IRT1基因及其在提高植物耐缺铁能力中的应用

irt1基因及其在提高植物耐缺铁能力中的应用
技术领域
1.本发明属于分子育种技术领域，尤其涉及irt1基因及其在提高植物耐缺铁能力中的应用。


背景技术：

2.中国是柑橘的重要原产地之一，栽培面积及生产产量均居世界首位，有4000多年的栽培历史，资源丰富，优良品种繁多。
3.在四川、重庆等柑橘产区，较多果园以紫色土为主，土壤ph值偏高，呈碱性或弱碱性，柑橘树体易出现缺铁黄化现象，极大影响了柑橘的产量和品质。生产上，柑橘树体一般由砧木和接穗组成，通过砧木直接从土壤吸收水分和营养，不同的砧木对柑橘树体的生长发育影响不同，也决定了树体耐缺铁能力。枳作为柑橘栽培中大面积使用的砧木，具有抗寒、抗旱、品质优的特点，但在碱性土壤上极易缺铁；资阳香橙作为近年大量推广的砧木，具有生长势强和耐缺铁的优点，但不耐寒且果实品质差于枳，在生产中无法大面积取代枳砧。
4.植物铁缺乏治理难度大，解决植物的缺铁情况，现阶段主要的方法是施用铁肥增加土壤中的铁含量，但由于铁肥易氧化，有效性低，在植物中流动性差，施用铁肥效果并不显著。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供irt1基因在提高植物耐缺铁能力中的应用，以解决上述技术问题。
6.本发明提供的技术方案为：irt1基因，irt1基因来源于资阳香橙和/或枳，资阳香橙irt1基因编码蛋白的氨基酸序列为seq id no:2，枳irt1基因编码蛋白的氨基酸序列为seq id no:4。
7.本发明还提供上述irt1基因在提高植物耐缺铁能力中的应用，所述植物为拟南芥和/或柑橘。
8.本技术方案的原理和有益效果在于：
9.施用铁肥对于提高植物耐缺铁的效果并不显著，采用分子育种技术，利用不同柑橘砧木对缺铁耐受性的差异较大，将能提高砧木耐缺铁能力的重要基因导入其中，提高砧木的缺铁耐受性，才能从根本上解决植物缺铁的问题，改善柑橘苗木的缺铁耐受能力。
10.团队于2019年发表的《枳和资阳橙铁转运基因irt1及其启动子的克隆和功能比较研究》论文以枳(不耐缺fe)和资阳香橙(耐缺fe)为材料，克隆了枳和资阳香橙中irt1基因和转录因子fit序列，实验中，枳的基因命名为ptirt1和ptfit，资阳香橙的基因命名为cjirt1和cjfit，研究枳和资阳香橙irt1基因及启动子序列和功能差异。
11.本发明在之前研究的基础上，进一步发现并验证了irt1基因能够提高植物的耐缺铁，证明将资阳香橙和枳中的cjirt1、ptirt1表达量提高，可以有效提升柑橘对缺铁环境的耐受能力，可为柑橘育种提供基因资源和技术支持，为柑橘育种提供基因资源和技术支持。
附图说明
12.图1为资阳香橙与枳耐缺铁表型比较；a.资阳香橙正常培养(ck)及缺铁胁迫下水培苗表型(-fe-pt-16d)；b.枳正常培养(ck)及缺铁胁迫下水培苗表型(-fe-cj-16d)；c.正常培养及缺铁胁迫处理后资阳香橙与枳新叶叶绿素a(chla)、叶绿素b(chlb)、总叶绿素(chla+b)含量；d.正常培养及缺铁胁迫处理后资阳香橙与枳总铁(ferric)及活性铁(ferrous)含量；
13.图2为cjirt1与ptirt1基因缺铁胁迫下的表达；a.cjirt1基因缺铁胁迫下的表达；b.ptirt1基因缺铁胁迫下的表达；
14.图3为cjirt1与ptirt1蛋白亚细胞定位情况；
15.图4为cjirt1、ptirt1超量拟南芥转基因株系验证及缺铁胁迫分析；a.转基因株系pcr验证，oe-cjirt1的6个电泳孔位分别代表oe-cjirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-5-1、oe-cjirt1-5-2、oe-cjirt1-7-1、oe-cjirt1-7-2，oe-ptirt1的6个电泳孔位分别代表oe-ptirt1-3-1、oe-ptirt1-4-1、oe-ptirt1-4-2、oe-ptirt1-5-1、oe-ptirt1-7-1、oe-ptirt1-7-2；b.阳性转基因株系表达量分析；c.缺铁胁迫下转基因株系表型情况；d.缺铁胁迫下转基因株系主根根长分析，****表示p《0.0001。
