拮抗性抗犬PD-1抗体的制作方法

本发明涉及针对犬pd-1的鼠抗体，其具有特定序列和对犬pd-1的高结合亲和力。本发明也涉及本发明的抗体在治疗狗癌症中的用途。

背景技术：

1、主要在活化的t和b细胞上表达的免疫抑制性受体(程序性细胞死亡受体1，也被称作程序性死亡受体1(pd-1))是与cd28和ctla-4有关的免疫球蛋白超家族的一个成员。pd-1和类似的家族成员是含有细胞外ig可变型(v-型)结构域(其结合它的配体)和胞质尾区(其结合信号传递分子)的i型跨膜糖蛋白。pd-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传递基序：itim(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)和itsm(基于免疫受体酪氨酸的转换基序)。

2、pd-1当结合至程序性细胞死亡配体1(也被称作程序性死亡配体1(pd-l1))和/或程序性细胞死亡配体2(也被称作程序性死亡配体2(pd-l2))时减弱t-细胞应答。这些配体中的任一种与pd-1的结合会负调节抗原受体信号传递。阻断pd-l1与pd-1的结合会增强肿瘤特异性的cd8+t-细胞免疫，同时辅助免疫系统对肿瘤细胞的清除。已经报道了鼠pd-1的三维结构、以及小鼠pd-1与人pd-l1的共晶结构[zhang等人,immunity 20:337-347(2004)；lin等人,proc.natl.acad.sci.usa 105:3011-3016(2008)]。

3、pd-l1和pd-l2是含有在细胞外区域中的igv-和igc-样结构域以及不具有已知信号传递基序的短细胞质区域的i型跨膜配体。pd-l1和pd-l2二者组成性地表达，或者可以在多种细胞类型(包括非造血组织以及多种肿瘤类型)中诱导。pd-l1不仅在b、t、骨髓和树突细胞(dc)上表达，而且在周围细胞(诸如微血管内皮细胞和非淋巴样器官例如心脏或肺)上表达。相反，pd-l2仅存在于巨噬细胞和dc上。pd-1配体的表达模式提示，pd-1在维持外周耐受中起作用，并且还可以用于调节外周中的自体反应性t-和b-细胞应答。

4、在任何情况下，现在非常清楚的是，pd-1在至少某些人癌症中起关键作用，可能是通过介导免疫逃避。因此，pd-l1已经被证实在许多小鼠和人肿瘤上表达，且在大多数pd-l1阴性的肿瘤细胞系中可被ifnγ诱导[iwai等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:12293-12297(2002)；strome等人,cancer res.,63:6501-6505(2003)]。此外，已经在许多原发性人肿瘤活组织检查中鉴别出pd-1在肿瘤浸润性淋巴细胞上的表达和/或pd-l1在肿瘤细胞上的表达。这样的肿瘤组织包括肺、肝、卵巢、子宫颈、皮肤、结肠、神经胶质瘤、膀胱、乳房、肾、食管、胃、口腔鳞状细胞、泌尿道上皮细胞和胰腺的癌症以及头和颈的肿瘤[brown等人,j.immunol.170:1257-1266(2003)；dong等人,nat.med.8:793-800(2002)；wintterle等人,cancerres.63:7462-7467(2003)；strome等人,cancerres.,63:6501-6505(2003)；thompson等人,cancer res.66:3381-5(2006)；thompson等人,clin.cancer res.13:1757-1761(2007)；nomi等人,clin.cancerres.13:2151-2157.(2007)]。更惊人的是，在肿瘤细胞上的pd-配体表达已经与跨多个肿瘤类型的人癌症患者的不良预后相关联[综述在okazaki和honjo,int.immunol.19:813-824(2007)]。

5、此外，nomi等人[clin.cancerres.13:2151-2157(2007)]证实了通过施用pd-1或pd-l1指导的抗体在侵袭性胰腺癌的鼠模型中阻断pd-l1与pd-1的结合的治疗效果。这些抗体会有效地促进肿瘤反应性的cd8+t细胞向肿瘤中的渗透，从而导致抗肿瘤效应物(包括ifnγ、颗粒蛋白酶b和穿孔蛋白)的上调。类似地，抗体用于阻断pd-l1和pd-1的结合的用途，会在小鼠鳞状细胞癌模型中显著地抑制肿瘤生长[tsushima等人,oral oncol.42:268-274(2006)]。

