专利名称：一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法
技术领域：
本发明属于水产动物免疫学研究技术领域，具体涉及一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法。
背景技术：
对于鱼类整个免疫系统以及免疫应答规律等的基础研究，都依赖于对免疫球蛋白的研究，它是鱼体免疫应答的主要介质。因此对免疫球蛋白的研究也是鱼类免疫学研究的重点和热点。这其中如何使鱼体发生免疫应答以及如何获得高纯度的免疫球蛋白是研究的关键。在大菱鲆免疫研究中，以往主要采用将病原制成疫苗免疫鱼体，使之产生特异性抗体，然后通过饱和硫酸铵沉淀、凝胶过滤等技术对抗体进行纯化，来研究免疫球蛋白的特性。但通过这些方法获得的免疫球蛋白，其活性、纯度以及数量都是有限的，而且操作步骤较为繁琐，不利于深入、精确的研究免疫球蛋白的特性及其发生机理。究其原因主要是一方面，以病原作为抗原，其结构复杂，性状不稳定，变种多，产生的抗体含有不确定性因素较多；另一方面，目前常用的免疫球蛋白纯化方法操作较为繁琐，在纯化过程易损失蛋白。因此，在大菱鲆免疫球蛋白的研究过程中，长期以来一直未能找到合适的抗原来获得抗体，一定程度上限制了免疫球蛋白研究的发展，致使诸如大菱鲆免疫球蛋白的类型、数量、基因、 应答机理、调控机理等方面的研究不能深入。因此，有必要寻找一个结构简单、稳定、易获得且价廉的优质抗原激起大菱鲆鱼体免疫应答反应，再通过此抗原耦合的亲和层析柱纯化免疫球蛋白，操作简单，获得的免疫球蛋白纯度高，利于对其进行深入的研究和探讨。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，能够有效解决大菱鲆的免疫研究中缺乏有效的抗原，特异性免疫球蛋白数量不足的问题。申请人:在长期的研究中发现牛血清白蛋白BSA能有效的诱使大菱鲆发生免疫反应，并通过创造性劳动后建立了具体的免疫方法。本发明的用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征是利用牛血清白蛋白(BSA) 作为抗原来免疫大菱鲆。本发明的免疫方法，包括如下步骤1)第一次免疫将BSA与弗氏完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5ml/kg鱼体重肌肉注射健康大菱鲆；2)第二次免疫第一次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆；3)第三次免疫第二次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆完成免疫；在从第一次免疫起 1 10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。优选采用免疫后8 10周的高效价血清，通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。所述的亲和层析的方法，具体操作如下将BSA-琼脂糖装入10 X0. 5cm层析柱中， 以0. Olmol/L磷酸盐缓冲液预洗后，将大菱鲆免疫血清与等体积磷酸盐缓冲液混合，过滤后上层析柱，PBS洗涤；用IOml洗脱液将大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白洗脱下来并作为单一组分收集；立即用1. 2ml 0. lmol/L Tris-HCl中和；置0. Olmol/L磷酸缓冲液中4°C透析获得大菱鲆免疫球蛋白。上述的洗脱液为含0. 15mol/L NaCl的0. lmol/L甘氨酸-NaOH溶液，洗脱液pH值为 11. 0。本发明克服了生化领域对BSA的惯常用法，将其作为抗原经过特定的免疫程序来免疫大菱鲆，从而获得高效价的抗BSA特异性抗体。本发明的方法解决了长期以来大菱鲆免疫研究缺乏足够特异性免疫球蛋白的难题。同时采用的BSA具有结构简单，成分单一，不易对免疫结果产生干扰，而且易获得等优点。在水产动物中可建立以BSA为模式蛋白，并形成以BSA为基础的研究模式。
图1 间接ELISA法测定BSA免疫大菱鲆后血清抗体效价的变化图。图2 =SDS-PAGE初步分析应用不同方法纯化的免疫球蛋白效果对比图。其中箭头所示位置为免疫球蛋白的重链(上端)和轻链(下端)，M-marker、l、辛酸-(MM)2SO4沉淀法纯化的免疫球蛋白；2、根据等电点进行透析纯化的免疫球蛋白；3、在第2步基础上，过 sephadex-G200凝胶柱，纯化的免疫球蛋白；4、免疫亲和层析法纯化的特异性免疫球蛋白。
