专利名称:一种新型干细胞、其筛选方法、试剂盒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞技术领域：
，具体而言，涉及一种新型成体干细胞、其筛选方法、试剂盒及其用途，特别是涉及通过化疗药物联合细胞标记的方法从啮齿动物、人类或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系样品中筛选获得的干细胞，更具体地，涉及采用化疗药物预先对细胞群进行处理，清除其中的增殖性细胞群，进而筛选、富集和激活其中的干细胞群，之后，采用可以标记干细胞的标记对其和或子代进行识别的筛选方法，特别地，涉及一种用于从混合细胞群中筛选和标记新型成体干细胞的试剂盒，筛选的新型成体干细胞在临床、基础与应用研究、治疗、组织工程、药物筛选、修复和再生失去功能的病变组织或器官中的应用。
技术背景
众所周知，干细胞具有下述特征1)长期的自我更新能力；2)能够产生高度分化的其它种类细胞；3)本身处于未分化状态；4) 一般处于慢周期或静息状态；5)组织中处于相应的小生境(niches)内。 干细胞包括胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞(Adult Stem Cells,ASCs),胚胎干细胞是全能性的,在理论上于体内可以再生身体内几乎任意组织，但由于其一方面在获取的伦理、道德等方面遇到了问题，另一方面其在应用上遇到了较为严重的问题，例如移植的胚胎干细胞可控性差，有生长为肿瘤的风险，并且其在移植受体后将会受到受体免疫系统的排斥等等，从而限制了其应用。
鉴于胚胎干细胞研究及应用所遇到的上述问题，科学家期望通过核编程的方式让成体细胞能够回到类胚胎干细胞的状态，经过几十年的研究，终于，在2006年日本科学家山中伸弥(YamanakaS, Cell, 2006126 (4) :663-676,日本专利 2008-131577)采用四个诱导因子0ct4、nanog、sox2等导入正常人成纤维细胞内，成功重编程其为类胚胎干细胞，被称为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs),该细胞具有类似人类胚胎干细胞的特性，它虽然与胚胎干细胞相似，具有能分化成生物体内所有组织的潜力，但是Lowry 和 Plath 发现(Lowry 等，Cell Stem Cell, 2009. 5 (I) :111-123),当进行分子标签比较的时候，胚胎干细胞中某些基因的表达明显与iPS细胞不同，与胚胎干细胞相比，iPS细胞研究仍有问题亟待解决，例如iPSCs具更高基因畸变频率(Loring等，Cell Stem Cell,2011.8(1) :106-118)、致瘤性风险、编程效率低等等需要克服，因而，尽管研究人员取得了令人印象深刻的进展，要把细胞再编程用于治疗疾病还需要更多一些突破。
成体干细胞是另外一类具有修复、再生、替代能力的未分化细胞类型，通常位于特定的小生境内，在受到外界损伤后，其会动员或者产生新的干细胞，通过增殖、分化的方式形成新的功能细胞，从而调节组织和器官细胞数量保持动态平衡。成体干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞得以发现。造血干细胞是目前研究的最为详尽的成体干细胞之一，在过去近40年里一直是干细胞领域研究的主题，它们在体内进行自我更新的细胞分裂，在单细胞水平分化为所有的造血成份，并在机能上使得重度骨髓抑制的动物和人的骨髓得以恢复。[0005]成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干/祖细胞的有效识别、筛选分离。最近越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织(Moore KA, Science, 2006. 311(5769) :1880-1885)，并且很可能是由处于静息态(细胞周期外且低代谢状态)和激活(细胞周期内且不能保留DNA标记)态的干细胞共存(Li等，Science, 2010. 327(5965) :542-545)，但从成体中分离干细胞仍是极具挑战性的任务，一方面在于其数量较少且更难于定位、筛选分离各种组织特异性干细胞，另外一方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识别。
当前，主要有以下现有技术公开了如何得到相关的成体干细胞
I)采用分子标志物筛选候选的干细胞，例如Thy-l1 或FLK2_Lineage_Sca-l+c-Kit+ 分选造血干细胞群(Christemsen JL 等，PNAS, 2001. 98 14541-14546 ；Uchida N 等，Experimental hematology,1996. 24 :649-659)，用 CD14.免疫磁性分离的方法从外周血筛选新的干细胞群(PCT/055950干细胞的提纯、识别及用途)用 a 6bri10G7dim(LiA 等，PNAS, 1998. 95(7) :3902-3907 ;Tani H 等，PNAS，2000. 97 (20)10960-10965 ；Lavker RM 等，PNAS，2000. 97 (25) :13473-13475)识别人类、啮齿动物来源的 上皮干细胞，但其有效性还有待进一步证实；
2)以其他技术联合分子标记进行干细胞的筛选、富集比如公开号为CN108677A的一种干细胞靶向定位富集的方法，采用针对干细胞表面标志性抗原的特异性抗体与干细胞结合，再标记上免疫磁珠，移植后通过两个异性磁极将干细胞富集于靶组织内。Azuma等研究小组者采用机械或酶消化分离后结合已知分子标志物的方法，希望从成体组织中直接分离出干/祖细胞，从而对其进行鉴别及后续的功能研究(AzumaH等，Hepatology,2003.37(6) :1385-1389 ；ffright N 等，Biochem Biophys Res Commun,2008. 366(2)367-372)。通过小鼠遗传学标志谱系试验等实验，结合所发现的分子标志物，例如Musashi-1、Lgr5 等提供了鉴定干细胞的可能(Barker N 等,Nature, 2007. 449 (7165)1003-1007 ；Haegebarth A 等，Am J Pathol, 2009. 174(3) :715-721)，然而它们的有效性还有待进一步证实。不足之处是，磁珠标记可能会影响细胞活力，而酶消化作用时间又较长，富集后细胞活力不高，且这些分离的细胞群并不是同质类型的，而是由许多不同分化状态或增殖能力的混合细胞群组成，非常不纯。
3)侧群筛选法(side population, SP)，分化程度较低的干/祖细胞通常表达一些ATP结合转运蛋白(ATP-binding cassette，ABC)，细胞常利用ATP能量把外来的有毒物质从细胞内排出，以达到保护自身的目的，早期Goodell等(Goodell等，J ExpMed, 1996. 183(4) =1796-1806)的研究发现，当用Hoechst33342对骨髓细胞进行染色后，造血干细胞具有很强的排出染液的能力，被称为侧群细胞。最近，Wulff等(Wulff等，Haematologica, 2003. 88 (4) :368-378)从小鼠肝内分离到一群 SP 细胞，CD45 丨或 CD45-细胞亚群，其所占的百分比为1%，体外培养均可产生肝系和造血系起源的克隆，类似的研究结果在人类的成体肝组织内也分离到类似的SP细胞。此方法已被用于从其他器官和组织中筛选潜在的干/祖细胞群，不足之处是，当从实体组织中筛选出SP细胞后，由于获得活细胞的能力有限，当此类细胞进行移植后可能影响他们的重塑能力。