6、在其它研究中，用pd-l1对鼠肥大细胞瘤系的转染导致当与肿瘤特异性的ctl克隆共培养时减少的肿瘤细胞裂解。当加入抗-pd-l1单克隆抗体时，裂解被恢复[iwai等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:12293-12297(2002)]。在体内，显示了阻断pd1/pd-l1相互作用会增加继承性t细胞转移疗法在小鼠肿瘤模型中的效力[strome等人,cancerres.63:6501-6505(2003)]。关于pd-1在癌症治疗中的作用的其它证据来自用pd-1敲除的小鼠执行的实验，其中表达pd-l1的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长(导致肿瘤生长和有关的动物死亡)，但是不在pd-1缺陷型小鼠中生长[iwai y.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:12293-12297(2002)]。近年来，针对pd-1的抗体(包括针对人pd-1的人源化鼠单克隆抗体)已经至少在人类的癌症治疗中显示了初步成功[参见例如，us 8,354,509 b2、us 8,008,449 b2和us 7,595,048b2]。

7、抗-pd-1抗体还可以用在慢性病毒感染中。在急性病毒感染以后产生的记忆性cd8+t细胞是高度功能性的，并且构成保护性免疫的一个重要组分。相反，慢性感染经常特征在于病毒特异性的t-细胞应答的不同程度的功能缺损(耗竭)，并且该缺陷是宿主不能消除持久病原体的一个主要原因。尽管功能性的效应t细胞最初在感染的早期阶段产生，它们在慢性感染的进程中逐渐丧失功能。barber等人[nature 439:682-687(2006)]证实，用lcmv的实验室毒株感染的小鼠发展了慢性感染，导致血液和其它组织中的高病毒水平。这些小鼠最初形成了稳健的t细胞应答，但是最终在t细胞耗竭后屈服于感染。barber等人发现，通过注射阻断pd-1和pd-l1之间的相互作用的抗体，可以反转慢性感染的小鼠中效应t细胞的数目和功能的下降。

8、本文中对任何参考文献的引用不应解释为承认：这样的参考文献可作为本技术的“背景技术”得到。

技术实现思路

1、本发明涉及抗-犬pd-1抗体，其具有对犬pd-1的高结合亲和力以及具有阻断犬pd-1与犬pd-l1的结合的能力。在具体实施方案中，这样的抗-犬pd-1抗体是鼠抗-犬pd-1抗体。在具体实施方案中，所述抗-犬pd-1抗体具有对犬pd-1的高结合亲和力以及具有也阻断犬pd-1与犬pd-l2的结合的能力。

2、此外，本发明涉及这些抗体包含的互补决定区(cdr)和这些cdr(例如，得自鼠抗-犬pd-1抗体)在犬框架中的组合以形成犬化抗-犬pd-1抗体。本发明也涉及这样的抗体在治疗疾病(诸如癌症和/或由感染引起的那些)中的用途。

3、因此，本发明提供了来自七种示例鼠抗-犬pd-1抗体的cdr的独特集合。尽管七种示例鼠抗-犬pd-1抗体中的每一种具有cdr的独特集合，即，三个轻链cdr：cdr轻1(cdrl1)、cdr轻2(cdrl2)和cdr轻3(cdrl3)，和三个重链cdr：cdr重1(cdrh1)、cdr重2(cdrh2)和cdr重3(cdrh3)，如下面详述的，在cdr的每个组(例如，cdrl1的集合)内存在实质序列同源性。因此，本发明不仅提供了来自七种示例鼠抗-犬pd-1抗体的六个cdr的氨基酸序列，而且提供了那些cdr的保守修饰的变体、以及这样的变体：其包含(例如，共享)相同规范结构和/或结合犬pd-1的表位所包含的犬pd-1的氨基酸残基中的一个或多个(例如，1-4个或甚至所有)。

