本发明涉及生物基化学品的生物制造和生物炼制领域，涉及一种连续发酵生产l-乳酸的方法。
背景技术：
1、纤维素乳酸的生产极大地降低了乳酸的成本，在保护环境方面也起到了一定的作用。目前，纤维素乳酸的生产大多通过批次发酵的方式进行，然而这种发酵工艺有着发酵时间长、产率低等诸多缺点。与批次发酵相比，连续发酵操作可以通过减少生物反应器清空、清洁、消毒和重新填充的频率来实现更高的生产效率。乳酸或乙醇等大宗发酵产品的生产只有在连续生产模式下才能在经济和工业上可行。
2、江苏迪因生物科技有限公司公开了一种利用木质纤维素发酵生产l-乳酸的方法(cn 106834368 a)，但是发酵过程属于耗氧发酵，耗费了大量的能源，获取的乳酸浓度较低以及采用分批发酵的方式较连续发酵增多了发酵的准备工作，增加了生产成本。
3、上海汉禾生物新材料科技有限公司和安徽丰原发酵技术工程研究有限公司公布了通过利用木质纤维素(cn 112662710 a)和农业废弃物水解液进行(cn 102174600 a)连续发酵生产乳酸的方法，发酵的固含量较小，导致了生成乳酸浓度低，同时采取较低的稀释度，导致发酵周期过长，产乳酸的效率低，不适用于真实条件下纤维素乳酸的工业化生产。综上可知，现有技术中连续发酵工艺中仍存在许多不足之处。
技术实现思路
1、鉴于改善现有技术中l-乳酸连续发酵工艺存在的上述问题，本发明提供一种以木质纤维素原料为底物连续发酵生产纤维素乳酸的方法，本发明方法在保证获得高浓度、高纯度的乳酸前提下，相比于批次发酵，增加乳酸生产的效率，为今后的纤维素乳酸生产提供重要的技术支持。
2、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
3、一种连续发酵生产l-乳酸的方法，所述方法包括：
4、将木质纤维素原料采用纤维素酶进行预糖化处理后，继续进行糖化和发酵，当发酵体系中葡萄糖浓度下降至5-25g/l时，取出部分发酵液，并向其中补充物料，重复上述过程，当体系中发酵液的乳酸浓度达到最大并不发生明显变化时形成发酵稳态，得到稳态下的l-乳酸。
5、于一实施方式中，所述木质纤维素原料来自于农业废弃物，所述农业废弃物选自玉米秸秆、小麦秸秆、棉花杆、芝麻杆、油菜杆、甜高粱茎秆、玉米芯、稻壳、谷壳、甘蔗渣、稻草、木屑、硬木和软木中的一种或多种。
6、于一实施方式中，所述木质纤维素原料经过预处理。本领域技术人员常规知晓，预处理的目的主要是改变天然木质纤维素固有的致密结构，破坏纤维素、木质素和半纤维素之间的化学和物理连接，降低纤维素的结晶度，或脱去木质素，增加原料的疏松性以增加纤维素酶系与纤维素的有效接触，便于后续糖化和发酵的进行。本发明对预处理的方式不作特别限定。只要能实现上述效果即可。所述预处理可以包括：稀酸预处理，蒸汽爆破预处理，氨纤维爆破预处理，碱预处理和离子液体预处理中的至少一种。优选地，所述预处理方式为干法稀酸预处理。示例性地，所述稀酸为硫酸，还示例性地，将木质纤维素原料采用稀酸进行处理。本发明中，稀酸对木质纤维素原料进行处理采用本领域的常规技术。
7、于一实施方式中，所述木质纤维素原料经过脱毒处理。本领域技术人员公知的，预处理过程不可避免地产生一系列抑制后续纤维素酶活性、发酵微生物的细胞生长和代谢活性的抑制物。常常对预处理后的物料进行脱毒处理以脱除这些抑制物。本发明对脱毒处理的方式不作特别限定，例如包括水洗、石灰处理、离子交换吸附、活性炭吸附和利用微生物脱毒(简称生物脱毒)等。本发明中，所述脱毒处理为生物脱毒处理，所述脱毒处理采用本领域的常规技术，例如可以参照cn112941117a公开的脱毒工艺。
8、于一实施方式中，预处理、脱毒后的木质纤维素原料的含水量为40-60wt％。
9、根据本发明，所述木质纤维素原料在进行预处理前，还可以对其进行粉碎除尘处理。
10、于一实施方式中，所述木质纤维素原料的固含量为10-35％，进一步为20-30％。本发明所述木质纤维素原料的固含量指的是发酵底物(经预处理、脱毒后木质纤维素原料)的干重为发酵液的10-35％，优选20-30％，％表示质量百分比。
11、于一实施方式中，所述的纤维素酶采用本领域可水解木质纤维素的酶蛋白或酶蛋白混合物，例如可采用市售商品纤维素酶cellic ctec 2.0，购自北京诺维信(中国)。
12、于一实施方式中，所述纤维素酶的用量为1-10mg蛋白/g木质纤维素原料，优选为2-6mg蛋白/g木质纤维素原料。本发明中，木质纤维素原料指的是经预处理、脱毒后的木质纤维素原料干重。
13、于一实施方式中，预糖化处理的温度为42-45℃。
14、于一实施方式中，预糖化处理的时间为4-48h，优选为8-20h。