4)采用损伤联合移植实验进行干细胞特性的研究，例如Li等(Li WL等，Stem cells, 2006. 24(2) :322-332)从倒千里光喊/ 部分肝切除(Retrorinine/PartialHepatectomy, Rs/PH)处理后成年小鼠的肝内分离到一种细胞群，在培养期间，其可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞，Li等认为这群细胞具有干/祖细胞潜能，被称为肝上皮祖细胞(liver epithelial progenitor cells, LEPCs)。移植实验提示其具有分化的潜能。然而类似的损伤试验加入的药物通常具有致癌特性，是否其导致组织中的细胞发生癌变，转变为具有干细胞特性的前体细胞尚不清楚。
5)根据核形态进行干细胞的鉴别，例如，PCT/021504专利公开了一种根据细胞核形态鉴定干细胞的方法，通过观察经处理后的组织样品中分布的细胞核形态，核形态型的类型选自钟形、雪茄形、凝聚球形、球形、卵形、香肠形、肾形和子弹形，从而允许显微组织学/病理学技术人员根据核形态，将细胞区分为干细胞/非干细胞。
6)幼年动物脉冲追踪法进行干细胞的识别，早期的研究发现，当加入可以“标记”DNA的标记后，与分裂迅速的祖细胞相比，干细胞由于其具有慢周期或静息期的特性而具有长期保留 DNA 标记的能力(Bickenbach JR, J Dent Res, 1981. 60 (Spec No C)1611-1620)，这一方法已经被用于识别小肠、子宫内膜、胰腺、肾乳头等组织中的干细胞。7)基于干细胞的功能特征，例如耐受药物或其他试剂的处理，报道了用于激活干细胞的方法，(Gordon MY 等，Leukemia research, 1985. 9 :1017-1021 ;Berardi AC 等，Science, 1995. 267 :104-108 ；Sharkis SJ 等，Stem ceHs，1997. 15(Suppl I) :41-44 ；Juopperi TA 等，Experimental hematology, 2007. 35 :335-341),且用一些分子表面标记物分离这些细胞，然而，不足之处，一方面在于是他们所使用的分子标记仍没有很强的特异性，且其中仍不清楚是否混杂有其它分期的祖细胞以及原先存在的增殖细胞，很可能其中仍是一个异质细胞群(Berardi AC等，Science，1995. 267 :104-108)，更重要的是，没有进一步采用可靠且普遍有效的方法用于识别这些激活的干细胞。
其他如公开号CN101768570的专利公开了一种富集和提取成体干细胞的方法，它采用一种多孔的三维组织工程材料埋植到人或动物体内，使得成体干细胞在材料中富集，从而分离得到干细胞。
上述所公开描述的方法或技术既有优势也有劣势，例如流式细胞分选法和免疫磁珠法分选往往是根据细胞表面特殊的标记来筛选分离干细胞，但目前特异的细胞表面标记很难达到共识，缺少特异性的分子表面标志，另外，需要借助专业人士的操作仪器来完成，分离时间较长，耗费较高，并且通过一定处理使之带上仪器能识别的标记，这种化学过程对细胞状态会造成一定的影响，操作不当甚至引起分化或导致细胞走向凋亡，另一方面，仪器分选效率不高，长时间的分选过程，导致细胞活力下降，细胞状态改变等等问题，这些并不适用于大批量筛选富集干细胞用于科研、临床等使用的需求。
再者，缺乏功能性证据表明LRCs具有干细胞的功能特征，并且BrdU并不是一个细胞表面标志(Blanpain等，Cell，2004. 118(5) :635-648);通过细胞核形态鉴别分离干细胞专业和经验要求高，易于出现鉴别错误，且操作过程和时间比较长。
因而，成体干细胞的研究也逐渐为临床医学提供了一个发展新疗法的机会，在组织工程和基因工程技术发展起来的细胞治疗和基因治疗是近年来生物医学领域中的研究热点和前沿，例如使用产生的自体经修饰后的干细胞直接施用给患者从而用于基因治疗(Nathalie Cartier 等，Science，2009. 326 (5954) :818-823)和细胞治疗，成体干细胞作为基因或细胞治疗的载体和首选靶细胞，其中一个益处是减少移植时引起的免疫排斥。[0018]成体干细胞在作为临床细胞治疗、药物筛选、人工组织的“种子库”，在肿瘤、创伤修复、组织或器官功能重建、各种退行性疾病的治疗等方面将发挥重要的作用。
据此，本领域需要克服现有技术中所存在的缺点，为了克服上述方法上的不足及提供进一步相关的优点，本发明人筛选到一种新型的成体干细胞群，采用一种简便、快捷的方法用于从细胞群中筛选、富集经化疗药物耐受性的干细胞，进而对激活的干细胞进行标记的系统方法，及建立一种筛选、识别所述干细胞的试剂盒，该试剂盒具有普遍适用性，进一步，本发明筛选获得的干细胞和/或子代在基础与临床应用研究、治疗、药物筛选、组织工程以及受损或患病组织的修复和再生中是极其有用的。
发明内容
本发明的目的在于公开一种从啮齿动物、人或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系等中筛选的新型成体干细胞，通过化疗药物联合细胞标记的方法，所述新型干细胞群可长期保留细胞标记。
本发明的另一目的在于公开一种从啮齿动物、人或其他哺乳动物的正常、肿瘤/ 癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系等细胞群中筛选成体干细胞的方法，该方法简便快捷、清除了细胞群中增殖性细胞的干扰，特异性强，激活了成体干细胞并对其和或子代进行了标记，实用有效。
本发明的次一目的在于公开一种从所述啮齿动物、人或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系等中筛选成体干细胞的试剂盒，该试剂盒具有使用简便、特异性强、实用有效，应用前景广泛的优点。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下一种新型成体干细胞，是以啮齿动物、人或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系等为原料，通过化疗药物联合细胞标记筛选而获得，其中，所述新型干细胞群可长期保留细胞标记。
本发明涉及本发明人预料之外的发现，预先加入一定浓度范围的化疗药物与含干细胞的细胞群接触后，其中所述细胞群中的增殖性细胞将会被清除，而其中的干细胞不会被杀死，可以耐受加入的化疗药物，因而得到了负向选择和进一步富集，且其可进一步被激活，之后，在采用细胞标记融合后，可进一步追踪所筛选的干细胞和或其子代。
所述筛选一种新型成体干细胞的方法及试剂盒具有通用性，简单而言，采用化疗药物把细胞群中的成体干细胞筛选出来，之后再采用细胞标记对筛选激活后的干细胞群进行识别，具体包括以下步骤
首先，一定浓度范围的所述化疗药物预先加入所述细胞群中，直接清除其中的增殖性细胞群，从而筛选、富集其中的干细胞群，
进一步，所述干细胞群经耐受性筛选后得到激活进入细胞周期，其中，加入细胞标记对筛选后激活的所述干细胞群和或其子代进行识别，
其中，所述化疗药物选择具有清除增殖性细胞并激活干细胞群作用的试剂或物质，其中，包括已知的化疗药物一种或两种以上的组合，
其中，所述标记细胞的标记选择BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或其子代的任一分子或物质。[0030]其中，上述筛选新型成体干细胞还包括采用分子标志对其和或子代进行进一步分型、识别。
进一步，可获得其所表达的特异性分子表面标志物。
进一步，所述从细胞群中筛选干细胞所使用的化疗药物包括任何已知的或潜在的可用于清除增殖性细胞的物质，包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、内亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合。
其中，所述使用的化疗药物的浓度约lmg/kg-100mg/kg细胞重量,进一步,所述化疗药物作用细胞群的时间为0. lh_72h。
进一步,所述使用的化疗药物的浓度也可选择约10mg/kg-50mg/kg细胞重量,其中，所述抗肿瘤/化疗药物作用细胞群的时间选择为0. 5h-36h。其中，所述标记细胞所使用的标记浓度约0. lmg/kg_15mg/kg细胞重量,其中，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为0. 01h-96h。
进一步,所述标记细胞所使用的标记浓度约0. 5mg/kg-10mg/kg细胞重量,其中，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为0. 05h-72h。
进一步，所述标记能够识别经耐受筛选的干细胞和或其子代的个数为一个或两个以上，
其中，所述细胞群的子代细胞也可保留标记，干细胞和或其子代可长期保留标记。
进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。
进一步，更优选的，所述筛选干细胞群所使用的化疗药物为抗代谢化疗药物、植物化疗药物、激素及内分泌化疗药物联合钼类化疗药物任--种的组合。
进一步，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、胰腺组织、肠组织、表皮组织、卵巢组织、输卵管组织、睾丸组织、神经组织、胃组织、肺组织、乳腺组织、脂肪组织、肌肉组织、甲状腺、间充质、脾脏组织、骨髓组织、外周血、脐带血、经血、胎盘、牙组织、眼组织和脑组织中的一种或两种以上所组成的组中。
其中，所述组织来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的活检或离体正常组织。
进一步，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自介于正常组织与癌/肿瘤性组织之间的啮齿动物、人类及其他哺乳动物来源的肿瘤/癌前任意病变组织。
进一步，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自肝癌、肾癌、胰腺癌、肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、肺癌、肝部转移瘤、肺转移瘤、肿瘤细胞系和或肿瘤/癌活检、离体组织等材料的一种或两种以上所组成的组中。
其中，肿瘤细胞系包括源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物的肿瘤组织建立的肿瘤细胞系。
本发明的另一目的在于提供一种从啮齿动物、人或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系等中筛选成体干细胞的方法，该方法简便快捷、清除了增殖性细胞的干扰，特异性强，激活了成体干细胞并对其和或子代进行了标记，实用有效。
进一步，本发明依据上述筛选方法从而获得正常干细胞、肿瘤干细胞和或其子代。[0048]进一步，本发明所述筛选识别的干细胞群或其后代有益于作为脏器疾病的细胞治疗、组织工程的细胞来源、药物筛选、基因治疗、修复和再生受损或患病组织、基础以及临床与应用研究中的应用。
根据本发明的另一个方面，本发明的次一目的是，提供一种筛选、识别新型成体干细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括
I)化疗药物；
2)细胞洗涤液；
3)细胞标记；
4)细胞因子组合；
5)描述使用方法的说明书，以及任选的；
6)混合容器和装置。
其中，所述化疗药物包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、激素及内分泌化疗药物、烷化剂化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合；
其中，所述化疗药物更优选择以抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物任一一种的组合；
其中，所述细胞洗涤液可为生理盐水、PBS、或其他缓冲液；
其中，所述标记细胞的标记选择BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质；
其中，所述细胞因子组合包括EGF、B27、bEGF、N2、H印arin、LIF为基础的细胞因子
组合；
其中，所述描述使用方法的说明书包括筛选、识别本发明的经耐受性筛选的新型成体干细胞的方法。
进一步，本发明所述试剂盒的标记干细胞携带的标记也可选择为磁性氧化铁标记、量子点标记、GFP标记、RFP标记或其他任何可以让所述筛选的干细胞和或子代携带可识别的标记。
进一步，本发明所述试剂盒筛选、识别的干细胞群来自啮齿动物、人类及其他哺乳动物的正常组织、细胞系、癌前组织、癌/肿瘤性组织、转移瘤/癌组织的一种或两种以上的组合。
进一步，采用单克隆抗体或多克隆抗体以特异性鉴定掺入的标记，所述抗体为免疫球蛋白分子，能够结合靶目标，本发明中所指标记，其结合方式是至少识别免疫球蛋白的可变区的一个抗原位点，本发明所述抗体不仅包括全抗体分子，也包括它们的片段，例如Fab、Fab’、Fv、单链(ScFv)等，或者它们的突变体，或者是包含抗体部分的融合蛋白，完全化的或部分化的人源化抗体及任何其他的被修饰的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含一个抗原结合位点。
进一步，所述抗体携带荧光素、生物素、放射性标记、酶标记、荧光底物标记、显色底物标记、化学发光标记等。
进一步，根据本发明的试剂盒筛选获得的新型成体干细胞作为基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复失去功能的病变组织或器官中的应用。
图I新型肝脏干细胞的筛选、识别
该图表明不同浓度的化疗药物联合BrdU标记筛选、识别新型肝脏干细胞，横坐标表示药物和标记加入的时间(h)，纵坐标表示细胞存活率及标记率(％)，分别表示药物卡培他滨及其浓度分别为2mg/mL、6mg/mL、I Omg/mL、14mg/mL、2 Omg/mL,细胞存活及标记率的曲线变化，每个梯度重复3个孔，对应加入的标记浓度均为0. 5mg/kg细胞重量。药物作用时间为16小时，每隔4小时取样进行存活率检测，其中，标记每隔12小时加入一次，作用总时间为24小时，其中，每6小时取样进行标记检测。
图2新型心脏干细胞的筛选、识别
该图表明不同浓度的化疗药物联合IdU标记筛选、识别新型心脏干细胞，横坐标 表示药物和标记加入的时间(h)，纵坐标表示细胞存活率及标记率(％)，分别表示药物丝裂霉素及其浓度分别为4mg/mL、10mg/mL、18mg/mL、24mg/mL、28mg/mL,细胞存活及标记率的曲线变化，每个梯度重复3个孔，对应加入的标记浓度均为0. 8mg/kg细胞重量。药物作用时间为24小时，每隔6小时取样进行存活率检测，其中，标记每隔6小时加入一次，作用总时间为24小时，其中，每6小时取样进行标记检测。
图3从肝癌中筛选新型的癌干细胞并对其进行识别
该图表明不同化疗药物联合BrdU标记从肝癌中筛选、识别新型肝癌干细胞，横坐标表示药物和标记加入的时间(h)，纵坐标表示细胞存活率及标记率(％)，分别表示药物氟尿喃唳、环磷酰胺、卡钼及其加入浓度对应为I Omg/mL、4mg/mL、4mg/mL,细胞存活及标记率的曲线变化，每个梯度重复3个孔，对应加入的标记浓度均为2mg/kg细胞重量。药物作用时间为16小时，每隔4小时取样进行存活率检测，其中，标记每隔12小时加入一次，作用总时间为36小时，其中，每12小时取样进行标记检测。
图4从分离的离体乳腺癌组织中筛选新型的乳腺癌干细胞
该图表明不同化疗药物联合BrdU标记从乳腺癌中筛选、识别新型乳腺癌干细胞，横坐标表示药物和标记加入的时间(h)，纵坐标表示细胞存活率及标记率(％ )，分别表示药物氟尿卩密唳、紫杉醇、卡培他滨、环磷酰胺及其加入浓度对应为2mg/mL、I Omg/mL、I Omg/mL、2mg/mL，细胞存活及标记率的曲线变化，每个梯度重复3个孔，对应加入的标记浓度均为5mg/kg细胞重量。药物作用时间为8小时,每隔2小时取样进行存活率检测,其中,标记每隔12小时加入一次，作用总时间为48小时，其中，每12小时取样进行标记的检测。
图5从肺癌细胞系中筛选肺癌干细胞
该图表明不同化疗药物联合BrdU标记从肺癌细胞系中筛选、标记新型肺癌干细胞，横坐标表示药物和标记加入的时间(h)，纵坐标表示细胞存活率及标记率(％)，分别表示药物顺钼、紫杉醇、足叶乙苷及其加入浓度对应为20mg/mL、5mg/mL、15mg/mL，细胞存活及标记率的曲线变化，每个梯度重复3个孔，对应加入的标记浓度均为4mg/kg细胞重量。药物作用时间为10小时，每隔2. 5小时取样进行存活率检测，其中，标记每隔12小时加入一次，作用总时间为32小时，其中，每8小时取样进行标记的检测。
图6筛选、识别新型干细胞的试剂盒组成[0078]该图表明了筛选、识别新型干细胞的试剂盒的组成，包括盒体、盒体内设有放置试剂瓶的相应卡位槽，盒体内放置有设置封闭盖的6个试剂瓶、及使用说明书，试剂盒(I)包括筛选、识别试剂瓶组合(2)，细胞洗涤试剂瓶(5)，细胞因子试剂瓶￠)，混合容器或装置，其中(2)包括筛选试剂瓶(3)及对应混合容器(7)、识别试剂瓶(4)及对应混合容器
(8)，所述试剂瓶(3)、(4)、(5)、(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述(7)专用于混合化疗药物试剂，所述(8)专用于混合细胞标记。所述6个试剂瓶的形状不限、其内含物是无菌，且其瓶塞可为压力、螺丝或其他。
具体实施方式
以下结合具体实施例以详细说明本发明的优点，本领域的技术人员应当理解，本发明的实施例目的是为了清楚的说明本发明的优点，并不是用于限制本发明，任何基于本发明的修饰、替换、改变均落在本发明的精神范畴和保护范围之内。
本发明提供了一种新型成体干细胞，其中所述干细胞是从啮齿动物、人或其他哺 乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系等中通过化疗药物联合细胞标记筛选获得，其中所述新型干细胞群长期保留细胞标记。
其中，本发明所述的新型成体干细胞源自正常的肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、胰腺组织、小肠组织、表皮组织、卵巢组织、睾丸组织、神经组织、胃组织、肺组织、乳腺组织、脂肪组织、骨髓组织、脑组织、眼组织、肌肉组织、甲状腺等组织中的一种或两种以上所组成的组中。
其中，所述细胞源源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物的活检或离体组织。
其中，本发明所述的新型成体干细胞源自肿瘤/癌前组织，包括介于正常和病变组织之间的啮齿动物、人或其他哺乳动物的病变组织。
其中，本发明所述的新型成体干细胞源自肿瘤/癌性组织，转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系，包括肝肿瘤/癌、肾肿瘤/癌、胰腺肿瘤/癌、肠肿瘤/癌、卵巢肿瘤/癌、乳腺肿瘤/癌、脑肿瘤/癌、肺肿瘤/癌、睾丸肿瘤/癌、皮肤肿瘤/癌、血液癌、肝部转移瘤、肺转移瘤、脑转移瘤、肿瘤/癌离体组织、肝癌细胞系、肺癌细胞系、卵巢癌细胞系等一种或两种以上的组中。
本发明涉及本发明发明人预料之外的发现，预先加入一定范围的化疗药物与含干细胞的细胞群接触后，其中的增殖性细胞将会被清除，而干细胞可以耐受化疗药物不会被杀死，因而得到了负向选择和进一步富集，且其可被激活，在加入细胞标记融合后，可进一步追踪所筛选的干细胞和或其子代。
因此，本发明提供了一种筛选新型成体干细胞的方法，该方法具有通用性，简单而言，包括采用化疗药物预先加入所述细胞群中，直接清除其中的增殖性细胞群，对干细胞进行了负向耐药性筛选，特异性强，简便快捷，从而筛选、富集和激活其中的成体干细胞，之后通过细胞标记针对激活后的干细胞和或其子代进行标记，具体包括以下步骤
首先，一定浓度范围的化疗药物预先加入所述细胞群中，直接清除其中的增殖性细胞群，从而筛选、富集其中的干细胞群，
进一步，所述干细胞群经耐受性筛选后激活进入细胞周期，其中，加入细胞标记对筛选后激活的所述干细胞群和或其子代进行识别，[0089]其中，所述化疗药物选择具有清除增殖性细胞并激活干细胞群作用的试剂或物质，其中，包括已知的化疗药物一种或两种以上的组合，
其中，所述标记细胞的标记选择BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质。
其中，上述筛选新型成体干细胞还包括采用分子标志对其进行进一步分型、识别。
进一步，获得所述干细胞表达的特异性分子表面标志物。
进一步，所述从细胞群中筛选干细胞所使用的化疗药物包括任何已知的或潜在的可用于清除增殖性细胞的物质，包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合。其中，所述使用的化疗药物的浓度约lmg/kg-100mg/kg细胞重量,进一步,所述化疗药物作用细胞群的时间范围为0. lh_72h，优选的，所述使用的化疗药物的浓度也可选择约10mg/kg-50mg/kg细胞重量，其中，所述抗肿瘤/化疗药物作用细胞群的时间选择为0. 5h-36h，更优选的，所述使用的化疗药物作用细胞群的时间选择为2h-24h。
其中，所述抗肿瘤/化疗药物与细胞群作用的次数可以为一次，也可选择为多次作用，例如分1-10次，优选的，分2-6次作用。
其中，所述细胞标记与细胞群作用的次数可以为一次，也可选择为多次作用，例如分1-20次，优选的，分4-10次作用。
其中，所述标记细胞所使用的标记浓度约0. lmg/kg_15mg/kg细胞重量,进一步，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为0. 01h_96h，优选的，所述标记细胞所使用的标记浓度约0. 5mg/kg-10mg/kg细胞重量，其中，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为 0. 05h-72h。