4、因此，本发明提供了特异性地结合犬程序性死亡受体1(犬pd-1)的抗体或其抗原结合片段，它们包含：包含seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的氨基酸序列的轻链互补决定区1(vl cdr1)，和/或包含seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq idno:19、seq id no:20或seq id no:21的氨基酸序列的轻链互补决定区2(vl cdr2)，和/或包含seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25或seq id no:26的氨基酸序列的轻链互补决定区3(vl cdr3)，和/或重链互补决定区1(vh cdr1)，其中cdrh1包含seqid no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列，和/或包含seq idno:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35的氨基酸序列的重链互补决定区2(vh cdr2)，和/或包含seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38或seq idno:114的氨基酸序列的重链互补决定区3(vh cdr3)。在具体实施方案中，所述抗体是哺乳动物抗体。在更具体的实施方案中，所述抗体是犬化抗体。

5、因此，本发明的犬化抗体或其抗原结合片段包含具有seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列的重链互补决定区1(vh cdr1)中的一个或多个。在另一个实施方案中，所述重链互补决定区2(vh cdr2)包含seq id no:31、seq idno:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35的氨基酸序列。在还另一个实施方案中，所述重链互补决定区3(vh cdr3)包含seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38或seq id no:114的氨基酸序列。在这类的一个具体实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列的vh cdr1，和包含seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35的氨基酸序列的vh cdr2。在还另一个这样的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列的vhcdr1，和包含seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38或seq id no:114的氨基酸序列的vh cdr3。在另一个这样的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seq idno:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35的氨基酸序列的vhcdr2，和包含seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38或seq id no:114的氨基酸序列的vh cdr3。在另一个这样的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seq idno:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30的氨基酸序列的vh cdr1，包含seq idno:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34或seq id no:35的氨基酸序列的vhcdr2，和包含seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38或seq id no:114的氨基酸序列的vh cdr3。

6、在具体实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段还包含含有seq id no:13、seqid no:14或seq id no:15的氨基酸序列的轻链互补决定区1(vl cdr1)。在有关的实施方案中，轻链互补决定区2(vl cdr2)包含seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq idno:19、seq id no:20或seq id no:21的氨基酸序列。在还另一个实施方案中，所述轻链互补决定区3(vl cdr3)包含seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25或seq id no:26的氨基酸序列。在这类的一个具体实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的氨基酸序列的vl cdr1，和包含seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20或seq idno:21的氨基酸序列的vl cdr2。

7、在其它这样的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的氨基酸序列的vl cdr1，和包含seq id no:22、seq idno:23、seq id no:24、seq id no:25或seq id no:26的氨基酸序列的vl cdr3。在还另一个这样的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20或seq id no:21的氨基酸序列的vl cdr2，和包含seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25或seq id no:26的氨基酸序列的vl cdr3。在其它这样的实施方案中，所述犬化抗体或抗原结合片段包含：包含seqid no:13、seq id no:14或seq id no:15的氨基酸序列的vl cdr1，包含seq id no:16、seqid no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20或seq id no:21的氨基酸序列的vlcdr2，和包含seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25或seq id no:26的氨基酸序列的vl cdr3。

8、在具体实施方案中，所述犬化抗-犬pd-1抗体还包含互补决定区(cdr)，其中所述cdr具有以下规范结构：对于重链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为h1-1、h2-1和h3-6，即，重链的cdr1具有规范结构类别1，重链的cdr2具有规范结构类别1，且重链的cdr3具有规范结构类别6。在甚至更具体的实施方案中，对应轻链的cdr具有以下规范结构：对于轻链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为l1-3、l2-1和l3-1。在其它实施方案中，所述犬化抗-犬pd-1抗体还包含互补决定区(cdr)，其中所述cdr具有以下规范结构：对于重链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为h1-1、h2-1和h3-11。在这类的甚至更具体的实施方案中，对应轻链的cdr具有以下规范结构：对于轻链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为l1-2a、l2-1和l3-1。在还其它的实施方案中，所述犬化抗-犬pd-1抗体还包含互补决定区(cdr)，其中所述cdr具有以下规范结构：对于重链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为h1-1、h2-2a和h3-11。在这类的甚至更具体的实施方案中，对应轻链的cdr具有以下规范结构：对于轻链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为l1-2a、l2-1和l3-1。在还其它的实施方案中，所述犬化抗-犬pd-1抗体还包含互补决定区(cdr)，其中所述cdr具有以下规范结构：对于重链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为h1-1、h2-2a和h3-13。在这类的甚至更具体的实施方案中，对应轻链的cdr具有以下规范结构：对于轻链的cdr1、cdr2和cdr3，分别为l1-4、l2-1和l3-1。

