专利名称:一株嗜碱细菌及其固态发酵生产碱性果胶酶的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域：
。
技术背景目前碱性果胶酶在生物工程领域的应用越来越广泛，其应用领域包括棉纤维的生物精练、植物韧皮纤维脱胶、造纸、处理果胶废水、咖啡和茶发酵、洗涤剂等。中国专利(公开号CN1480529A)中公开了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CCTCC NoM203042经液体深层发酵生产碱性果胶酶，可用于棉纺织物精练处理。中国专利(公开号CN1177003A)中公开了一株嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)CCTCCM96009能直接用于苎麻脱胶。中国专利(公开号CN1113951A)中公开了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CCTCC No0213经高浓度液态发酵生产碱性果胶酶。我们从碱性土壤中分离筛选出一株嗜碱细菌，具有很高的产碱性果胶酶能力，经鉴定为吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)，目前还未见用该菌株进行固态发酵生产碱性果胶酶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株嗜碱细菌吉氏芽孢杆菌S-2菌株，它具有很高的产碱性果胶酶能力；并提供一种利用该菌株固态发酵生产碱性果胶酶的方法。
该菌株是从碱性土壤中分离得到，筛选方法采用平板透明圈法。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1215。该菌株的16S rDNA与Bacillus gibsonii DSM No.8722菌株的相似性为99.6％，其DNA序列已递交到GenBank，可通过序列号AY737309查看。
采用该菌株进行固态发酵生产碱性果胶酶的步骤如下1、菌种保藏。菌种吉氏芽孢杆菌S-2菌株保藏于4℃冰箱内碱性琼脂培养基斜面，半年转接一次。培养基组成胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.2％，酵母浸膏0.3％，葡萄糖0.2％，氯化钠0.2％，磷酸氢二钾0.12％，碳酸钠0.3％，琼脂1.5％，于115℃灭菌15分钟。
2、种子培养。液体培养基组成胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.2％，酵母浸膏0.3％，葡萄糖0.2％，氯化钠0.2％，磷酸氢二钾0.12％，碳酸钠0.3％；于115℃灭菌15分钟。接种，30℃摇瓶培养24小时，既得液体种子。
3、固态发酵。产碱性果胶酶固态培养基是向含果胶固体生物质(甜菜粕、米糠、橘皮、苹果渣等)中添加3倍重量的营养液制成，营养液组成酵母浸膏1.0％，磷酸二氢钾0.15％，碳酸钠0.6％。甜菜粕和营养液分别于115℃灭菌15分钟，按重量比1∶3混合均匀，接种液体种子，于35℃静态培养72小时。
4、酶的提取和净化。固态发酵后的物料加入3倍重量的水，浸泡30分钟，在离心机中进行固液分离，提取液用孔径0.1μm的微滤膜过滤除去菌体，滤液用截留分子量为10000的超滤膜浓缩，收集浓缩液，即碱性果胶酶溶液，贮藏。
实施例1不同含果胶生物质及培养基不同湿度对产酶影响分别在5g(干重)含果胶固体生物质中加入1倍、2倍、3倍、4倍水，每分水中溶解有蛋白胨0.15g、磷酸二氢钾0.23g、碳酸钠0.09g，搅拌均匀，于35℃静态培养72小时。结果见表1。
表1各种含果胶生物质及培养基不同湿度对产酶影响含果胶生物质不同培养基湿度果胶酶产率(u/g生物质)1倍水 2倍水 3倍水 4倍水麸皮 365 240 185 155米糠 905 1050 830 665甜菜粕 1050 1345 1560 1260苹果渣 510 690 855 685桔皮粉 315 540 690 655注采用DNS法测定酶活，1个酶活力单位(u)定义为在55℃，pH10.5反应条件下，每分钟降解聚半乳糖醛酸钠产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶的量。
实施例2不同氮源对产酶的影响向甜菜粕中添加3倍重量的营养液，营养液组成不同氮源1.0％，磷酸二氢钾0.15％，碳酸钠0.6％。甜菜粕和营养液分别于115℃灭菌15分钟，按重量比1∶3混合均匀，接种液体种子，于35℃静态培养72小时。结果见表2。
实施例3不同碳酸钠添加量对产酶的影响向5克甜菜粕中添加15毫升营养液，营养液组成酵母膏1.0％，磷酸二氢钾0.15％，碳酸钠0-1.5％。甜菜粕和营养液分别于115℃灭菌15分钟，按重量比1∶3混合均匀，接种液体种子，于35℃静态培养72小时。结果见
图1。当碳酸钠0.6％时，产酶率最高，达到3500单位/克干菜渣。
表2不同氮源对产酶的影响氮源 相对酶活(％)蛋白胨 100酵母膏 151大豆蛋白胨 105酵母浸粉 126KNO386.0NaNO388.6麸皮 130豆饼粉 110鱼粉 115不添加氮源 43
权利要求
1.一株高产碱性果胶酶的嗜碱细菌及其固态发酵生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，该嗜碱细菌可以利用含果胶生物质(甜菜粕、米糠、麸皮、橘皮、苹果渣等)发酵合成碱性果胶酶；以含果胶生物质为碳源，加入氮源、磷酸盐、碳酸钠和水，接种该菌株，采用固态发酵方法合成碱性果胶酶。
2.权利要求
书1所述的嗜碱细菌，其特征在于，通过测定其16S rDNA序列，进行系统发育分析，鉴定该菌株为吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.1215。
3.权利要求
书1所述的固态发酵生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，发酵碳源为含果胶生物质，包括甜菜粕、水果加工残渣、米糠、麸皮等；氮源包括酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、豆饼粉、鱼粉、硝酸盐等。
4.权利要求
书1所述的固态发酵生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，培养基组成(w/w)果胶生物质20％-50％，氮源0.2％-1％，磷酸盐0.02％-0.5％，碳酸钠0.05％-0.5％，水50％-80％；培养温度20℃-37℃；静态培养48-72小时。
5.权利要求
书1所述的固态发酵生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，发酵后熟物用水浸提15-50分钟，离心或压滤除去残渣，得到水溶液即为碱性果胶酶水溶液；该酶液可以通过孔径0.1μm的微滤膜过滤除去菌体，再进行超滤浓缩制备成浓缩酶液或喷雾干燥制备成干粉便于贮藏。
专利摘要
本发明提供了一株高产碱性果胶酶的吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)S－2菌株，并提供了一种利用该菌株固态发酵制备果胶酶的方法。属于生物工程技术领域：
。发明以含果胶质的废弃生物质为碳源和诱导物，添加适当氮源、磷酸盐、碳酸钠和水分，接种吉氏芽孢杆菌S－2菌株，在接触空气条件下，于温度35℃左右，静态培养72小时左右达到产酶高峰。用水浸提培养物，过滤，滤液即碱性果胶酶液，超滤浓缩得到浓缩酶液或喷雾干燥得到碱性果胶酶干粉。经DNS法测定酶活力，果胶酶产率达到3500单位/克甜菜渣。(酶活力单位定义为在pH10.5，温度55℃条件下每分钟产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。)
文档编号C12N1/20GKCN1605627SQ200410073818
公开日2005年4月13日 申请日期2004年9月3日
发明者白志辉, 张保国, 李祖明, 张洪勋 申请人:中国科学院生态环境研究中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan