uralensis fisch.)分布在内蒙古、甘肃、新疆、青海、陕西、宁夏、山西和黑龙江，光果甘 草(g.glabra l.)主要分布在新疆，胀果甘草(g.inflata bat.)分布在新疆和甘肃的西北地 区。
3.甘草可用于治疗哮喘、咳嗽、肺部疾病以及肝脏疾病等，现阶段对于甘草及其生物活 性化合物的药理作用研究发现，具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗原虫、抗炎以及免疫调节 作用。甘草的有效药用成分主要包括：皂甙、黄酮类和香豆素。香料的特殊黄色源自黄酮 类化合物，甜味源自甘草酸。
4.抗炎作用和免疫调节作用是近年来研究甘草酸的药理活性的热点。甘草酸能触发干扰 素(ifn)的产生，干扰素是细胞在遭受病毒攻击时表达的广谱抗病毒蛋白家族，通常作为 感染病毒时先天免疫和适应性免疫的效应器来参加免疫反应。淋巴细胞产生的ifn-会参 加组织相容性抗原的分泌和免疫修饰。甘草酸诱导ifn的产生增加了巨噬细胞和自然杀伤 细胞的活性，并通过加速il-2的产生调节淋巴细胞的生长。此外，在疾病过程的初始阶段， 甘草酸通过调节巨噬细胞来调节免疫反应。甘草酸处理的巨噬细胞会影响t细胞向th1亚 群分化。甘草酸通过抑制ox40-ox40l信号转导和p38mapk活性来调节th1/th2细胞的 平衡以及细胞因子水平，增加cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞数量改善卵清蛋白致敏小鼠 的哮喘。
5.甘草酸也可以通过诱导肿瘤细胞中靶向凋亡的途径来抑制癌症的发生发展。黑色素瘤 具有高度转移特性，是最具有侵袭性的恶性肿瘤之一。甘草酸能抑制黑色素瘤的增殖，干 预机制是抑制pstat3降低肿瘤浸润tregs中foxp3、gitr、ctla4和肿瘤mdsc中的 cox2、pge2和精氨酸酶1(arginase 1)基因的表达以逃避treg和mdsc的抗肿瘤抑制功 能。甘草酸与mycobacterium indicus pranii联用可以抑制晚期实体瘤。在荷瘤小鼠模型中， 用甘草酸和甘草酸与顺铂(cisplatin)联合用药对比发现，甘草酸是通过txa2通路抑制肿 瘤的发展，恢复体重，挽救肝肾损伤。研究发现，甘草酸能通过靶向jnk1来诱导肝癌细胞 分化并抑制肿瘤干细胞增殖发挥抑制肝细胞癌(hcc)的作用。此外，甘草酸可以加强索 拉非尼(sorafenib)的抗肿瘤效果在治疗hcc中。甘草酸可作为研发抗肿瘤的潜在候选药 物。


技术实现要素：

6.本发明提供一种甘草酸的新应用，以及可体外定向获得免疫细胞的方法。
7.为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了甘草酸在制备用以促进体内t细胞和b细胞数量中的应 用。
9.优选的，所述的甘草酸与s100a8蛋白结合发挥作用。本发明通过大量实验证明了甘草 酸可以显著提高淋系来源的t/b免疫细胞比率，抑制髓系来源细胞比率。并证实了甘草酸发 挥效能的原因是甘草酸与s100a8蛋白结合。
10.本发明的第二个方面，提供了甘草酸在制备用以促进体外cd8+t细胞和b细胞的数量 中的应用。
11.优选的，所述的甘草酸与s100a8蛋白结合发挥作用。
12.本发明通过大量实验证明了甘草酸体外诱导造血干细胞(hsc)向t/b细胞分化的中，发 现其可以显著提高hsc向cd8+t细胞分化的数量和b细胞的数量。并证实了甘草酸发挥 效能的原因是甘草酸与s100a8蛋白结合。
13.本发明的第三个方面，提供了一种可体外定向获得免疫细胞的方法，包括：在细胞培 养液中加入有效量的甘草酸。
14.优选的，一种可体外定向获得免疫细胞的方法包括以下步骤：
15.s1、骨髓单细胞悬液制备；
16.s2、lineage细胞阴性选择；
17.s3、cd117细胞阳性选择，取步骤s2富集得到的lineage-negative细胞加入cd117 microbeads，最终得到lin-cd117+hsc；
