特异性结合非洲猪瘟病毒P30蛋白的抗体及应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗体及应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus,asfv)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病，临床上以高热、皮肤发绀、淋巴结及脏器广泛出血为主要特征，病程短，病死率可高达100％。临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。该病在我国被列为一类动物疫病，属于世界动物卫生组织(oie)的法定报告的动物疫病。

2、asfv是非洲猪瘟相关病毒科(asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(asfivirus)的唯一成员，也是唯一已知的dna虫媒病毒。asfv是一种大而复杂的二十面体、有双层囊膜的双股线状dna病毒(170～194kb)，病毒粒子直径约为260nm，含有151～167个开放阅读框，至少编码160多种蛋白质。asfv主要感染巨噬细胞，通过内吞和巨饱饮等作用完成病毒入侵，其dna复制、病毒组装和释放均在巨噬细胞中进行。

3、p30蛋白是asfv主要的结构蛋白之一，位于病毒颗粒的内膜。p30蛋白由开放阅读框cp204l编码，是一种磷酸化的蛋白，参与病毒内化，在病毒进入宿主细胞的过程中起重要作用；p30蛋白具有较好的抗原性，且在病毒感染早期大量出现，能够诱导机体产生中和抗体。由此可见，基于p30蛋白的研究意义重大。然而，作为asfv主要结构蛋白和重要抗原蛋白，p30分子结构仍未被解析。

4、因此，其单克隆抗体的制备，可为asfv检测及其p30蛋白的结构解析提供重要工具。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗体或抗原结合片段，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

2、本发明的目的之二在于提供与上述抗体或抗原结合片段相关的生物材料。

3、本发明的目的之三在于提供上述抗体或抗原结合片段的应用。

4、本发明的目的之四在于提供一种非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒。

5、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

6、一种特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为seq.id no.1所示的氨基酸序列；所述轻链可变区为seq.id no.2所示的氨基酸序列。

7、抗体的重链和轻链中，其n端均含有氨基酸组成和排列变化很大的可变区，其中，含有能与抗原表位互补结合的抗原结合部位，其决定着抗体与相应抗原表位结合的特异性，负责识别及结合抗原，从而发挥免疫效应。本发明中的抗体含有氨基酸序列如seq idno.1所示的重链可变区和氨基酸序列如seq id no.2所示的轻链可变区，其可以特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白，抗体阻断率＞90％。

8、进一步地，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。

9、进一步地，所述抗体为单克隆抗体4c12或单链抗体4c12。本发明筛选的得到的单克隆抗体4c12，重链亚类为igg1，轻链亚类为kappa。

10、本发明中的抗体或抗原结合片段可以为人工合成，也可先合成其编码基因，再利用生物表达得到。例如利用与上述抗体相关的生物材料进行生物表达得到抗体或抗原结合片段，优选地，与上述抗体或抗原结合片段相关的生物材料为如下任一种：

11、(a)核酸分子，含有编码所述抗体或抗原结合片段的可变区的序列；

12、(b)表达盒，含有(a)中核酸分子；

13、(c)重组载体，含有(a)中核酸分子或(b)中表达盒；

14、(d)重组真核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体；

15、(e)重组原核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体。

16、“核酸分子”可以是dna，如cdna或重组dna，也可以是rna，如mrna或hnrna等。

17、“表达盒”包含多核苷酸序列，多核苷酸序列编码待表达的多肽(抗体)和控制其表达的序列如启动子、信号肽序列以及任选地增强子序列，包括顺式作用转录性控制单元的任何组合。控制基因表达(即其转录和转录产物翻译)的序列常称作调节单元。调节单元的大多数部分位于基因的编码序列上游并与之有效连接。表达盒也可以含有包含多聚腺苷化位点的下游3'非翻译区。

18、“重组载体”的载体骨架可以为质粒、噬菌体或病毒。

19、“重组真核细胞”的宿主细胞可以为酵母或哺乳动物细胞等。

20、“重组原核细胞”的宿主细胞可以为细菌或藻等。

21、进一步地，编码抗体或抗原结合片段的重链可变区的核酸序列如seq.id no.3所示，编码抗体或抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列如seq.id no.4所示。

22、优选地，所述重组真核细胞为杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞生产所述抗体或抗原结合片段。

23、上述抗体或抗原结合片段或生物材料在制备检测非洲猪瘟病毒产品中的应用。

24、一种非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有蛋白p30的支持介质、酶标试剂和检测试剂；所述酶标试剂为酶标的上述抗体或抗原结合片段。

25、进一步地，所述酶标试剂为酶标的单克隆抗体4c12。

26、进一步地，蛋白p30的包被浓度为0.2-0.3μg/ml，优选为0.25μg/ml；支持介质优选为微量滴定板；酶标的酶优选可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-d-半乳糖甘酶。需要说明的是，蛋白p30的包被浓度可以但不限于为0.21μg/ml、0.22μg/ml、0.23μg/ml、0.24μg/ml、0.25μg/ml、0.26μg/ml、0.27μg/ml、0.28μg/ml、0.29μg/ml或0.3μg/ml。

27、进一步地，检测试剂包括显色液和终止液；显色液包括显色液a和显色液b，所述显色液a包含1.47％w/v磷酸氢二钠、0.93％w/v柠檬酸和0.03％w/v过氧化脲，所述显色液b包含0.02％w/v四甲基联苯二胺和10％v/v无水乙醇；终止液优选为2m h2so4溶液；

28、优选地，试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、洗涤液和样品稀释液中的至少一种；阳性对照优选为蛋白p30免疫猪只的阳性血清；阴性对照优选为非洲猪瘟病毒抗原抗体均为阴性的血清；洗涤液优选为磷酸盐缓冲液；样品稀释液优选为含有20％v/v新生牛血清和0.1％v/v proclin300的pbs溶液。

29、与现有技术相比，本发明的技术效果为：

30、本发明提供的抗体或抗原结合片段，识别的抗原表位位于非洲猪瘟病毒p30蛋白，对非洲猪瘟病毒p30的抗体阻断率90％以上，与非洲猪瘟病毒反应呈阳性，可高效价地用于多个组织的免疫组化检测，表明其与非洲猪瘟病毒具有良好的反应特性。该抗体可为asfv检测及其p30蛋白的结构解析提供重要工具。