进一步，所述标记能够识别经耐受筛选的干细胞和或其子代的个数为一个或两个以上，
其中，所述细胞群的子代细胞也可掺入标记，干细胞和或其子代可长期保留标记。
进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。
进一步，所述化疗药物更优选择以抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗
药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物任一一种的组合。
进一步，有益于以已知的或未知的分子标志物对所述干/祖细胞群或其子代进行进一步的筛选、分型。
进一步，所述化疗药物作用于啮齿动物、人类及其他哺乳动物来源的活检或离体正常肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、胰腺组织、肠组织、表皮组织、卵巢组织、输卵管组织、睾丸组织、神经组织、胃组织、肺组织、乳腺组织、脂肪组织、肌肉组织、甲状腺、间充质、脾脏组织、骨髓组织、外周血、脐带血、经血、胎盘、牙组织、眼组织和脑组织中的一种或两种以上所组成的组中。
进一步，所述化疗药物作用于介于正常组织与癌/肿瘤性组织之间的啮齿动物、人类及其他哺乳动物来源的肿瘤/癌前病变组织。[0105]进一步，所述化疗药物作用于啮齿动物、人类及其他哺乳动物来源的活检或离体肝癌、肾癌、胰腺癌、肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、肺癌、肝部转移瘤、肺转移瘤、肿瘤细胞系和或肿瘤/癌离体组织等的一种或两种以上所组成的组中。
进一步，本发明依据上述筛选方法从而获得正常干细胞、肿瘤干细胞和或其子代。
进一步，本发明所述筛选的干细胞群或细胞系或者其后代作为脏器疾病的细胞治疗、组织工程的细胞来源、药物筛选、基因治疗、修复和再生受损或患病组织、基础以及临床与应用研究中的应用。
在本发明的优选实施方式中，优选的细胞标记选择为BrdU，进一步，细胞标记的物质也可选择为氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其它可以长期标记此述细胞群或细胞系或者其后代的分子。
在本发明的一个优选实施方式中，其中，实施方式优选的可标记所述干细胞的标 记为BrdU，细胞所保留的标记是BrdU分子，其中所述细胞群或其子代是并且持续是BrdU阳性(BrdUl )。取材肝脏组织，处理后获得细胞群，所述细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物肝脏的离体或活检组织，优选的药物为卡培他滨，在培养基中的终浓度为2mg/mL，作用细胞群的时间为16小时(h)，每隔4小时检测细胞存活率，所述标记给予剂量0. 5mg/kg细胞重量，在37°C，5% CO2条件下，优选每隔12h加入标记一次，共作用24h。
进一步，采用不同浓度梯度的卡培他滨(6mg/mL、10mg/mL、14mg/mL、20mg/mL)处理细胞群，每个浓度下重复3个孔，每个浓度下加入相应标记(0. 5mg/kg细胞重量)对激活 的干细胞群进行识别，之后所述细胞群在含细胞因子组合的培养基中，37°C、5% CO2条件下培养，其中，所述培养基优选为DMEM/F12K，并添加青霉素和链霉素，浓度分别为100U/mL和100 u g/mL,其中，BrdU所标记的干/祖细胞数量为一个或多个干/祖细胞,进一步包括标记所述细胞群的子代，其中采用已知的分子标志物以进步识别BrdU+标记的细胞群或其子代细胞，进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。
其中，包括进一步筛选所述细胞群表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知或未知的分子或物质筛选分离所述细胞群或其子代对研究和应用是非常有益的，均属于本发明的精神范畴和保护范围。
在本发明的另一个优选实施方式中，其中，实施方式优选的可标记所述干细胞的标记为IdU，细胞所保留的标记是IdU分子，其中所述细胞群或其子代是并且持续是IdU阳性(IdU+)。取材心脏组织，处理后获得细胞群，所述细胞群来源于啮齿动物、人或其他哺乳动物心脏组织、活检或离体新鲜心脏组织，优选的药物为丝裂霉素，在培养基中的终浓度为4mg/mL,作用细胞群的时间为24小时，每隔6小时取样进行存活率检测，所述标记给予剂量0. 8mg/kg细胞重量,在37°C,5% CO2条件下,优选每隔6h加入标记一次,共分4次加入,共作用24h。进一步,采用不同浓度梯度的丝裂霉素(10mg/mL、18mg/mL、24mg/mL、28mg/mL)处理细胞群，细胞群在每个浓度下重复3个孔，之后每个浓度下加入相应标记(0. 8mg/kg细胞重量)对激活的干细胞群进行识别，之后所述细胞群在含细胞因子组合的培养基中，37°C、5% CO2条件下培养，其中，所述培养基优选为DMEM/F12K，并添加青霉素和链霉素，浓度分别为100U/mL和IOOii g/mL，其中，IdU所标记的干/祖细胞数量为一个或多个干/祖细胞，进一步包括标记所述细胞群的子代，其中采用已知的分子标志物以进一步识别IdU+标记的细胞群或其子代细胞，进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。
其中，包括进一步筛选所述细胞群表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知或未知的分子或物质筛选分离所述细胞群或其子代对研究和应用是非常有益的，均落在本发明的精神范畴和保护范围内。
在本发明的另一个优选实施方式中，其中，实施方式优选的可标记所述干细胞的标记为BrdU,细胞所保留的标记是BrdU分子,其中所述细胞群或其子代是并且持续是BrdU阳性(BrdUl )。取材肝癌组织，处理后获得肝癌细胞群，所述细胞群来源于啮齿动物、人或其他哺乳动物的活检或离体新鲜肝癌组织，优选的药物组合为氟尿嘧啶、环磷酰胺、卡钼，在培养基中的终浓度分别为10mg/mL、4mg/mL、4mg/mL,作用细胞群的时间为16小时,每隔4小时取样进行存活率检测，每个浓度下重复3个孔，所述标记给予剂量2mg/kg细胞重量，在37°C,5% CO2条件下，优选每隔12h加入标记一次，共分3次加入，共标记作用36h，之后所述细胞群在含细胞因子组合的培养基中，37°C、5% CO2条件下培养，其中，所述培养基优选为DMEM/F12K，并添加青霉素和链霉素，浓度分别为100U/mL和IOOy g/mL。其中，BrdU所标记 的肝癌干细胞的数量为一个或多个，进一步包括标记所述细胞群的子代，其中采用已知的分子标志物以进一步识别BrdU+标记的细胞群或其子代细胞，其中，包括进一步筛选所述细胞群表达的分子标志物，进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。应当理解，采用任何已知或未知的分子或物质筛选分离所述细胞群或其子代对研究和应用是非常有益的，均属于本发明的精神范畴和保护范围。
