人免疫球蛋白生产工艺的制作方法

本发明属于蛋白生产，具体涉及人免疫球蛋白生产工艺及试剂。

背景技术：

1、人免疫球蛋白临床上主要用于预防麻疹和甲型肝炎等病毒性感染，其作用机制有两种：一种是“被动免疫”，注射剂量大，使受者得到完全保护而不被感染；另一种是“被动-自动免疫”，注射剂量小，受者得到部分保护并产生自动免疫。

2、人免疫球蛋白系可以采用健康人血浆或血清分离、纯化、并经灭活、去除病毒等步骤加工制备而成。从血液中提取免疫球蛋白，常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法等。各类提取方法中使用的试剂以及过程参数对提取效果都将产生影响，特别是所获产品的稳定性等性质。此外，由于一些原因导致不能及时对样本进行处理，仅能使用储存样本进行人免疫球蛋白的制备，这种情况下，由于储存条件(温度、时间等)对样本的影响，血浆中的一些非蛋白成分可能发生变化，导致不再适用已有提取技术，最终产品收率或性能发生较大变化，这也是目前需要解决的问题。

3、申请号为cn201480037548.1的中国专利中公开了：在纯化过程中从包含igg、其它免疫球蛋白和/或其它蛋白质污染物的溶液增加igg收率的方法，包括(a)提供包含igg、其它免疫球蛋白和/或其它蛋白质污染物的酸性溶液，所述酸性溶液具有3.5至5.2的ph和至少10g/l的总蛋白质浓度；(b)将溶液调节至5.2至6.2的ph，同时保持低于1.5ms/cm的电导率；(c)将所述溶液温育至少15分钟；和(d)除去任何沉淀物。但该方法重点关注的为收率，对产品的其他性能的影响未知。

4、申请号为cn202011408376.8的中国专利中公开了：一种快速从血浆提取人免疫球蛋白的方法。以血浆为原料，采用特定浓度的辛酸直接进行沉淀，减少组分反应步骤，最终产品质量好、收率高，基本不含活化凝血因子ⅺ等杂质，能有效避免产品使用过程中产生致栓性风险，降低产品发生血栓不良反应。生产方法简单，工艺周期短，不需要进行血浆低温乙醇工艺中组分反应步骤，能够快速制备免疫球蛋白，尤其适用突发性大规模疫情感染特异性免疫球蛋白的制备，为患者快速提供高效价、高安全性的特异性免疫抗体制剂。但对于产品稳定性效果的提升仍未涉及。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明通过优化人免疫球蛋白提取过程中的试剂用量和整体操作流程，调整了实验中的ph、离子条件、过滤条件等，提高了人免疫球蛋白的收率和产品稳定性，有利于实际生产和科研用途。

2、一方面，本发明提供了一种人免疫球蛋白生产工艺。

3、所述的生产工艺中包括去除血浆中的ⅷ因子、纤维蛋白原和人血白蛋白，再通过低温乙醇法获得沉淀物。

4、所述的生产工艺中还包括：沉淀物使用3-3.5g/l的醋酸钠溶液复溶，调节ph后加入终浓度为12％-15％的冷乙醇，降温至-5到-6℃后，反应液中加入硅藻土和玻化微珠进行压滤收集滤液；所述的硅藻土和玻化微珠的用量比为2-4：1-2。

5、进一步，所述生产工艺中还包括：滤液中加入终浓度为4-5g/l的nacl，调节ph至中性后加入终浓度为18％-20％的冷乙醇，再按照与反应液以1：80-100的体积比加入包括浓度为3-4g/l的醋酸钠和1-2g/l的nahco3的混合液，降温至-5到-6℃，反应液中加入硅藻土和玻化微珠进行压滤收集；所述的硅藻土和玻化微珠的用量比为2-4：1-2。

6、优选地，所述的醋酸钠溶液相对沉淀物的用量为50-80：1v/w。进一步优选地，所述的醋酸钠溶液相对沉淀物的用量为80：1v/w。

7、优选地，所述的硅藻土的用量为8-10g/l反应液，所述的玻化微珠的用量为4-5g/l反应液。

8、优选地，所述的玻化微珠粒径为20目。

9、优选地，所述的硅藻土和玻化微珠的用量比为2：1。

10、具体地，所述的生产工艺可以选择性包括所述的沉淀物的制备方法：

11、(1)原料血浆0-4℃离心分离沉淀，去除沉淀得血浆1；

12、(2)血浆1控制温度在0-1℃，调节ph值为中性，添加＜-10℃且体积分数为40-50％的乙醇至与血浆1的体积比浓度为8-10％，离心得沉淀1和上清液1；

13、(3)上清液1调节ph值为6.80-6.85，添加＜-15℃且体积分数为95％的乙醇至与上清液1体积比浓度为20-23％，调ph为6.80-7.00，搅拌后静置，压滤后得沉淀2和上清液2；沉淀2即所述的沉淀物。