18.s4、共培养定向分化，op9与lin-cd117+hsc在含有甘草酸的培养基中共培养定向分化 为b细胞，op9-dl1与lin-cd117+hsc在含有甘草酸的培养基中共培养是定向分化到t细胞。
19.优选的，所述甘草酸在培养基中的浓度为：3.125-50μm。
20.优选的，一种可体外定向获得免疫细胞的方法，简要概括如图1a所示，具体的方法包 括以下步骤：
21.步骤一、骨髓单细胞悬液制备
22.收集骨髓样本，用移液枪将骨髓细胞吹打开，吹匀不要有细胞结块；收集骨髓单细胞 pbs悬液，用70μm细胞筛过滤到50ml的离心管中；用预冷pbs冲洗培养皿和细胞筛，将 其同样过滤进离心管中，440xg离心5min，弃上清；骨髓单细胞用5ml红细胞裂解液重悬， 裂解1-2min后用5ml预冷pbs终止裂解；440xg离心5min，弃上清；5ml预冷pbs轻轻地 重悬细胞，用1ml预冷pbs润洗40μm细胞筛后过滤两次细胞；取一定量细胞计数；剩余 细胞440xg离心5min；
23.步骤二、lineage细胞阴性选择
24.对骨髓单细胞悬液计数，每2x 107的细胞用80μl的预冷pbs悬浮，每2x 107的细胞 添加20μ的direct lineage cell depletion cocktail磁珠；充分混匀，在4℃冰箱避光孵育 10min；避光孵育时，把masc磁力架放在生物安全柜中，mscs分选磁铁吸在masc磁力 架上，ls分选柱卡口朝外卡在mscs分选磁铁中；用3ml预冷的pbs润洗ls分选柱；将孵 育
lineage阴性磁珠的细胞加入到分选柱中，尽量避免气泡产生；收集未标记细胞的流出液； 用3ml的预冷pbs清洗柱子3次，收集清洗的流出液与未标记细胞的流出液混合，即代表 富集的lineage-negative细胞；
25.步骤三、cd117细胞阳性选择
26.取一定量富集得到的lineage-negative细胞进行计数，剩余的细胞300xg离心10min；每 107的lineage-negative细胞用80μl的预冷pbs重悬，每107的lineage-negative细胞加20μl 的cd117 microbeads，充分混匀，在4℃冰箱避光孵育15min；每107的lineage-negative细 胞加1-2ml的预冷pbs清洗孵育cd117磁珠的细胞，300xg离心10min；细胞离心期间，把 masc磁力架放在生物安全柜中，mscs分选磁铁吸在masc磁力架上，ls分选柱卡口朝外 卡在mscs分选磁铁中；用3ml预冷的pbs润洗ls分选柱；弃上清，每108孵育cd117磁 珠的细胞悬浮在500μl的预冷pbs加入到分选柱中；用3ml的预冷pbs清洗柱子3次；把 分选柱从分离器上取下来放在15ml离心管中，吸取5ml的预冷pbs放在分离柱中；用力将 柱塞推入分离柱，立即冲洗出来带有磁性标记的细胞即为cd117阳性细胞。此时收集到的 细胞即使lin-cd117+hsc，300xg离心5min弃上清，把细胞重悬在hsc细胞培养基中放在 37℃细胞培养箱中进行培养。
27.步骤四、共培养定向分化
28.op9与lin-cd117+hsc共培养是定向分化到b细胞，op9-dl1与lin-cd117+hsc共培养 是定向分化到t细胞。在准备分化前一天，取对数期生长的op9/op9-dl1细胞每3x104个细 胞种在12孔板中，待第二天贴壁每孔加入105个lin-cd117+hsc，培养基换成op9/op9-dl1 细胞共培养培养基；向b细胞分化培养12天，向t细胞分化培养12天和28天，在上述定 向分化的培养基中均加入甘草酸。
29.体外定向获得免疫细胞的应用极为广泛，包括但不限于肿瘤免疫过继疗法的免疫细胞 的制备和体内外扩增、cd8+t淋巴细的扩增，本发明提供的方法可以体外定向获得免疫细 胞，无论是在抗肿瘤细胞、免疫细胞的制备和应用中均具有较高的医用价值。
30.本发明的第四个方面，提供了甘草酸在制备用于调控肿瘤细胞中的s100a8蛋白的应用。
31.优选的，所述甘草酸为注射剂、口服剂。