具体实施例方式本发明采用的牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种简单的球蛋白，由583个氨基酸残基组成，分子量为66. 430kDa，等电点为4. 7。BSA在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为封闭液；BSA也是一种常用的载体蛋白，将其交联于半抗原和其他弱抗原可以使它们在抗体生产中具有更强的免疫原性。在已有的免疫学研究中，未见直接将BSA作为抗原的应用报道。本发明将BSA引入鱼类免疫学研究中，开辟一条研究免疫球蛋白的新途径，从而克服以往方法的不足。本发明的具体方法如下1)第一次免疫将BSA与弗氏完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5mL/kg鱼体重肌肉注射健康大菱鲆；2)第二次免疫第一次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆；3)第三次免疫第二次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5mL/kg鱼体重肌肉注射第一次免疫的大菱鲆完成免疫；在从第一次免疫起 1 10周内定期采集免疫的大菱鲆血液，经检验，采用免疫后8 10周的高效价血清，通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA免疫球蛋白。在大菱鲆免疫过程中，免疫剂量的选择、免疫程序等都是影响抗体的产生、抗体的质量及数量的因素。为了获得大量的抗血清，本发明中选取平均体重500g的大菱鲆，在确定好佐剂及免疫剂量后，确立免疫程序就很重要。在定期采样检测中发现，通常采用的2次免疫程序并没有使大菱鲆体内产生足够的免疫球蛋白。本发明中采用了 3次免疫的程序， 经过检测，达到了预期的效果，鱼体产生了高水平的抗体；而更多次数得免疫并没有使免疫效果提高，并且多次注射还容易使鱼体产生应激反应。在免疫期间对免疫的大菱鲆定期取血(尾静脉取血)，分离血清，通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中抗BSA的特异性抗体效价，作为评估指标。特异性抗体检验方法(间接ELISA)建立以0. 05mol/L(pH = 9. 6)碳酸盐溶液稀释BSA至2 μ g/mL,取50 μ L稀释液加入酶标板孔中，置4°C冰箱中过夜包被，次日以 0. 01mol/L(pH = 7. 4)PBST (0. 05% Tween-20)洗涤 3 次，每次 3min ；用 5%猪血清于 37°C封闭lh，封闭结束后以PBST同法洗涤；将大菱鲆抗BSA血清作为第一抗体，以1 100开始倍比稀释，每孔加入50 μ L，阴性对照为PBS，于37。C反应15min后以PBST同法洗涤；将兔抗大菱鲆IgM血清(1 10000)作为第二抗体，每孔加入50yL，于37°C反应15min后以PBST同法洗涤；然后每孔加入50 μ L羊抗兔IgG-HRPd 1000稀释)(中杉金桥，北京)，于37°C 反应30min后洗涤；每孔加入新配制的50 μ L显色液TMB (四甲基联苯胺)显色5min后，加入2mol/L硫酸溶液50 μ L终止反应；结果判定用自动酶标仪读取0D450值(Ρ/Ν彡2. 1时判定为阳性)。免疫效果评估大菱鲆经过免疫后第四周开始产生特异性抗体，抗体效价为 1 800 ；第五周至第七周抗体水平逐步升高；第八周开始抗体水平升高到1 51200并维持在这一水平至第十周(图1)。高水平的特异性抗体(即免疫球蛋白)保证了对免疫球蛋白特性的研究。免疫球蛋白纯化及分析大菱鲆鱼体产生高效价抗体后，采集血液，制备血清。 通过免疫亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。免疫亲和层析方法如下将 BSA-琼脂糖(Biocompare，USA)装入层析柱(10X0. 5cm,AppliedBiosystems,USA)中，重力作用下逐步填充，形成床体积2ml ；以0. Olmol/L磷酸盐缓冲液(PBS) (pH = 7. 4，含0. 5mol/ L NaCl)预洗后，将大菱鲆免疫血清与等体积PBS混合，过滤后上柱，PBS洗涤；用IOml洗脱液(0. lmol/L甘氨酸-NaOH, pH = 11. 0，含0. 