15、于一实施方式中，所述发酵过程中控制温度为42-50℃，进一步为42-45℃。
16、于一实施方式中，控制发酵过程的ph为4-6，进一步为4.8-5.5。
17、根据本发明，可以加入碱性化合物，控制发酵体系的ph值；所述碱性化合物选自ca(oh)2、naoh、koh、caco3等中的一种或几种。优选的，碱性化合物为ca(oh)2。对碱性化合物的浓度不作特别限定，以控制发酵体系的ph在上文所述范围内即可。
18、于一实施方式中，本发明对发酵生产l-乳酸的发酵菌株没有特别的限定，只要耐高温、且能发酵生产l-乳酸即可，例如可以为耐高温的乳酸菌，优选为耐高温的乳酸片球菌。
19、本发明中，在进行发酵前，对发酵菌株进行成熟种子液的培养，所述发酵菌株的培养方法如下：
20、一、活化培养：将保藏在冻存管中的菌株甘油种接种于液体mrs培养基，培养温度为40-50℃，转速为100-300rpm，时间为10-18h；
21、二、种子培养：将步骤一中活化后的菌株按5-25％(v/v)的接种量转移至新的液体mrs培养基，培养温度为40-50℃，转速为100-300rpm，时间为6-12h。
22、本发明中，对所述液体mrs培养基没有特别的限定，可以采用本领域常规的培养基，例如所述液体mrs培养基可以包括20g/l一水葡萄糖、10g/l蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/l无水乙酸钠、2g/l柠檬酸氢二铵、2g/l磷酸氢二钾、0.58g/l七水硫酸镁和0.25g/l一水硫酸锰。
23、于一实施方式中，用于发酵生产l-乳酸的发酵菌株的接种量为5-25％(v/v)。
24、于一实施方式中，用于发酵生产l-乳酸的营养盐包括蛋白胨5-20g/l、酵母提取物5-20g/l、柠檬酸氢二铵1-5g/l和一水硫酸锰0.1-0.5g/l。
25、根据本发明，继续进行糖化和发酵为同时进行同步糖化与共发酵的过程。
26、于一实施方式中，当发酵体系中葡萄糖浓度下降至10-20g/l时，例如15g/l或20g/l时，开始进行取补料操作。
27、于一实施方式中，控制发酵过程中的稀释率为0.008-0.03h-1，进一步为0.015-0.025h-1，例如发酵过程中的稀释率可以为0.005h-1、0.008h-1、0.01h-1、0.012h-1、0.015h-1、0.016h-1、0.017h-1、0.018h-1、0.019h-1、0.02h-1、0.021h-1、0.022h-1、0.023h-1、0.024h-1、0.025h-1、0.026h-1、0.027h-1、0.028h-1、0.03h-1、0.035h-1、0.04h-1或者由上述任意两个数值所组成的范围均属于本发明所保护的范围。
28、根据本发明，稀释率为x与y的比值，其中，x为每次取出发酵液占总发酵液的质量比；y为每完成一次取补料操作的时间间隔。
29、根据本发明，对x和y没有特别的限定，只要两者的比值满足上述限定范围即可。本发明通过优化稀释率能够在保证乳酸产量没有明显降低的前提下，进一步提高乳酸产率。
30、于一优选实施方式中，取出的发酵液质量为总发酵液的10-35％(w/w)，进一步为15-30％(w/w)，更进一步为25-30％(w/w)，例如可以为10％、15％、20％、25％、30％或35％等。
31、于一实施方式中，所述补充物料包括木质纤维素原料、无菌水、纤维素酶和营养盐。所述补充物料的添加方式为分批加入。本发明通过补充物料使体系中的成分更混杂，在如此混杂的体系中发酵生产乳酸技术难度更大。
32、根据本发明，取出部分发酵液和补充物料的具体过程为：先用真空泵抽取部分发酵液，再以相同质量比例向反应器中补加预处理脱毒后木质纤维素固体物料、无菌水、纤维素酶和营养盐，保持发酵体系的质量恒定。
33、根据本发明，以取出部分发酵液和补充物料为一个循环。
34、于一实施方式中，在同一个循环中，补充物料与取出的发酵液质量相同。本发明补充物料中的木质纤维素原料、无菌水、纤维素酶和营养盐的含量与取出的初始发酵液相同，也即补充物料与取出的发酵液本质上相同。
35、根据本发明，所述发酵稳态的判定标准为每次从反应器中取出发酵液前乳酸的浓度达到最大值，并能稳定该数值三次及以上。
36、本发明具有如下有益效果：
37、(1)本发明连续发酵方法避免了常规分批发酵前后反应器的清空、灭菌、清洗和填充的过程，提高了生产效率。
38、(2)本发明以木质纤维素为底物进行乳酸连续发酵，在保证发酵液乳酸浓度达到了工业乳酸生产的最低要求的情况下，进一步提高了乳酸产率，更适合于真实条件下的大规模生产应用；且获得乳酸的手性度达到99.5％以上。