9、此外，本发明提供了针对犬pd-1的抗体，例如，单克隆抗体，其包含本发明的cdr的变体，其具有本文中提供的对应规范结构且结合seq id no:103的氨基酸序列。在这类的具体实施方案中，关于抗体-犬pd-1结合的解离常数(kd)是1x10-5至1x10-12m。在更具体的实施方案中，针对犬pd-1的抗体包含本发明的cdr的变体，其具有本文中提供的对应规范结构且结合seq id no:104的氨基酸序列。

10、本发明还提供了一种分离的特异性地结合程序性死亡受体1(pd-1)的、包含犬igg重链和犬κ或λ轻链的犬化抗体或其抗原结合片段。在这类的具体实施方案中，从鼠抗-犬pd-1抗体得到犬κ或λ轻链和犬igg重链，所述犬κ或λ轻链包含三个轻链互补决定区(cdr)：cdr轻1(cdrl1)、cdr轻2(cdrl2)和cdr轻3(cdrl3)，且所述犬igg重链包含三个重链cdr：cdr重1(cdrh1)、cdr重2(cdrh2)和cdr重3(cdrh3)。本发明的犬化抗体和其抗原结合片段的具体实施方案结合犬pd-1和/或阻断犬pd-1与犬程序性死亡配体1(pd-l1)的结合。

11、在具体实施方案中，本发明提供了一种分离的特异性地结合犬程序性死亡受体1(犬pd-1)的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其包含三个轻链互补决定区(cdr)：cdr轻1(cdrl1)、cdr轻2(cdrl2)和cdr轻3(cdrl3)；和三个重链cdr：cdr重1(cdrh1)、cdr重2(cdrh2)和cdr重3(cdrh3)。在某些实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:13的氨基酸序列、seq id no:13的变体、seq id no:13的保守修饰的变体、包含规范结构类别3的seq idno:13的变体、seq id no:15、seq id no:15的变体、seq id no:15的保守修饰的变体或包含规范结构类别2a的seq id no:15的变体；所述cdrl2包含seq id no:16的氨基酸序列、seq id no:16的变体、seq id no:16的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:16的变体、seq id no:18、seq id no:18的变体、seq id no:18的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:18的变体、seq id no:19、seq id no:19的变体、seq id no:19的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:19的变体、seq id no:20、seq idno:20的变体、seq id no:20的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:20的变体、seq id no:21、seq id no:21的变体、seq id no:21的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:21的变体，所述cdrl3包含seq id no:22的氨基酸序列、seq id no:22的变体、seq id no:22的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:22的变体、seq id no:24、seq id no:24的变体、seq id no:24的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:24的变体、seq id no:25、seq id no:25的变体、seq id no:25的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:25的变体、seq id no:26、seq id no:26的变体、seq id no:26的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:26的变体，所述cdrh1包含seq id no:27的氨基酸序列、seq id no:27的变体、seq id no:27的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:27的变体、seq id no:29、seq id no:29的变体、seq id no:29的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:29的变体、seq id no:30、seq id no:30的变体、seq id no:30的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seqid no:30的变体，所述cdrh2包含seq id no:31的氨基酸序列、seq id no:31的变体、seqid no:31的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:31的变体、seq id no:33、seq id no:33的变体、seq id no:33的保守修饰的变体、包含规范结构类别2a的seq idno:33的变体、seq id no:34、seq id no:34的变体、seq id no:34的保守修饰的变体、包含规范结构类别1的seq id no:34的变体、seq id no:35、seq id no:35的变体、seq id no:35的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:35的变体，所述cdrh3包含seqid no:36的氨基酸序列、seq id no:36的变体、seq id no:36的保守修饰的变体、包含规范结构类别6的seq id no:35的变体、seq id no:38、seq id no:38的变体、seq id no:38的保守修饰的变体、或包含规范结构类别11的seq id no:38的变体、seq id no:114、seq idno:114的变体、seq id no:114的保守修饰的变体、或包含规范结构类别11的seq id no:114的变体。在具体实施方案中，所述抗体和其抗原结合片段结合犬pd-1并阻断犬pd-1与犬程序性死亡配体1(pd-l1)的结合。在有关的实施方案中，所述抗体还阻断犬pd-1与犬程序性死亡配体2(pd-l2)的结合。在具体实施方案中，所述分离的哺乳动物抗体是犬化抗体。在更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seq id no:99、seqid no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seq id no:104。