具体实施方式
16.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
17.实验一：资阳香橙与枳耐缺铁表型比较，探究资阳香橙、枳两大砧木耐缺铁能力的差异
18.试验材料：枳和资阳香橙种子、霍格兰营养液(购于北京酷来博(coolaber)科技有限公司，货号nsp1020-50l
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10)、缺铁霍格兰营养液(购于北京酷来博(coolaber)科技有限公司，货号为ns1010-fe-500ml)。
19.试验方法：将生根1cm左右的柑橘种子移至含有霍格兰营养液的容器中培养，待长至3-4张叶片后转移至缺铁霍格兰营养液中进行胁迫处理。
20.图1为资阳香橙与枳耐缺铁表型比较；a.资阳香橙正常培养(ck)及缺铁胁迫下水培苗表型(-fe-pt-16d)；b.枳正常培养(ck)及缺铁胁迫下水培苗表型(-fe-cj-16d)；c.正常培养及缺铁胁迫处理后资阳香橙与枳新叶叶绿素a(chla)、叶绿素b(chlb)、总叶绿素(chla+b)含量；d.正常培养及缺铁胁迫处理后资阳香橙与枳总铁(ferric)及活性铁(ferrous)含量，ck-r(ck-root)：对照的根；ck-l(ck-leaf)：对照的叶；ck-s(ck-stem)：对照的茎；fe-r：缺铁处理的根：fe-：缺铁处理的叶：fe-s：缺铁处理的茎。
21.如图1a、图1b所示，柑橘缺铁时新梢叶片呈现失绿黄白化，资阳香橙与枳水培苗在缺铁营养液培养16天后，资阳香橙嫩叶呈现正常翠绿色，但枳新梢叶片失绿发黄、脉纹清晰可见缺铁表型明显。
22.对资阳香橙和枳正常、缺铁培养状态下的新梢叶片叶绿素、总铁、活性铁含量进行测定。如图1c显示，正常培养的枳新叶chla的含量为3.48mg/g，chlb的含量为1.22mg/g，总含量达到4.70mg/g。与此同时出现明显缺铁表型的枳新叶chla的含量为2.09ng/mg，chlb的含量为0.82mg/g，因此叶绿素总含量显著低于正常培养枳，仅含2.90mg/g；而资阳香橙正常及缺铁培养下的新叶chlb含量几乎没有差异，chla含量缺铁胁迫下仅比正常培养下低
0.2mg/g，因此资阳香橙在缺铁胁迫下新叶中仍有较高的叶绿素含量。
23.测定资阳香橙与枳根、茎、叶三部位的活性铁、总铁含量，如图1d所示，枳根、茎、叶的活性铁含量在缺铁胁迫培养下分别从101.40mg/kg、49.88kg/g、43.50mg/kg显著降低至87.58mg/kg、29.43mg/kg、28.09mg/kg。资阳香橙根、茎部的活性铁含量虽然分别从86.81mg/kg、59.29mg/kg下降至53.40mg/kg、35.64mg/kg，但叶中的活性铁含量相较于正常培养的植株活性铁含量上未观察到明显变化；观察总铁含量的变化，枳在缺铁条件下根、茎、叶的总铁含量相较于正常培养的植株发生了显著下降，而对于资阳香橙，仅根部总铁含量存在明显下降，茎、叶部分的总铁含量无明显变化。
24.综上，通过资阳香橙与枳耐缺铁表型比较，证明了当资阳香橙、枳遭受缺铁胁迫时，资阳香橙比枳表现出更强的耐缺铁能力。
25.实验二：资阳香橙与枳irt1基因的功能比较
26.1、cjirt1、ptirt1的表达模式分析
27.对资阳香橙、枳水培苗进行缺铁处理，具体地，将枳和资阳香橙种子剥去种皮，进行暗培养，待种子生根1cm左右时，移至含有霍格兰营养液的水培容器中培养，待幼苗长至3-4张叶片后转移至缺铁霍格兰营养液中进行胁迫处理。在处理后的0d、1d、3d、5d、8d进行根部取样，检测irt1基因的表达量，以0d样品为实验对照。实验结果如图2所示，缺铁处理后cjirt1基因的表达量相较于ptirt1上调幅度更大约为2倍，表明irt1基因在资阳香橙根系中更易受到缺铁胁迫诱导。