14、具体地，所述的生产工艺至少包括或者还包括：

15、(4)沉淀2使用0-4℃的浓度为3-3.5g/l的醋酸钠溶液复溶，醋酸钠溶液用量相对于沉淀2为50-80：1v/w，搅拌1-2小时，搅拌完成后，使用醋酸缓冲液调整ph值至5.0-5.2，调节ph后加入终浓度为12％-15％的冷乙醇，降温至-5到-6℃后，按每升反应液加入8-10g硅藻土和4-5g玻化微珠进行压滤，收集滤液3；

16、(5)向上清液3中加入终浓度为4-5g/l的nacl，氢氧化钠溶液调节ph至中性，在调节ph后的溶液中加入终浓度为18％-20％的冷乙醇，并按照与反应液以1：80-100的体积比加入包括浓度为3-4g/l的醋酸钠和1-2g/l的nahco3的混合液，完全加入后温度降至-5到-6℃，然后按每升反应液加入8-10g硅藻土和4-5g玻化微珠进行压滤，收集沉淀3；

17、(6)沉淀3使用包括3-4g/l的醋酸钠和1-2g/l的nahco3的混合液以40-50:1v/w用量溶解，调ph至5.1-5.2，在调节ph后的溶液中加入终浓度为14％-15％的冷乙醇，静置2-3h，上清液进行压滤收集滤液4即人免疫球蛋白溶液。

18、优选地，所述的制备工艺还可以选择性包括：

19、(7)滤液4用2-8℃注射用水连续透析至蛋白浓度至少80g/l，调ph至5.0。

20、(8)进行稀配和灭活，灭活后的蛋白液进行除病毒除菌，移至30-32℃孵放间孵育10-12天。

21、优选地，所述的步骤(5)和(6)的混合液中醋酸钠的浓度为4g/l，所述的nahco3的浓度为2g/l，混合液用量为1:100。

22、优选地，所述的步骤(4)和(5)中硅藻土用量为每升反应液10g，玻化微珠的用量为每升反应液5g。

23、在一些实施例中，所述的生产工艺包括以下步骤：

24、(1)将原料血浆融浆，温度控制在0-4℃之间，2000r，5min离心分离沉淀，去除沉淀得血浆1；

25、(2)血浆1控制温度在0-1℃，滴加ph为4.0的醋酸缓冲液调节ph值为中性，添加-15℃且体积分数为50％的低温乙醇至乙醇与血浆1的体积比浓度为10％，添加乙醇的流速为1升/分钟，添加乙醇后温度控制在-1至-3℃，加完乙醇后进行离心(3000r，3min)，离心得沉淀1和上清液1；

26、(3)上清液1滴加ph为4.0的醋酸缓冲液调节ph值为6.70-6.90，添加-15℃且体积分数为95％的低温乙醇至乙醇与上清液1体积比浓度为20％，添加乙醇的流速为1.0-1.2升/分钟，添加乙醇后温度控制在-4到-6℃，加完乙醇后，ph为6.80-7.00，搅拌后静置，再开启搅拌，然后进行压滤，压滤后得沉淀2和滤液2，记录沉淀2的重量，沉淀2用于制备人免疫球蛋白；

27、(4)将沉淀2用0-4℃的醋酸钠溶液(3-3.5g/l)复溶，醋酸钠溶液用量相对于沉淀2为50-80：1v/w，搅拌1-2小时，搅拌完成后，滴加ph为4.0的醋酸缓冲液调整ph值至5.0-5.2；在调节ph后的溶液中加入-15℃的95％乙醇，加入过程中搅拌2小时，95％乙醇终浓度为12％-15％，完全加入后温度降至-5到-6℃，ph值为5.10-5.30，然后按每升反应液加入8-10g硅藻土+4-5g玻化微珠(20目)进行压滤，收集滤液3；

28、(5)向上清液3中加入终浓度为4-5g/l的nacl，使用ph为10的氢氧化钠溶液调节ph至中性，在调节ph后的溶液中加入-15℃的95％乙醇，加入过程中搅拌1小时，95％乙醇终浓度为18％-20％，与反应液以1：80-100的体积比加入-15℃的浓度为3-4g/l的醋酸钠+1-2g/l的nahco3的混合液，搅拌0.5-1h，完全加入后温度降至-5到-6℃，然后按每升反应液加入8-10g硅藻土+4-5g玻化微珠(20目)进行压滤，收集沉淀3；

29、(6)沉淀3使用3-4g/l的醋酸钠+1-2g/l的nahco3的混合液以40-50:1v/w用量溶解，调ph至5.1-5.2，在调节ph后的溶液中加入-15℃的95％乙醇，95％乙醇终浓度为14％-15％，加入终浓度为4-5g/l的氯化钠，静置2-3h，上清液进行压滤收集滤液4即目标溶液。

30、(7)滤液4用2-8℃注射用水连续透析至蛋白浓度约80g/l，再用0.5mol/lhcl或0.5mol/l naoh调ph至5.0。

31、(8)进行稀配和灭活，将灭活后的蛋白液用20nm纳米膜进行除病毒过滤，按要求除菌灌装，将灌装后制品移至30-32℃孵放间孵育10-12天。

32、本发明的有益效果：

33、本发明的生产工艺制备得到的免疫球蛋白成品纯度均能达到>99％，且热稳定性好，收率高，制备的成品受原料储存条件的影响较小，具有较高的实用性。