12、在其它实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:13的氨基酸序列、seq id no:13的变体、seq id no:13的保守修饰的变体、或包含规范结构类别3的seq id no:13的变体；所述cdrl2包含seq id no:16的氨基酸序列、seq id no:16的变体、seq id no:16的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:16的变体；所述cdrl3包含seq id no:22的氨基酸序列、seq id no:22的变体、seq id no:22的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:22的变体，所述cdrh1包含seq id no:27的氨基酸序列、seq id no:27的变体、seq id no:27的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:27的变体；所述cdrh2包含seq id no:31的氨基酸序列、seq id no:31的变体、seq id no:31的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的seq id no:31的变体，所述cdrh3包含seq id no:36的氨基酸序列、seq id no:36的变体、seq id no:36的保守修饰的变体、或包含规范结构类别6的seqid no:36的变体。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seqid no:99、seq id no:100、ofseq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seq idno:104。在更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合seqid no:102内的至少一个氨基酸残基。

13、在还其它的实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:13的氨基酸序列、seq id no:13的变体、seq id no:13的保守修饰的变体、或包含规范结构类别3的seq id no:13的变体；所述cdrl2包含seq id no:19的氨基酸序列、seq id no:19的变体、seq id no:19的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:19的变体；所述cdrl3包含seq id no:25的氨基酸序列、seq id no:25的变体、seq id no:25的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:25的变体，所述cdrh1包含seq id no:27的氨基酸序列、seq id no:27的变体、seq id no:27的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:27的变体；所述cdrh2包含seq id no:31的氨基酸序列、seq id no:31的变体、seq id no:31的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的seq id no:31的变体，所述cdrh3包含seq id no:36的氨基酸序列、seq id no:36的变体、seq id no:36的保守修饰的变体、或包含规范结构类别6的seq id no:36的变体。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seq id no:104。在更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合seq id no:2的一个或两个氨基酸残基r75和r90。

14、在还其它的实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:13的氨基酸序列、seq id no:13的变体、seq id no:13的保守修饰的变体、或包含规范结构类别3的seq id no:13的变体；所述cdrl2包含seq id no:20的氨基酸序列、seq id no:20的变体、seq id no:20的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:20的变体；所述cdrl3包含seq id no:25的氨基酸序列、seq id no:25的变体、seq id no:25的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:25的变体，所述cdrh1包含seq id no:27的氨基酸序列、seq id no:27的变体、seq id no:27的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:27的变体；所述cdrh2包含seq id no:34的氨基酸序列、seq id no:34的变体、seq id no:34的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的seq id no:34的变体，所述cdrh3包含seq id no:36的氨基酸序列、seq id no:36的变体、seq id no:36的保守修饰的变体、或包含规范结构类别6的seq id no:36的变体。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seq id no:104。

15、在还其它的实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:13的氨基酸序列、seq id no:13的变体、seq id no:13的保守修饰的变体、或包含规范结构类别3的seq id no:13的变体；所述cdrl2包含seq id no:16的氨基酸序列、seq id no:16的变体、seq id no:16的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:16的变体；所述cdrl3包含seq id no:22的氨基酸序列、seq id no:22的变体、seq id no:22的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:22的变体，所述cdrh1包含seq id no:30的氨基酸序列、seq id no:30的变体、seq id no:30的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:30的变体；所述cdrh2包含seq id no:31的氨基酸序列、seq id no:31的变体、seq id no:31的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的seq id no:31的变体，所述cdrh3包含seq id no:36的氨基酸序列、seq id no:36的变体、seq id no:36的保守修饰的变体、或包含规范结构类别6的seq id no:36的变体。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seq id no:104。