在本发明的另一个优选实施方式中，其中，实施方式优选的可标记所述干细胞的标记为BrdU,细胞所保留的标记是BrdU分子,其中所述细胞群或其子代是并且持续是BrdU阳性(BrdU+)。取材离体乳腺癌组织，处理后获得细胞群，所述细胞群来源于啮齿动物、人或其他哺乳动物的乳腺癌切除或活检，优选的药物组合为氟尿嘧啶、紫杉醇、卡培他滨、环磷酰胺，在培养基中的终浓度分别为2mg/mL、IOmg/mL、IOmg/mL、2mg/mL,作用细胞群的时间为8小时,每隔2小时取样进行存活率检测,所述标记给予剂量5mg/kg细胞重量,在37°C,5% CO2条件下，优选每隔12h加入标记一次，共分3次加入，共标记作用36h，之后所述细胞群在含细胞因子组合的培养基中，37°C>5% CO2条件下培养，其中，所述培养基优选为DMEM/F12K，添加青霉素和链霉素，浓度分别为100U/mL和IOOy g/mL。其中，BrdU所标记的乳腺癌干细胞的数量为一个或多个，进一步包括标记所述细胞群的子代，其中采用已知的分子标志物以进一步识别BrdU+标记的细胞群或其子代细胞，进一步，所述子代由潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。
其中，包括进一步筛选所述细胞群表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知或未知的分子或物质筛选分离所述细胞群或其子代对研究和应用是非常有益的，均属于本发明的精神范畴和保护范围。
在本发明的另一个优选实施方式中，其中实施方式优选的可标记所述干细胞的标记为BrdU，细胞所保留的标记是BrdU分子，其中所述细胞群或其子代是并且持续是BrdU阳性(BrdU+)。肺癌细胞系，所述细胞系来源于啮齿动物、人或其他哺乳动物的肺癌切除或活检，优选的药物组合为顺钼、紫杉醇、足叶乙苷，在培养基中的终浓度分别为20mg/mL、5mg/mL、15mg/mL,每个浓度下重复3个孔,所述标记给予剂量4mg/kg细胞重量,在37°C,5% CO2条件下，优选每隔5h加入标记一次，共分2次加入，共标记作用10h，之后所述细胞群在含细胞因子的培养基中，37°C、5%C02条件下培养。其中，BrdU所标记的肺癌干细胞的数量为一个或多个，进一步包括标记所述细胞群的子代，其中采用已知的分子标志物以进一步识别BrdU+标记的细胞群或其子代细胞，进一步，所述子代山潜能受限的祖细胞、短暂增殖细胞、分化细胞、前体细胞或非干/祖细胞的一种或多种组成。
其中，包括进一步筛选所述细胞群表达的分子标志物，应当理解，采用任何已知或未知的分子或物质筛选分离所述细胞群或其子代对研究和应用是非常有益的，均落在本发明的精神范畴和保护范围内。
在本发明的另一个实施方案中，还涉及一种筛选、识别新型成体干细胞的试剂盒， 其中，所述试剂盒包括
I)化疗药物；
2)细胞洗涤液；
3)细胞标记；
4)细胞因子组合；
5)描述使用方法的说明书，以及任选的；
6)混合容器和装置。
其中，所述化疗药物包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合；
其中，所述化疗药物更优选择以抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物任一一种的组合；
其中，所述细胞洗涤液可为生理盐水、PBS、或其他缓冲液；
其中，所述标记细胞的标记选择BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙块基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质；
其中，所述细胞因子组合包括EGF、B27、bEGF、Heparin, N2、HF为基础的细胞因子组合，进一步，所述EGF在干细胞培养时添加,至终浓度为5ng/mL-100ng/mL,优选IOng/mL-50ng/mL,所述bFGF在干细胞培养时添加，至终浓度为5ng/mL-100ng/mL,优选IOng/mL-50ng/mL,所述Heparin在干细胞培养时添加，至终浓度为2 y g/mL-40 u g/mL,所述B27、N2在干细胞培养时添加，至终浓度为2ng/mL-50ng/mL，优选10ng/mL-30ng/mL，所述LIF (白血病抑制因子)在干细胞培养时添加，至终浓度为100U/mL-1500U/mL，优选500U/mL-1000U/mL。
其中，所述描述使用方法的说明书包括筛选本发明的经耐受性筛选的新型成体干细胞的方法。
其中，所述筛选、识别新型干细胞试剂盒(I)包括筛选、识别试剂瓶组合(2)，细胞洗涤试剂瓶(5)，细胞因子试剂瓶￠)，混合容器或装置，其中(2)包括筛选试剂瓶(3)及对应混合容器(7)、识别试剂瓶(4)及对应混合容器(8)，所述试剂瓶(3)、(4)、(5)、(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述(7)专用于混合化疗药物试剂，所述(8)专用于混合细胞标记。
其中，各种所述试剂瓶的形状不限，且其瓶塞可为压力、螺丝或其他。
进一步，所述试剂瓶其内含物是无菌的，其中，内毒素含量< 0. 5EU/mL。
其中，所述盛放试剂的材料为常用于试剂存放的材料制成，进一步，所述材料不影响试剂的活性。
进一步，本发明所述试剂盒的标记干细胞携带的标记也可选择为磁性氧化铁标记、量子点标记、GFP标记、RFP标记或其他任何可以让所述筛选的干细胞和或子代携带的
I■■己 O
进一步，本发明所述试剂盒筛选、识别的干细胞群来自啮齿动物、人类及其他哺乳动物的正常组织、细胞系、癌前组织、癌/肿瘤性组织、转移瘤/癌组织的一种或两种以上的 组合。
进一步，采用单克隆抗体或多克隆抗体以特异性鉴定掺入的标记，所述抗体为免疫球蛋白分子，能够结合靶目标，本发明中指标记，其结合方式是至少识别免疫球蛋白的可变区的一个抗原位点，本发明所述抗体不仅包括全抗体分子，也包括它们的片段，例如Fab、Fab’、Fv、单链(ScFv)等，或者它们的突变体，或者是包含抗体部分的融合蛋白，完全化的或部分化的人源化抗体及任何其他的被修饰的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含一个抗原结合位点。
进一步，所述抗体携带荧光素、生物素、放射性标记、酶标记、荧光底物标记、显色底物标记、化学发光标记等。
进一步，根据本发明的试剂盒筛选获得的新型成体干细胞作为基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复失去功能的病变组织或器官中的应用。
实施例I新型肝脏干细胞的筛选、识别
取材肝脏组织，肝脏组织来源于啮齿动物、人或其他哺乳动物正常肝组织，活检或离体肝组织，之后用PBS缓冲液清洗组织2 3次，再用眼科剪将肝脏组织剪碎成约Imm3的小块，加入胰酶(浓度为0. 1% 0. 3% )后在37°C消化IOmim 60min，加入与胰酶溶液体积等量的含10%胎牛血清的DMEM/F12K(美国Hyclone公司)终止反应，低温以800 IOOOg离心3mim 5min,丢弃上清,加入低温预冷的含2%胎牛血清的PBS洗漆沉淀2 3次，用无菌100目 400目筛网过滤，从而滤出细胞悬液，台盼蓝染色活细胞彡96.7%。
将所述分离的原代细胞群接种于细胞培养瓶或细胞培养板或培养皿内，37°C，5 %CO2条件下培养，预先加入化疗药物卡培他滨，在培养基中的终浓度为2mg/mL，在37°C，5 %CO2培养条件下作用16h，之后，收集细胞。
I)每隔4小时收集细胞进行检测，低温以830g离心3mim 5min，丢弃上清，I X PBS洗涤，计算细胞存活率。