28.2、cjirt1、ptirt1的亚细胞定位
29.为了检测cjirt1、ptirt1蛋白的作用功能位置，将cjirt1蛋白序列(seq id no:2)、ptirt1蛋白序列(seq id no:4)放入plant-mploc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/plantmploc.cgi)在线预测网站中，根据网站预测结果显示cjirt1、ptirt1均定位于细胞膜。
30.亚细胞定位载体构建：
31.(1)利用gateway体系进行亚细胞定位载体构建。通过ncbi在线工具batch cd-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)预测cjirt1、ptirt1、cjfit及ptfit基因保守结构域位置，根据其位置选择pmdc83-rfp(kana+)为终载体，入门载体则选用gateway系统中的pdonr207(gen+)；
32.(2)根据基因的orf(去除终止密码子)在其两侧设计带有attb序列引物分别扩增得attb-cjirt1、attb-ptirt1目标片段用于gateway中的bp反应。bp反应参照gateway bp clonase tmⅱenzyme mix(11789-020，invitrogen)，所得反应液用于大肠杆菌dh5α转化；
33.(3)挑取bp反应的阳性菌落进行质粒提取得到pdonr207克隆产物用于gateway中的lr反应，lr反应参照gateway lr clonase tmⅱenzyme mix(11791-020，invitrogen)，所得反应液用于大肠杆菌dh5α转化；
34.(4)利用attb-f及attb-r通用引物进行阳性克隆测序，选择正确的重组质粒pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp用于农杆菌gv3101转化。
35.采用混合转注射野生本氏烟草的方法：挑取pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp阳性农杆菌单菌落进行培养。获得饱和菌液4000rmp离心10min，用烟草重悬液(终浓度为10mmol l-1的mgcl2和138μmol
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l-1as的无菌水)重悬农杆菌至od 600为0.2。
36.根据亚细胞定位在线工具(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)预测结果选取细胞核marker h2b-gfp与细胞膜marker，其菌液培养方式与上述方法一致，将调好的目的基因菌液与marker菌液2:1配比，室温静置2h。将菌液注射接种4-6周左右的野生本氏烟草，暗培养48h后使用打孔器进行取样(取样范围在注射点附近为宜)，随后放置于激光共聚焦显微镜fv300下观察488nm(gfp)与561nm(rfp)荧光蛋白的亚细胞定位情况。
37.将构建的重组质粒pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp与mc-gfp marker共转化。实验结果如图3所示，通过观察荧光共聚焦，pmdc83-cjirt1-rfp、pmdc83-ptirt1-rfp的红色荧光与mc-gfp的绿色荧光重合呈现黄色，表明在烟草中cjirt1、ptirt1融合蛋白与细胞膜marker蛋白共定位表达，说明cjirt1与ptirt1蛋白的功能作用位置为细胞膜。
38.3、cjirt1、ptirt1超量拟南芥植株耐缺铁分析