32.优选的，所述肿瘤包括肺癌、宫颈癌、表皮癌、口腔鳞癌。
33.现有研究已经证明，s100a8在多种肿瘤细胞中高表达，并介导肿瘤细胞和迁移。柯少 瑞等的《钙结合蛋白s100a8和s100a9在肿瘤发生发展中的作用》中做了说明。本发明证明 了甘草酸可以特异性结合s100a8蛋白。因此，甘草酸可以有效降低肿瘤细胞中的s100a8 蛋白对肿瘤的生长和迁移的促进作用。
34.与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：
35.1、本发明首次发现甘草酸强大的促进免疫细胞生成的能力,可以在体外处理获得特定 类型的免疫细胞(cd8+t细胞和b细胞)，为肿瘤免疫过继疗法的免疫细胞的制备、cd8+t 淋巴细的扩增等提供了新方法。
36.2、本发明首次发现通过体内注射甘草酸，可以增加体内t细胞和b细胞的数量，为增 加基体的免疫力提供了新方法。
附图说明
37.为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简 单介绍。
38.显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通 技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图， 但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。
39.图1a为本发明实施例1的体外lin-cd117+hsc与op9-dl1共培养定向t细胞分化模型；
40.图1b为本发明实施例1的t细胞分化dn期发育过程；
41.图1c为本发明实施例1的体外定向t细胞分化dn期变化流式细胞术分析图；
42.图1d为本发明实施例1的流式结果统计柱状图(*p《0.05，**p《0.01；***p《0.001，ns 表示没有统计学差异)；
43.图2a为本发明实施例2的体外lin-cd117+hsc与op9-dl1共培养定向t细胞长期分化 模型；
44.图2b为本发明实施例2的体外定向t细胞分化流式细胞术分析图；
45.图2c为本发明实施例2的qpcr验证dn细胞的含量和流式结果统计柱状图(*p《0.05， **p《0.01；***p《0.001)；
46.图3a为本发明实施例3的甘草酸处理lin-cd117+hsc差异基因统计图；
47.图3b为本发明实施例3的甘草酸处理lin-cd117+hsc差异基因进行热图；
48.图3c为本发明实施例3的s100a8和s100a9的表达量qpcr验证统计图；
49.图3d为本发明实施例3的甘草酸处理lin-cd117+hsc差异基因kegg通路富集分析图；
50.图4a为本发明实施例4的metpro-ii代谢物甘草酸与pbmc蛋白互作质谱流程图；
51.图4b为本发明实施例4的样本的主成分分析图及差异表达蛋白以火山图；
52.图4c为本发明实施例4的质谱预结合差异表达蛋白热图分析；
53.图4d为本发明实施例4的预结合差异表达蛋白kegg通路富集分析图；
54.图5a为本发明实施例5的s100a8基因crispr-cas9的sgrna设计示意图；
55.图5b为本发明实施例5的mef细胞基因组验证引物pcr琼脂糖凝胶电泳图；
56.图5c为本发明实施例5的对5b中回收片段测序分析结果；
57.图5d为本发明实施例5的s100a8基因rna表达量统计图和蛋白表达图；
58.图6a为本发明实施例6的cb-dock运行对接结果vina打分；
59.图6b为本发明实施例6的autodock运算报告50个结果中部分对接结果亲和力打分；
60.图6c为本发明实施例6的pymol对模拟接结果可视化；
61.图7a为本发明实施例7的体外慢病毒包装的lin-cd117+hsc与op9-dl1共培养定向t 细胞分化模型；
62.图7b为本发明实施例7的体外t细胞分化dn期发育过程，dn期变化流式细胞术分析 图；
63.图7c为本发明实施例7的流式结果统计柱状图(*p《0.05；***p《0.001)；
