1.一种高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,在载体骨架yko-rp003中删除如seq id no:1所示的序列。
3.根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,所述insert序列为:tctgtttaactaga。
4.根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,所述高效的细胞系基因敲除方法在步骤(1)载体构建与质粒制备之前,还包括项目难度评估步骤,所述项目难度评估步骤包括基因评估、基因打靶方案设计和细胞预实验与难度评估。
5.根据权利要求4所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,所述基因评估的操作流程如下:结合红棉基因风险评估系统和表达量评估系统,确定待敲除基因是否具有致死风险、在目的细胞系中的表达情况,若评估通过,则正常进行方案设计;
6.根据权利要求4所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,所述步骤(3)pool基因编辑效率检测的操作方法如下:使用单克隆鉴定试剂盒对收取的pool细胞进行裂解,裂解产物进行pcr扩增和测序,测序结果通过红棉基因型分析系统进行分析,在红棉基因型分析系统中导入野生型细胞和pool细胞的测序文件,输入grna信息,进行分析,获得pool细胞的切割效率数值、pool细胞中包含的基因型以及各基因型的占比。
7.根据权利要求4所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,在所述步骤(4)制备单克隆的操作流程如下:
8.根据权利要求7所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,所述步骤(5)的单克隆基因型鉴定的操作流程如下:使用单克隆鉴定试剂盒对步骤(4)得到的单克隆进行裂解,获得粗提的dna,按照设计的引物对粗提的dna进行pcr扩增,对扩增产物进行电泳检测,根据电泳条带进行初筛,将初筛阳性的克隆进行测序,测序结果通过红棉基因型分析系统进行分析,判断基因型是否符合敲除标准;将初检阳性的克隆继续培养至t75细胞瓶,使用无血清冻存液进行细胞冻存。
9.根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,在所述步骤(3)和所述步骤(5)中,使用的单克隆鉴定试剂盒选自源井生物、货号为yk-mv-1000的单克隆鉴定试剂盒。
10.根据权利要求1所述高效的细胞系基因敲除方法,其特征在于,所述高效的细胞系基因敲除方法适用于对可无限传代的哺乳动物的细胞系进行基因敲除,可无限传代的哺乳动物的细胞系包括肿瘤细胞系、永生化细胞系和干细胞。