2)收集处理后的细胞再次接种，其中含有5ng/mL的B27、10ng/mL的N2、8ng/mL的EGF> lOng/mL 的 bFGF、5ii g/mL 的 Heparin, 800U/ml 的 LIF。
3)随后加入BrdU标记对筛选、激活后的干细胞进行识别，其中，所述BrdU标记在培养基中的终浓度为0. 5mg/kg细胞重量，在37°C，5% CO2条件下，每隔12h加入标记一次，共作用24h后，收集细胞。
4)每隔6小时进行细胞标记的检测，低温以830g离心3mim 5min丢弃上清，I X PBS洗涤，取50 i! L进行免疫组化检测BrdU标记的百分比。
5)细胞培养至细胞60%融合，重复步骤1)-3)的操作四次，卡培他滨的终浓度分别为6mg/mL、10mg/mL、14mg/mL和20mg/mL,细胞群在每个浓度下重复3个孔。
6)加入化疗药物卡培他滨，在培养基中的终浓度为20mg/mL，在37°C ,5% CO2条件下作用16h，收集细胞，低温以830g离心3mim 5min，丢弃上清，IXPBS洗涤，细胞计数，收集处理后的细胞再次接种于细胞培养瓶或细胞培养板内，其中，含有5ng/mL的B27、10ng/mL 的 N2、8ng/mL 的 EGF、10ng/mL 的 bFGF,5 u g/mL 的 Heparin, 800U/ml 的 HF,在 37°C ,5%CO2条件下进行培养至细胞60%融合。
7)重复上述步骤6)培养I次。
8)加入化疗药物卡培他滨，在培养基中的终浓度为20mg/mL，在37°C ,5% CO2条件下培养，最后获得稳定数量的肝脏干细胞，所述干细胞可用于基础与应用研究、治疗、定向诱导分化、组织工程、修复或再生受损或病变组织中使用。
实施例2新型心脏干细胞的筛选、识别
取材心脏组织，心脏组织来源于啮齿动物、人或其他哺乳动物正常心组织，活检或离体新鲜心组织，之后用PBS缓冲液清洗组织2 3次，再用眼科剪将心脏组织剪碎成约0. 5 Imm3的小块，加入胶原酶(浓度为2 10mg/mL)后在37°C消化IOmim 30min,加入与胶原酶溶液体积等量的含10%胎牛血清的DMEM/F12K(美国Hyclone公司)终止反应，低温以900g离心3mim 5min,丢弃上清,加入低温预冷的含2%胎牛血清的PBS洗漆沉淀2 3次，用无菌200 400目筛网过滤，从而滤出细胞悬液，台盼蓝染色活细胞彡95%。
将所述细胞群接种于6孔细胞培养板内，370C ,5% CO2培养，预先加入化疗药物丝裂霉素，在培养基中的终浓度为4mg/mL，在37°C，5% CO2培养条件下作用24h，之后，收集细胞。
I)每隔6小时收集细胞进行检测，低温以900g离心3mim 5min，丢弃上清，I X PBS洗涤，计算细胞存活率。
2)收集处理后的细胞再次接种于6孔细胞培养板对应孔内，其中含有10ng/mL的B27、10ng/mL 的 N2、30ng/mL 的 EGF、30ng/mL 的 bFGF、10 u g/mL 的 Ifeparin，600U/ml 的 LIF，在37°C，5% CO2条件下进行培养。
3)随后加入IdU标记对筛选、激活后的心脏干细胞进行标记，其中，所述IdU标记在培养基中的终浓度为0. 8mg/kg细胞重量，在37°C，5% CO2条件下作用24h，共分4次加入，即每隔6小时加入一次，之后收集细胞。
4)每隔6小时进行细胞标记的检测，低温以900g离心3mim-5min丢弃上清，I X PBS洗涤，取50 ii L进行免疫组化检测IdU标记的百分比。
5)培养至细胞60%融合，重复步骤1)-3)的操作四次，丝裂霉素的终浓度分别为10mg/mL、18mg/mL、24mg/mL和28mg/mL细胞群在每个浓度下重复3个孔。
6)加入化疗药物丝裂霉素，在培养基中的终浓度为28mg/mL，在37°C ,5% CO2培养条件下作用24h，收集细胞，低温以900g离心3mim 5min，丢弃上清，IXPBS洗涤2次，细胞计数，收集处理后的细胞再次接种于6孔细胞培养板对应孔内，其中含有10ng/mL的B27、lOng/mL 的 N2、30ng/mL 的 EGF、30ng/mL 的 bFGF、10 u g/mL 的 Heparin, 600U/ml 的 LIF,在37°C,5% CO2条件下进行培养至细胞60%融合。[0161]7)重复上述步骤7)培养I次。
8)加入化疗药物丝裂霉素，在培养基中的终浓度为28mg/mL，在37°C ,5% CO2条件下培养，最后获得稳定数量的心脏干细胞，所述干细胞可用于分子表面标志分析、基础与应用研究、治疗、定向诱导分化、组织工程、修复受损或患病心脏等中使用。
实施例3从肝癌中筛选新型的癌干细胞
取材肝癌组织，肝癌组织来源于啮齿动物、人或其他哺乳动物的肝癌组织、活检或离体新鲜肝癌组织，之后用PBS缓冲液清洗组织2 3次，再用眼科剪将肝癌组织剪碎成约Imm3的小块，加入胰酶(浓度为0. 1% 0. 3% )和胶原酶(浓度为浓度为I 10mg/mL)后在37°C消化5mim 60min，加入与酶溶液体积等量的含10%胎牛血清的DMEM/F12K(美国Hyclone公司)终止反应,轻轻吹打细胞悬液2 3次,低温以800 IOOOg离心3mim 5min，丢弃上清，加入低温预冷的含2%胎牛血清的PBS洗涤沉淀两至三次，用无菌200目-400目筛网过滤，从而滤出细胞悬液，台盼蓝染色活细胞彡96%。将所述分离的原代细胞群接种于细胞培养瓶或细胞培养板内，37°C，5% CO2培养，预先加入化疗药物氟尿嘧啶、环磷酰胺、卡钼，在培养基中的终浓度分别为10mg/mL、4mg/mL、4mg/mL，在37°C，5% CO2培养条件下作用16h，之后，收集细胞。
I)每隔4小时收集细胞进行检测，低温以900g离心3mim 5min，丢弃上清，I X PBS洗涤，计算细胞存活率。
2)收集处理后的细胞再次接种，其中含有10ng/mL的B27、5ng/mL的N2、5ng/mL的EGF、5ng/mL 的 bFGF、10u g/mL 的 Heparin,900U/ml 的 LIF。
3)随后加入BrdU标记对筛选、激活后的肝癌干细胞进行标记，其中，所述BrdU标记在培养基中的终浓度为2mg/kg细胞重量，在37°C，5% CO2条件下，每隔12h加入标记一次，共作用36h后，收集细胞。
4)每隔12小时进行细胞标记的检测，低温以900g离心3mim 5min丢弃上清，I X PBS洗涤，取50 ii L进行免疫组化检测BrdU标记的百分比。
5)收集处理后的细胞再次接种于细胞培养瓶或细胞培养板内，其中，10ng/mL的B27、5ng/mL 的 N2、5ng/mL 的 EGF、5ng/mL 的 bFGF、10 u g/mL 的 Ifeparin，900U/ml 的 L1F，在37V, 5% CO2条件下进行培养至细胞60%融合，再次加入化疗药物氟尿嘧啶、环磷酰胺、卡钼，在培养基中的终浓度分别为10mg/mL、4mg/mL、4mg/mL，在37°C，5% CO2培养条件下作用16h，之后，收集细胞。
6)重复上述步骤5)培养2次，由此获得稳定的肝癌干细胞，所述干细胞可用于基础与应用研究、药物筛选、细胞分析等。
实施例4从分离的离体乳腺癌组织中筛选新型的乳腺癌干细胞