39.比较资阳香橙cjirt1与枳ptirt1在缺铁胁迫下的功能，具体在拟南芥野生型中分别超表达cjirt1、ptirt1并对纯合的转基因株系进行验证及缺铁处理。具体试验方法：将而野生型(wt)拟南芥及超量拟南芥株系置于正常的1/2ms固体培养基中生长5天至拟南芥发根发芽时，选择生长发育一致的幼苗，将其转移至-fe的1/2ms固体培养基(北京酷来博(coolaber)科技有限公司，货号：pm1010-fe-250g)，在正常的光照条件下培养一段时间。
40.结果表明，在铁缺乏培养基上培养10天后，wt拟南芥株系的生长与发育受到明显的抑制，大部分wt的叶片出现了黄化现象而转基因拟南芥株系叶盘翠绿、生长状态良好。
41.使用irt1的全长扩增引物(seq id no:5和seq id no:6)对wt、cjirt1的4个超量转基因株系、ptirt1的3个超量转基因株系进行了pcr验证并进行了株系内的生物学重复。
42.f(seq id no:5)：atggacacttcacttgtca；
43.r(seq id no:6)：ttaagcccatttagccataagg。
44.实验结果如图4所示，图4为cjirt1、ptirt1超量拟南芥转基因株系验证及缺铁胁迫分析；a.转基因株系pcr验证，oe-cjirt1的6个电泳孔位分别代表oe-cjirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-5-1、oe-cjirt1-5-2、oe-cjirt1-7-1、oe-cjirt1-7-2，oe-ptirt1的6个电泳孔位分别代表oe-ptirt1-3-1、oe-ptirt1-4-1、oe-ptirt1-4-2、oe-ptirt1-5-1、oe-ptirt1-7-1、oe-ptirt1-7-2；b.阳性转基因株系表达量分析；c.缺铁胁迫下转基因株系表型情况；d.缺铁胁迫下转基因株系主根根长分析，****表示p《0.0001。
45.实验结果如图4a所示，7个转基因株系均扩增出了预期1000bp左右的基因片段，而野生型拟南芥wt没有扩增出对应条带，表明所检测的转基因株系均为阳性植株。
46.为了对转基因株系进行进一步分析，分别在cjirt、ptirt1中选取2个阳性转基因株系(oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-7-2、oe-ptirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2)进行表达量检测，结果显示四个株系均在拟南芥中具有上万倍表达量，但在野生拟南芥中尚未检测到irt1基因的表达，再次证明cjirt1、ptirt1在野生拟南芥中超量成功(图4b)。
47.对选取的超量拟南芥株系oe-cjirt1-4-2、oe-cjirt1-7-2、oe-ptirt1-4-1、oe-cjirt1-4-2进行缺铁处理，将wt及超量拟南芥株系置于正常的1/2ms固体培养基中生长5天至拟南芥发根发芽时，选择生长发育一致的幼苗，将其转移至-fe的1/2ms固体培养基，在正常的光照条件下培养7至10天。如图4c实验结果表明，在铁缺乏培养基上培养7天后，相对于oe-cjirt1与oe-ptirt1转基因拟南芥株系，野生型拟南芥株系的生长与发育均受到抑制的
同时，部分野生型拟南芥株系的叶片出现黄化现象。对其主根根长进行测定，如图4d实验结果表明，发现不论是cjirt1还是ptirt1的超量拟南芥株系均显著高于野生型拟南芥。
48.综上实验结果表明：过表达的cjirt1、ptirt1可以提高转基因拟南芥的耐缺铁能力，可以有效提升柑橘对缺铁环境的耐受能力，可为柑橘育种提供基因资源和技术支持，为柑橘育种提供基因资源和技术支持。
49.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。