一种生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌、构建及其应用的制作方法

本发明属于生物工程，尤其涉及一种生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌、构建及其应用。

背景技术：

1、5-羟基β-吲哚基丙氨酸是一种不参与蛋白质合成的天然氨基酸，可由色氨酸苯环上5号碳的氢被羟基取代后得到，它已成功用于抑郁症、失眠症、偏头痛和其他疾病的治疗，同时它也是神经递质血清素和褪黑素的重要前提物质。

2、5-羟基β-吲哚基丙氨酸广泛存在于豆科植物的种子中，其中非洲植物加纳的种子中含量最高。但这种植物提取的方式操作复杂，回收率低，成本高，而且随着非洲加纳树数量不断减少，传统提取更难以满足巨大的市场需求。越来越多的研究者开始着手5-羟基β-吲哚基丙氨酸的化学合成和生物合成。而化学合成存在环境污染、操作复杂的问题。随着合成生物学的高速发展，利用微生物尤其是酵母进行这些高价值化合物的绿色化和可持续化生产变得越来越现实。

3、解脂耶氏酵母是一种拥有潜在工业价值的非常规的二态酵母，它可以使用葡萄糖、甲醇、烷烃、脂肪酸等作为碳源，它拥有在高细胞密度下生长并产生大滴度的有价值分子的能力，并被认为是安全的。随着解脂耶氏酵母特性的深入研究和的分子生物学工具的发展，它被广泛用于各种医用蛋白、食用油脂、化学原料和工业燃料的生产。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌、构建及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

3、本发明第一方面提供了一种生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌，工程菌中整合有色氨酸羟化酶tph编码的基因、bh4合成用6-丙酮酰-四氢喋呤合酶pts编码的基因和墨喋呤还原酶spr编码的基因、bh4循环再生用4a-羟基四氢喋呤脱水酶pcbd和二氢喋啶还原酶dhpr编码的基因，以及敲除了吲哚胺2，3-双加氧酶和芳香族氨基酸氨基转移酶i的编码基因。

4、按上述方案，上述编码基因具体可使用具有如下核苷酸序列的基因。其中：所述色氨酸羟化酶的核苷酸序列如seq id no.1所示,其氨基酸序列如seq id no.2所示；所述6-丙酮酰-四氢喋呤合酶pts的核苷酸序列如seq id no.3所示，其氨基酸序列如seq id no.4所示；所述墨喋呤还原酶pts的核苷酸序列如seq id no.5所示，其氨基酸序列如seq idno.6所示；所述4a-羟基四氢喋呤脱水酶pcbd的核苷酸序列如seq id no.7所示，其氨基酸序列如seq id no.8；所述二氢喋啶还原酶dhpr的核苷酸序列如seq id no.9所示，其氨基酸序列如seq id no.10；所述吲哚胺2，3-双加氧酶的编码基因的核苷酸序列如seq idno.11，其氨基酸序列如seq id no.12；所述芳香族氨基酸氨基转移酶i的编码基因的核苷酸序列如seq id no.13，其氨基酸序列如seq id no.14。

5、本发明第二方面提供了上述生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌的构建方法，以解脂耶氏酵母菌作为出发菌株，通过基因改造构建获得所述基因工程菌，所述基因改造为：在工程菌中整合色氨酸羟化模块、bh4合成模块和bh4循环再生模块以及进一步的敲除解脂耶氏酵母中吲哚胺2，3-双加氧酶和芳香族氨基酸氨基转移酶i的编码基因，所述的色氨酸羟化模块基因包括色氨酸羟化酶tph的编码基因；所述bh4合成模块基因包括6-丙酮酰-四氢喋呤合酶pts的编码基因、墨喋呤还原酶spr的编码基因；所述的bh4循环再生模块基因包括4a-羟基四氢喋呤脱水酶pcbd的编码基因和二氢喋啶还原酶dhpr的编码基因。

6、按上述方案，所述的构建方法包括以下步骤：

7、(1)在解脂耶氏酵母中整合色氨酸羟化酶tph的编码基因获得基因工程菌yl-s01；

8、(2)在步骤(1)得到的基因工程菌yl-s01中整合6-丙酮酰-四氢喋呤合酶pts的编码基因、墨喋呤还原酶spr的编码基因，4a-羟基四氢喋呤脱水酶pcbd的编码基因和二氢喋啶还原酶dhpr的编码基因，获得基因工程菌yl-s03；

9、(3)依次敲除基因工程菌yl-s03中分别编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因yali0f26455g和编码芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因yali0f26977g，构建得到上述生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌。