16、在还其它的实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:15的氨基酸序列、seq id no:15的变体、seq id no:15的保守修饰的变体或包含规范结构类别2a的seq id no:15的变体；所述cdrl2包含seq id no:18的氨基酸序列、seq id no:18的变体、seq id no:18的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:18的变体；所述cdrl3包含seq id no:24的氨基酸序列、seq id no:24的变体、seq id no:24的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:24的变体，所述cdrh1包含seq id no:29的氨基酸序列、seq id no:29的变体、seq id no:29的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:29的变体；所述cdrh2包含seq id no:33的氨基酸序列、seq id no:33的变体、seq id no:33的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的seq id no:33的变体，所述cdrh3包含seq id no:38的氨基酸序列、seq id no:38的变体、seq id no:38的保守修饰的变体、或包含规范结构类别11的seq id no:38的变体。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seq id no:104。在更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合seq id no:84内的至少一个氨基酸残基。

17、在还其它的实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:15的氨基酸序列、seq id no:15的变体、seq id no:15的保守修饰的变体或包含规范结构类别2a的seq id no:15的变体；所述cdrl2包含seq id no:21的氨基酸序列、seq id no:21的变体、seq id no:21的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:21的变体；所述cdrl3包含seq id no:26的氨基酸序列、seq id no:26的变体、seq id no:26的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:26的变体，所述cdrh1包含seq id no:29的氨基酸序列、seq id no:29的变体、seq id no:29的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:29的变体；所述cdrh2包含seq id no:35的氨基酸序列、seq id no:35的变体、seq id no:35的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的seq id no:35的变体，所述cdrh3包含seq id no:114的氨基酸序列、seq id no:114的变体、seq id no:114的保守修饰的变体、或包含规范结构类别11的seq id no:114的变体。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seqid no:84、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seq id no:104。

18、在其它的实施方案中，所述cdrl1包含seq id no:14的氨基酸序列、seq id no:14的变体、seq id no:14的保守修饰的变体、或包含规范结构类别4的seq id no:14的变体；所述cdrl2包含seq id no:17的氨基酸序列、seq id no:17的变体、seq id no:17的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:17的变体；所述cdrl3包含seq id no:23的氨基酸序列、seq id no:23的变体、seq id no:23的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:23的变体，所述cdrh1包含seq id no:28的氨基酸序列、seq id no:28的变体、seq id no:28的保守修饰的变体、或包含规范结构类别1的seq id no:28的变体；所述cdrh2包含seq id no:32的氨基酸序列、seq id no:32的变体、seq id no:32的保守修饰的变体和包含规范结构类别2a的seq id no:32的变体，所述cdrh3包含seq id no:37的氨基酸序列、seq id no:37的变体、seq id no:37的保守修饰的变体、或包含规范结构类别13的seq id no:37的变体。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102、seq id no:103和/或seqid no:104。在更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合seq id no:83、seq id no:84和/或seq id no:100内的至少一个氨基酸残基。在更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合下述精氨酸残基中的一个或多个氨基酸残基：seq id no：2的r62、r69、r72和r75。

19、本发明包括特异性地结合犬程序性死亡受体1(犬pd-1)的抗体和其抗原结合片段，当它们与犬pd-1结合时，所述抗体结合seq id no:103内的至少一个氨基酸残基。在这类的具体实施方案中，所述抗体和其抗原结合片段结合犬pd-1并阻断犬pd-1与犬程序性死亡配体1(pd-l1)的结合。在更具体的实施方案中，所述抗体和其抗原结合片段结合犬pd-1并也阻断犬pd-1与犬程序性死亡配体2(pd-l2)的结合，

20、因此，在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体(包括具有一个或多个变体cdr的抗体，例如，包括保守修饰的变体和/或包含确定的规范结构类别的变体在内的变体)结合以下一个或多个氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基：seq id no:83、seq id no:84、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102和/或seq id no:104。在甚至更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合下述精氨酸残基中的一个或多个氨基酸残基：seq id no:2的r62、r69、r72、r75和r90。在具体实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合seq id no:104内的至少一个氨基酸残基。在更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合下述精氨酸残基中的一个或多个氨基酸残基：seq id no:2的r62、r69、r72和r75。在甚至更具体的实施方案中，当与犬pd-1结合时，所述抗体或其抗原结合片段结合seq id no:2的r75。