64.图8a为本发明实施例8的体外慢病毒包装的lin-cd117+hsc与op9共培养定向b细胞 分化模型；
65.图8b为本发明实施例8的体外定向b细胞分化流式细胞术分析图；
66.图8c为本发明实施例8的流式结果统计柱状图(****p《0.0001)；
67.图9a为本发明实施例9的10x genomics单细胞测序从样本制备到测序实验流程图；
68.图9b为本发明实施例9的老年组(aged)细胞亚群聚类后细胞cluster与注释对应图；
69.图9c为本发明实施例9的ga处理组(aged+ga)细胞亚群聚类后细胞cluster与注释 对应图；
70.图9d为本发明实施例9的老年组(aged)和ga处理组(aged+ga)细胞亚群聚类后 细胞cluster对应图；
71.图9e为本发明实施例9的老年组(aged)和ga处理组(aged+ga)细胞亚群聚类分 类尺度堆积图；
72.图9f为本发明实施例9的第九号cluster(以cd8b1为标志基因的t细胞)的keggpathway。
具体实施方式
73.为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合 本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
74.显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
75.需要理解的是：
76.对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体 含义。
77.还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过 程可能在某些实施例中不再赘述。
78.下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
79.实施例1甘草酸体外促进t细胞分化dn期变化并抑制髓系分化
80.实验方法：
81.1.1、建立实验组和对照组，其中实验组(ga组)为在培养基中加入甘草酸，对照组为 培养基中加入dmso。
82.1.2、利用op9-dl1细胞共培养体系在体外建立定向t细胞分化模型，其流程如图1a 所示，将lin-cd117+hsc与op9-dl1分别在实验组(ga组)和对照组的培养基中培养；
83.1.2、培养12天后用流式细胞术分析t细胞和髓系细胞(cd11b+)的分化情况；其中， t细胞分化过程如图1b所示，在dn期经过cd44和cd25阴阳选择后继续分化成cd8+/cd4+t 细胞；基于现有技术的研究表明12天定向分化t细胞只有dn期发生变化(holmes,et al., 2009)，因此，本发明只分析dn期变化和髓系细胞(cd11b+)的分化情况。
84.实验结果：
85.结果如图1c-d所示，dn1期中，细胞比例ga组比对照组显著减少；dn2和dn3期中， 细胞比例ga组比对照组显著增加；dn4期中，ga组与对照组细胞比例没有差异，表明ga 驱动了lin-cd117+hsc在t细胞分化中的dn期变化。在没有添加髓系分化因子的情况下， 在此体系中也有髓系细胞(cd11b+)的产生，ga组的髓系细胞(cd11b+)比例显著减少， 表明ga抑制了髓系细胞(cd11b+)的产生。
86.综上所述，甘草酸能够促进lin-cd117+hsc向淋巴系方向分化，在定向分化的过程中在 不添加髓系分化因子的情况下，分化体系中有髓系细胞(cd11b+)的产生，ga能够抑制这 种髓系细胞(cd11b+)的产生。
87.实施例2甘草酸体外促进t细胞分化成cd8+t细胞
88.采用同实施例1类似的方法在体外建立长期定向t细胞分化模型。其实验步骤如图2a 所示，将lin-cd117+hsc与op9-dl1分别在实验组(ga组)和对照组的培养基中培养28天 后用流式细胞术分析t细胞和髓系细胞(cd11b+)的分化情况。