10、按上述方案，所述的步骤(1)为：将色氨酸羟化酶tph的编码基因整合至解脂耶氏酵母工具质粒上，将整合了色氨酸羟化酶tph的编码基因的质粒线性化后导入解脂耶氏酵母中，得到基因工程菌yl-s01；

11、所述的步骤(2)为：将6-丙酮酰-四氢喋呤合酶pts的编码基因、墨喋呤还原酶spr的编码基因、4a-羟基四氢喋呤脱水酶pcbd的编码基因和二氢喋啶还原酶dhpr的编码基因整合至解脂耶氏酵母工具质粒上，将整合了6-丙酮酰-四氢喋呤合酶pts的编码基因、墨喋呤还原酶spr的编码基因，4a-羟基四氢喋呤脱水酶pcbd的编码基因和二氢喋啶还原酶dhpr的编码基因的质粒线性化后导入菌株yl-s01中，获得基因工程菌yl-s03；

12、所述的步骤(3)中为：

13、以解脂耶氏酵母基因组为模板，使用455_u-f/455_u-r和455_d-f/455_d-r为引物，pcr扩增后分别得到目的基因即编码吲哚胺2，3-双加氧酶基因yali0f26455g的上下游片段，使用soe-pcr对上下游片段进行组装，得到完整的上下游同源臂片段455_ud；

14、构建靶向目的基因即编码吲哚胺2，3-双加氧酶基因yali0f26455g的编辑质粒：以编辑质粒pcrispryl为模板，以455_grna-f/455_grna-r，pcr扩增并用dpni消化后转入dh5α菌株后得到编辑质粒pcrispryl-455；

15、将pcrispryl-455和455_ud一起转入菌株yl-s03中，pcr验证及筛选得到敲除编码吲哚胺2，3-双加氧酶的编码基因yali0f26455g的菌株yl-s04；

16、以解脂耶氏酵母基因组为模板，使用977_u-f/977_u-r和977_d-f/977_d-r为引物，pcr扩增后分别得到目的基因yali0f26977g的上下游片段，使用soe-pcr对上下游片段进行组装，得到完整的上下游同源臂片段977_ud；

17、构建靶向目的基因即芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因yali0f26977g的编辑质粒：以pcrispryl为模板，以977_grna-f/977_grna-r，pcr扩增并用dpni消化后转入dh5α菌株后得到编辑质粒pcrispryl-977；

18、将pcrispryl-977和977_ud一起转入菌株yl-s04中，pcr验证及筛选敲除编码吲哚胺2，3-双加氧酶和芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因yali0f26455g和yali0f26977g的菌株yl-s05，

19、其中，使用的引物序列如下：

20、

21、

22、本发明第三方面还提供了上述基因工程菌在生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸中的应用。

23、本发明以解脂耶氏酵母作为出发菌，通过导入外源的色氨酸羟化模块、bh4合成模块和bh4循环再生模块，构建四氢喋呤再生途径和四氢喋呤再生途径，实现5-羟基β-吲哚基丙氨酸的生物合成(图1)，进一步敲除能够降解5-羟基β-吲哚基丙氨酸的吲哚胺2，3-双加氧酶和能够降解色氨酸以及5-羟基β-吲哚基丙氨酸的芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因，构建了一种生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌。通过基因编辑技术敲除色氨酸和5-羟基β-吲哚基丙氨酸相关的降解基因，能够消除底盘菌中旁支代谢的竞争和消耗，进一步提高5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。最终得到的解脂耶氏酵母工程菌继承了解脂耶氏酵母优良的工业发酵价值且遗传稳定，能够实现以绿色无污染的方式从色氨酸生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量得到显著提升，对5-羟基β-吲哚基丙氨酸的工业化生产具有非常重要的价值。

24、本发明的有益效果：

25、本发明首次公开了以色氨酸为底物生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的解脂耶氏酵母工程菌。其通过在解脂耶氏酵母基因组中整合外源的羟化模块、bh4合成模块和bh4循环模块，构建四氢喋呤再生途径和四氢喋呤再生途径，进一步敲除编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因，实现了5-羟基β-吲哚基丙氨酸的生物合成，并使5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量得到显著的提升。本发明的解脂耶氏酵母工程菌用于5-羟基β-吲哚基丙氨酸的合成，最终生产产量37.2g/l，为其工业化生产奠定了基础。与化学合成相比，环境友好，成本低、产量高，满足国家绿色生物制造的战略需求。