21、本发明还提供了以低于1x10-12m(例如，1x10-13m或更低)的解离常数(kd)结合犬pd-1的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x10-5m至1x10-12m的解离常数结合犬pd-1。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x10-7m至1x10-11m的解离常数结合犬pd-1。在还更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x10-8m至1x10-11m的解离常数结合犬pd-1。在还更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x10-8m至1x10-10m的解离常数结合犬pd-1。

22、本发明还提供了以大于1x107m-1s-1的结合速率(kon)结合犬pd-1的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x102m-1s-1至1x107m-1s-1的结合速率结合犬pd-1。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x103m-1s-1至1x106m-1s-1的结合速率结合犬pd-1。在还更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x103m-1s-1至1x105m-1s-1的结合速率结合犬pd-1。在还更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x104m-1s-1至1x105m-1s-1的结合速率结合犬pd-1。

23、本发明还提供了以低于1x10-7s-1的解离速率(koff)结合犬pd-1的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在具体实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x10-3s-1至1x10-8s-1的解离速率结合犬pd-1。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x10-4s-1至1x10-7s-1的解离速率结合犬pd-1。在还更具体的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段以1x10-5s-1至1x10-7s-1的解离速率结合犬pd-1。

24、在有关的实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段刺激针对肿瘤或病原体的抗原特异性的记忆应答。在具体实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在体内刺激抗体应答。在其它具体实施方案中，所述哺乳动物抗体或其抗原结合片段在动物受试者中刺激免疫应答。在更具体的实施方案中，所述动物受试者是犬。在一个有关的实施方案中，所述动物受试者是猫科动物。

25、因此，本发明的任意抗体可以表现出1、2、3、4、5种或所有这些性质，即，前述与犬pd-1的解离常数，前述与犬pd-1的结合的结合速率，前述从抗体-犬pd-1结合复合物解离的解离速率，刺激针对肿瘤或病原体的抗原特异性的记忆应答，在体内刺激抗体应答，和/或在动物受试者中刺激免疫应答。

26、如上面指出的，包括前述抗体(和其抗原结合片段)在内的本发明的抗体(和其抗原结合片段)可以是单克隆抗体(和其抗原结合片段)、哺乳动物抗体(和其抗原结合片段)，例如，鼠(小鼠)抗体(和其抗原结合片段)、包括犬化鼠抗体(和其抗原结合片段)在内的犬化抗体(和其抗原结合片段)，且在某些实施方案中，所述抗体(和其抗原结合片段)是分离的。

27、本发明还提供了核酸(包括分离的核酸)，其编码本发明的犬化抗体的任一个轻链。类似地，本发明提供了分离的核酸，其编码本发明的犬化抗体的任一个重链。本文中提供了具体核苷酸序列的例子。

28、本发明还提供了表达载体，其包含一个或多个本发明的核酸(包括分离的核酸)。本发明还提供了宿主细胞，其包含一个或多个本发明的表达载体。

29、在具体实施方案中，所述抗体是重组抗体或其抗原结合片段。在有关的实施方案中，所述可变重链结构域和可变轻链结构域通过柔性接头连接以形成单链抗体。

30、在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是fab片段。

31、在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是fab'片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是(fab')2片段。在其它实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是双体。在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是结构域抗体。在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是骆驼源化的单结构域抗体。

32、在具体实施方案中，犬化鼠抗-犬pd-1抗体或抗原结合片段会增加正在治疗的犬受试者的免疫应答。

33、本发明还提供了分离的核酸，其编码犬化鼠抗-犬pd-1抗体或其部分。在有关的实施方案中，这样的抗体或抗原结合片段可以用于制备药物以治疗犬受试者中的癌症。可选地，或者联合地，本发明提供了本发明的任何抗体或抗体片段用于诊断应用的用途。在其它实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含本文中公开的任何犬化抗体或抗原结合片段。

34、在还其它实施方案中，提供了一种包含分离的核酸的表达载体，所述核酸编码本发明的任何犬化鼠抗-犬pd-1抗体或抗原结合片段。本发明也涉及一种宿主细胞，其包含本文描述的任何表达载体。在具体实施方案中，本发明的这些核酸、表达载体或多肽可用在制备抗体的方法中。