89.结果如图2b-c所示，dn1期ga与对照组无显著性差异；dn2期细胞比例对照组显著 多余ga组；dn3和dn4期细胞比例ga组显著多余对照组；dp期细胞比例对照组显著多 余ga组；分化至成熟的cd4+/cd8+t细胞时，ga组的cd8+t细胞显著增加；cd4+t细胞显 著减少。
90.实施例3甘草酸处理lin-cd117+hsc转录组分析
91.实验方法：
92.3.1、实验组用甘草酸(3.125um)处理lin-cd117
+
hsc，对照组的lin-cd117
+
hsc不 作处理；
93.3.2、24h后进行转录组测序分析实验组(ga组)和对照组的造血干细胞 (lin-cd117
+
hsc)内部基因的影响；
94.3.3、对步骤3.2获得的差异基因进行热图分析；
95.3.4、对步骤3.2获得的差异基因s100a8和s100a9进行qpcr验证：扩增实验组和对照 组的造血干细胞的s100a8和s100a9基因，并统计其表达量；
96.3.5、对步骤3.2获得的差异基因做kegg通路分析。
97.实验结果：
98.在细胞测序结果中如图3a所示，ga组和对照组之间有21个差异基因，其中有3个基 因上调表达，18个基因下调表达。
99.对差异基因进行热图分析结果如图3b所示，ga能够增加s100a8和s100a9的表达量；
100.对其进行表达量验证结果如图3c所示，qpcr验证结果与测序结果一致；
101.对差异基因做kegg通路分析结果如图3d所示，发现与s100a8基因与il-17信号通 路相关。
102.综上所述，可以推断甘草酸对免疫细胞的调节与甘草酸影响s100a8基因的表达具有相 关性。
103.实施例4甘草酸小分子与人外周血单核细胞(pbmc)蛋白互作
104.实施例1-3已证明了甘草酸对免疫细胞影响促进hsc向淋系分化并抑制髓系分化。甘 草酸为小分子化合物，小分子化合物通常是与蛋白结合发挥小分子药用作用，因此，测
定 甘草酸结合的靶蛋白是研究甘草酸作用机制的重要步骤。
105.实验方法：
106.4.1、准备与甘草酸(ga)进行metpro-ii代谢物与蛋白互作的pbmc蛋白；
107.4.2、按照图4a的方法进行小分子蛋白互作质谱，实验组为甘草酸与pbmc细胞蛋白提 取物，对照组为pbmc细胞蛋白提取物；
108.4.3、对质谱结果进行分析；
109.4.4、将步骤s4.3筛选的结合蛋白进行kegg通路分析。
110.实验结果：
111.对数据进行主成分分析结果如图4b所示，根据pca得分散点图显示，没有离散样本不 需要剔除分析。互作检测ga结合到的蛋白有300个，上调的蛋白有70个，下调的蛋白有 230个；对差异表达蛋白以火山图的形式可视化，红色是显著上调的蛋白，蓝色是显著下调 的蛋白，点在纵轴上越离散差异越显著；检测到的蛋白均为ga预结合蛋白，上调和下调根 据酶打断的多少评定，
112.将这些预结合蛋白进行热图分析，结果如图4c所示，发现结合蛋白中s100a8与甘草 酸处理后的hsc rna测序中的ga特异提高的基因一致，则选取s100a8作为ga的预选结 合蛋白。
113.将预结合蛋白进行kegg通路分析，结果如图4d所示，发现ga富集的通路大多集中 在代谢上。
114.综上所述，本实施例基本发现了s100a8蛋白应该是ga的靶蛋白，这与实施例3的结 论具有一致性。
115.实施例5crispr-cas9敲除s100a8
116.本实施例为利用crispr-cas9系统对s100a8基因构建敲除载体。
117.实验方法：
118.5.1、在s100a8基因的2号外显子上设计了两个相反向的sgrna，如图5a所示；
119.5.2、将重组基因连接在lenti crispr v2载体，包装成慢病毒感染进mef细胞中；
120.5.4、提取细胞基因组，用验证引物pcr敲除片段；
121.5.5、将pcr小片段回收送公司测序；
122.5.6、qpcr和western blot检测细胞(实验组ga：步骤5.1和5.2构建的细胞，对照组 ctrl：mef细胞)s100a8基因表达量和和蛋白表达量