15mol/L NaCl)将大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白洗脱下来并作为单一组分收集；立即用1. 2ml 0. lmol/L Tris-HCl (pH = 7. 2)中和；置 0. Olmol/L磷酸缓冲液(PB)中4°C透析；浓缩后以SDS-PAGE检验，测定蛋白质含量(Nano Drop, ND-1000 Spectrophotometer, USA)后于 _70°C保存备用。本发明建立的免疫球蛋白的免疫亲和层析纯化方法，对各种条件进行了长期的优化。与其它常规、常用的纯化方法相比较，结果发现以辛酸-(NH4)2SO4沉淀法、等电点透析纯化法及s印hadeX-G200凝胶过滤法获得的免疫球蛋白无论在数量还是质量上都逊色于免疫亲和层析纯化法(图幻，且前几种方法都无法获得特异性的免疫球蛋白。本发明获得特异性的免疫球蛋白后，通过如免疫电泳、native电泳、层析等方法来进一步研究免疫球蛋白的特性(如分子量、结构、类型、含量等)，进而研究其应答机理，为更深入的揭示其作用机制奠定了坚实的基础。
权利要求
1.一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于是利用牛血清白蛋白BSA作为抗原来免疫大菱鲆。
2.权利要求1所述的生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤1)第一次免疫将BSA与弗氏完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0.5ml/kg鱼体重量注入健康大菱鲆；2)第二次免疫第一次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5mL/kg鱼体重量注入第一次免疫的大菱鲆；3)第三次免疫第二次免疫14天后将BSA与弗氏不完全佐剂等比例混勻乳化制成疫苗，以0. 5mL/kg鱼体重量注入第一次免疫的大菱鲆完成免疫；在从第一次免疫起1 10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。
3.如权利要求2所述的生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于是从第一次免疫起 8 10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。
4.如权利要求2所述的生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于所述的亲和层析的方法是将BSA-琼脂糖装入10X0. 5cm层析柱中，以0. 01mol/L磷酸盐缓冲液预洗后，将大菱鲆免疫血清与等体积磷酸盐缓冲液混合，过滤后上层析柱，PBS洗涤后；用IOml洗脱液将大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白洗脱下来并作为单一组分收集；立即用1. 2ml 0. lmol/L Tris-HCl中和；置0. 01mol/L磷酸缓冲液中4°C透析获得大菱鲆免疫球蛋白。
5.如权利要求4所述的生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于所述的洗脱液为含 0. 15mol/L NaCl 的 0. lmol/L 甘氨酸-NaOH 溶液，洗脱液 pH 值为 11.0。
全文摘要
本发明涉及一种用于生产大菱鲆免疫球蛋白的方法，其特征在于是利用牛血清白蛋白BSA作为抗原来免疫大菱鲆；具体是通过三次免疫操作后，在从第一次免疫起8～10周内通过亲和层析的方法获得大菱鲆抗BSA的免疫球蛋白。本发明克服了生化领域对BSA的惯常用法，将其作为抗原经过特定的免疫程序来免疫大菱鲆，从而获得高效价的抗BSA特异性抗体。本发明的方法解决了长期以来大菱鲆免疫研究缺乏足够特异性免疫球蛋白的难题。同时采用的BSA具有结构简单，成分单一，不易对免疫结果产生干扰，而且易获得等优点。在水产动物中可建立以BSA为模式蛋白，并形成以BSA为基础的研究模式。
文档编号C07K16/18GK102268088SQ20111021644
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月30日 优先权日2011年7月30日
发明者张改平, 李青梅, 王蔚芳, 甘玲玲, 雷霁霖 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所