35、本发明还提供了由80个或更少氨基酸残基组成的抗原肽(包括分离的抗原肽)，所述抗原肽包含seq id no:103、和/或seq id no:83、和/或seq id no:84、和/或seq id no:99、和/或seq id no:100、和/或seq id no:101、和/或seq id no:102、和/或seq id no:104的氨基酸序列。在有关的实施方案中，所述抗原肽(包括分离的肽)由60个或更少氨基酸残基组成，所述抗原肽包含seq id no:103、和/或seq id no:83、和/或seq id no:84、和/或seq id no:99、和/或seq id no:100、和/或seq id no:101、和/或seq id no:102、和/或seq id no:104的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗原肽由10-44个来自seq id no:103的氨基酸序列的氨基酸残基组成。在还其它的实施方案中，所述抗原肽由15-45个来自seq id no:103的氨基酸序列的氨基酸残基组成。

36、本发明还提供了由80个或更少氨基酸残基组成的抗原肽(包括分离的肽)，其包含与seq id no:103、和/或seq id no:83、和/或seq id no:84、和/或seq id no:99、和/或seq id no:100、和/或seq id no:101、和/或seq id no:102、和/或seq id no:104具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列且结合分离的本发明的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在有关的实施方案中，所述抗原肽(包括分离的抗原肽)由60个或更少氨基酸残基组成，所述抗原肽包含与seq id no:103和/或seq id no:83、和/或seq id no:84、和/或seq id no:9、和/或seq id no:100、和/或seq id no:101、和/或seq id no:102、和/或seq id no:104具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列且结合分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段。在其它实施方案中，所述肽由10-44个氨基酸残基组成且结合分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，所述氨基酸残基来自与seq id no:103和/或seq id no:83、和/或seq id no:84、和/或seq id no:99、和/或seq id no:100、和/或seq id no:101、和/或seq id no:102、和/或seq id no:104具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述抗体是ib5。在其它的实施方案中，所述抗体是3b6。在其它具体实施方案中，所述抗体是2h9。在还其它实施方案中，所述抗体是2g9。在还其它的实施方案中，所述抗体是1a1。在其它实施方案中，所述抗体是1e4。

37、本发明还提供了包含任意前述抗原肽的融合蛋白。在一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含这样的抗原肽和非-犬哺乳动物igg抗体的fc区。在更具体的实施方案中，所述融合蛋白包含非-犬哺乳动物igg抗体的fc区。在某些实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是鼠igg。在可选实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是人igg。在其它实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是马igg。在还其它的实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是猪igg。在还其它的实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是牛igg。

38、在具体实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是igg1。在其它实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是igg2a。在还其它的实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是igg3。在还其它的实施方案中，所述非-犬哺乳动物igg抗体是igg4。

39、在其它实施方案中，所述融合蛋白包含任意前述抗原肽和麦芽糖结合蛋白。在还其它实施方案中，所述融合蛋白包含任意前述抗原肽和β-半乳糖苷酶。在还其它的实施方案中，所述融合蛋白包含任意前述抗原肽和谷胱甘肽s-转移酶。在还其它实施方案中，所述融合蛋白包含任意前述抗原肽和硫氧还蛋白。在其它的实施方案中，所述融合蛋白包含任意前述抗原肽和gro el。在还其它的实施方案中，所述融合蛋白包含任意前述抗原肽和nusa。

40、本发明还提供了核酸(包括分离的核酸)，其编码本发明的抗原肽和对应的融合蛋白。本发明还提供了包含这些核酸的表达载体。

41、另外，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗-犬pd-1抗体或其抗原结合片段、来自犬pd-1的抗原肽(包括分离的抗原肽)、本发明的包含来自犬pd-1的抗原肽的融合蛋白、本发明的编码抗原片段和/或融合蛋白的核酸(包括分离的核酸)、包含这样的核酸的表达载体、或它们的任意组合和药学上可接受的载体或稀释剂。

42、另外，本发明提供了增加免疫细胞的活性的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的这样的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在其它实施方案中，所述方法用于治疗感染或传染性疾病。在其它实施方案中，本发明的犬化抗体或其抗原结合片段用作疫苗佐剂。

43、通过参考以下附图说明和详细描述会更好地理解本发明的这些和其它方面。