123.实验结果：
124.pcr结果如图5b所示。
125.pcr小片段测序结果如图5c所示，在ngg后的位置处出现双峰说明敲除载体构建成功。
126.qpcr和western blot的结果如图5d所示，s100a8的基因表达量和蛋白表达量显著降 低，表明敲除载体lenti-s100a8构建成功且发挥了敲除作用。
127.实施例6cb-dock和autodock模拟甘草酸和s100a8结合
128.进一步分析ga与s100a8结合位点，本实施例采用cb-dock和autodock模拟软件来模 拟ga与s100a8结合。
129.实验方法：
130.6.1、运用swiss-model进行同源建模预测s100a8的蛋白结构，导出蛋白pdb格式的 蛋白结构。
131.6.2、cb-dock流行的对接程序autodock vina，在cb-dock中运行；
132.6.3、对接根据步骤6.2运行结果vina打分选取分数高的模拟结合结果，把模拟结果加 载进pymol中对结合结果可视化；
133.6.4、autodock在底物和目标蛋白的结合能中找到全局能量极小值，亲和力最强的结合 位点；
134.6.5、安装步骤6.4的报告顺序，根据结合亲和力排序，选取亲和力最高的一组结合结 果，模拟对接结果加载进pymol中对结合结果可视化。
135.实验结果
136.cb-dock中运行结果如图6a所示。
137.cb-dock中可视化出氢键结果如图6c(上图)所示，ga与s100a8结合的位点是y30、 n67、n25。
138.autodock运算可报告50个结果，如图6b所示。
139.autodoc可视化出氢键结果如图6c(下图)所示，ga与s100a8结合位点为k84和e69。
140.综上所述，cb-dock中，ga与s100a8结合的位点是y30、n67、n25；而在autodoc中，ga与s100a8结合位点为k84和e69。
141.实施例7甘草酸结合s100a8定向t细胞分化
142.7.1、利用293t细胞将lv201(载体对照)和oea8(lv201-s100a8实验载体)载体包装 成慢病毒感染进lin-cd117+hsc中，将感染病毒的lin-cd117+hsc与op9-dl1细胞共培养定 向t细胞分化，并且在部分实验组的培养基中加入ga，共设立4组，分别为对照组：lv201 组(插入lv201载体)，lv201+ga组(插入lv201载体，培养时加入ga)，oea8组(插 入oea8载体)，oea8+ga组(插入oea8载体，培养时加入ga)；
143.7.2、感染病毒的lin-cd117+hsc细胞状态共培养定向分化6天，分化流程如图7a所示；
144.7.3、用流式细胞仪分析t细胞(cd44、cd25)和髓系细胞(cd11b+)分化情况。
145.结果如图7b-c所示，t细胞dn期变化，ga组与lv201组相比没有显著性差异，oea8 组和oea8+ga组在一定程度上促进了dn期的变化。在没有添加髓系分化因子的情况下， 在此体系中也有髓系细胞(cd11b+)的产生，lv201组与lv201+ga之间有抑制趋势但没有 显著性差异，oea8组与lv201组相比，过表达s100a8在一定程度上抑制了髓系细胞(cd11b+) 分化；oea8组与oea8+ga相比，ga在过表达s100a8的程度上没有进一步抑制髓系细胞 (cd11b+)分化。
146.实施例8甘草酸结合s100a8定向b细胞分化
147.8.1、利用293t细胞将lv201(载体对照)和oea8载体包装成慢病毒感染进lin-cd117+hsc 中，将感染病毒的lin-cd117+hsc与op9细胞共培养定向b细胞分化，实验分组设置同实 施例7；
148.8.2、介于感染病毒的lin-cd117+hsc细胞状态共培养定向分化6天，分化流程如图8a 所示；
149.8.3、用流式细胞仪分析b细胞(cd45r/b220+)和髓系细胞(cd11b+)分化情况。
150.结果如图8b-c所示，lv201+ga组、oea8组和oea8+ga组有少量的b细胞 (cd45r/b220+)产生；lv201+ga组与lv201组相比，ga促进了b细胞的分化，此结果与 之前正常lin-cd117+hsc与op9细胞共培养定向b细胞分化结果一致；oea8组与lv201组 相比，过表达s100a8在一定程度上促进了b细胞的分化；oea8组与oea8+ga相比，ga在 过表达s100a8的程度上没有进一步促进b细胞分化。在没有添加髓系分化因子的情况下， 在此体系中也有髓系细胞(cd11b+)的产生，lv201+ga组与lv201组相比，ga抑制了髓 系细胞(cd11b+)的产生，与之前正常lin-cd117+hsc与op9细胞共培养定向b细胞分化 结果中ga抑制髓系细胞(cd11b+)产生的结果一致。oea8组与lv201组相比，过表达s100a8 在一定程度上抑制了髓系细胞(cd11b+)分化；oea8组与oea8+ga相比，ga在过表达s100a8 的程度上没有进一步抑制髓系细胞(cd11b+)分化。
151.实施例9体内甘草酸处理小鼠pbmc单细胞测序分析
152.实验方法：
153.9.1、分离老年对照组(aged，12月龄)和甘草酸处理组(aged+ga)，处理30天小鼠 的pbmc制备单个核细胞悬液，进行单细胞测序，实验流程如图9a所示；
154.9.2、10x genomics单细胞测序要求细胞数量大于104个细胞且细胞活率大于80％，测 定细胞活率达到上机要求，进行单细胞测序；
155.9.3、对收集的样本细胞基因依照graph-based聚类算法进行聚类分类，算法认为同一个 cluster内的细胞表达模式最接近。
156.实验结果：
157.聚类分类如图9b-9f所示，对老年对照组(aged)pbmc和甘草酸处理组(aged+ga) 小鼠的pbmc进行单细胞聚类分析其中免疫细胞的变化，经过ga处理后，增加了巨核细胞 (pf4为marker基因的巨核细胞)、b细胞(slfn、zbtb20、cd74为marker基因的b细胞)、 t细胞(ccl5、cd8b1、igfbp4为marker基因的t细胞)和nk细胞(gzma为marker基因的 nk细胞)；减少了巨噬细胞(lyz2、gngt2为marker基因的巨噬细胞)、刷细胞(ccl4、 cst3、ii1b为marker基因的刷细胞)、红细胞(hbb-bt为marker基因的红细胞)、杯状细 胞(igha为marker基因的杯状细胞)、中性粒细胞(ngp为marker基因的中性粒细胞)。
158.综上所述，ga能够减少由衰老引起的巨噬细胞和中性粒细胞增多，增加由衰老减少的 t、b细胞的数量。
159.在上述说明书的描述过程中：
160.术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如
……
所示”、“进一步的”、“进一步 改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在 任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提 下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或 示例的特征进行结合或组合。
161.最后应说明的是：
162.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
163.尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当
理解， 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特 征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例 技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换， 均属本发明所要求保护的范围。