活检或离体新鲜乳腺癌组织，用PBS缓冲液清洗组织2 3次，再用眼科剪将乳腺癌组织剪碎成约Imm3的小块，加入胰酶(浓度为0. 1% 0. 3% )低温过夜消化，之后胶原酶(浓度4 8mg/ml)在37°C消化5mim 60min，加入与酶溶液体积等量的含10%胎牛血清的DMEM/F12K (美国Hyclone公司)终止反应,低温以800 IOOOg离心3mim 5min,丢弃上清，加入低温预冷的含2%胎牛血清的PBS洗涤沉淀2 3次，用无菌200目 400目筛网过滤，从而滤出细胞悬液，台盼蓝染色活细胞彡% %。
将所述分离的原代细胞群接种于细胞培养瓶或细胞培养板内，37°C，5% CO2培养，预先加入化疗药物氟尿嘧啶、紫杉醇、卡培他滨、环磷酰胺，在培养基中的终浓度分别为2mg/mL、10mg/mL、10mg/mL>2mg/mL,在 37°C,5% CO2 培养条件下作用 8h,之后，收集细胞。
I)每隔2小时收集细胞进行检测，低温以900g离心3mim 5min，丢弃上清，I X PBS洗涤，计算细胞存活率。
2)收集处理后的细胞再次接种，其中含有5ng/mL的B27、2ng/mL的N2、5ng/mL的EGF、5ng/mL 的 bFGF、15 u g/mL 的 Ifeparin，900U/ml 的 LIF。
3)随后加入BrdU标记对筛选、激活后的乳腺癌干细胞进行标记，其中，所述BrdU标记在培养基中的终浓度为5mg/kg细胞重量，在37°C，5% CO2条件下，每隔12h加入标记一次，共作用48h后，收集细胞。
4)每隔12小时进行细胞标记的检测,低温以900g离心3mim 5min丢弃上清，I X PBS洗涤，取50 ii L进行免疫组化检测BrdU标记的百分比。
5)收集处理后的细胞再次接种于细胞培养瓶或细胞培养板内，其中，5ng/mL的B27、2ng/mL 的 N2、5ng/mL 的 EGF、5ng/mL 的 bFGF、15 u g/mL 的 Ifeparin，900U/ml 的 LIF，在37°C,5% CO2条件下进行培养至细胞60%融合，再次加入化疗药物氟尿嘧啶、紫杉醇、卡培他滨、环磷酰胺，在培养基中的终浓度分别为2mg/mL、10mg/mL、10mg/mL、2mg/mL,在37°C,5% CO2培养条件下作用6h，之后，收集细胞。
6)重复上述步骤5)培养3次，由此获得稳定的乳腺癌干细胞，所述干细胞可用于基础与应用研究、药物筛选、细胞分析等。
实施例5从肺癌细胞系中筛选肺癌干细胞
肿癌细胞系，细胞存活率> 96%，预先加入化疗药物顺钼、紫杉醇、足叶乙甙，在培养基中的终浓度分别为20mg/mL、5mg/mL、15mg/mL，在37°C，5% CO2培养条件下作用10h，之后，收集细胞。
I)每隔2. 5小时收集细胞进行存活率检测，低温以800g离心3mim-5min，丢弃上清，I XPBS洗涤，计算细胞存活率。
2)收集处理后的细胞再次接种，其中含有8ng/mL的B27、5ng/mL的N2、10ng/mL的EGF>lOng/mL 的 bFGF、10u g/mL 的 Heparin,900U/ml 的 LIF。
3)随后加入BrdU标记对筛选、激活后的肺癌干细胞进行标记，其中，所述BrdU标记在培养基中的终浓度为4mg/kg细胞重量，在37°C，5 % CO2条件下，每隔8h加入标记一次，共作用32h后，收集细胞。
4)细胞标记的检测，低温以800g离心3mim 5min丢弃上清，IXPBS洗漆，取50uL进行免疫组化检测BrdU标记的百分比。
5)收集处理后的细胞再次接种于细胞培养瓶或细胞培养板内，其中，5含有8ng/mL 的 B27、5ng/mL 的 N2、10ng/mL 的 EGF、lOng/mL 的 bFGF、10 u g/mL 的 Heparin, 900U/ml 的LIF，在37°C，5% CO2条件下进行培养至细胞60%融合，再次加入化疗药物顺钼、紫杉醇、足叶乙甙，在培养基中的终浓度分别为20mg/mL、5mg/mL、15mg/mL,在37°C，5 % CO2培养条件下作用10h，之后，收集细胞。
6)重复上述步骤5)培养2次，由此获得稳定的肺癌干细胞，所述干细胞可用于基础与应用研究、药物筛选、细胞分析等。
实施例6筛选、识别新型干细胞的试剂盒组成[0190]筛选、识别新型干细胞的试剂盒(I)组成，包括筛选、识别试剂瓶组合(2)，细胞洗涤试剂瓶(5)，细胞因子试剂瓶￠)，混合容器或装置，其中(2)包括筛选试剂瓶(3)及对应混合容器(7)、识别试剂瓶(4)及对应混合容器(8)，所述试剂瓶(3)、(4)、(5)、(6)中的试剂分别为化疗药物、细胞标记、细胞洗涤液、多种细胞因子，所述(7)专用于混合化疗药物试剂，所述(8)专用于混合细胞标记。
其中，所述试剂瓶的形状不限，且其瓶塞可为压力、螺丝或其他。
进一步，所述试剂瓶其内含物是无菌的。其中，内毒素含量< 0. 5EU/mL。
其中，所述盛放试剂的材料为常用于试剂存放的材料制成，进一步，所述材料不影响试剂的活性。
其中，所述筛选试剂瓶(3)放置的化疗药物选择包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种 或两种以上的组合；
进一步，所述化疗药物更优选择以抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗
药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物任一一种的组合。
其中，所述识别试剂瓶(4)放置的细胞标记选择包括BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) ,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质；
其中，所述细胞因子试剂瓶(6)放置的细胞因子选择包括EGF、B27、bEGF、Heparin, N2、LIF为基础的细胞因子组合，进一步，所述EGF在干细胞培养时添加，至终浓度为5ng/mL-100ng/mL,优选10ng/mL-50ng/mL,所述bFGF在干细胞培养时添加，至终浓度为5ng/mL-100ng/mL,优选10ng/mL-50ng/mL,所述Heparin在干细胞培养时添加，至终浓度为2 ii g/mL-40 u g/mL,所述B27、N2在干细胞培养时添加，至终浓度为2ng/mL_50ng/mL，优选10ng/mL-30ng/mL，所述LIF(白血病抑制因子)在干细胞培养时添加，至终浓度为100U/mL-1500U/mL,优选 500U/mL-1000U/mL。
其中，所述细胞洗涤试剂瓶(5)的细胞洗涤剂可选择为生理盐水、PBS、或其他缓冲液。
实施例7使用试剂盒从小肠组织中筛选、识别干细胞
本发明的用于从小肠组织中筛选干细胞的试剂盒由如下组成
I)化疗药物为氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷；
2)细胞洗涤液为生理盐水；
3)细胞标记；
4)细胞因子组合；
5)描述使用方法的说明书，以及；
6)混合容器。
上述试剂液体在无菌条件下配制，测试内毒素含量< 0. 5EU/mL。
其中，所述细胞标记优先选择为BrdU ；
其中，所述细胞因子优先选择82736 4 6 、吧、11印&1^11、1正的组合；
其中，所述描述使用方法的说明书包括制备本发明的标记的干细胞的方法。[0211]采用上述试剂盒操作的方法包括以下步骤
I)细胞预处理获得的小肠组织预处理为单细胞悬液后，台盼蓝染色计算细胞存活率，随后，低温以800g离心3mim 5min，丢弃上清，称重细胞重量；
2)混合筛选试剂把筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷用混合试剂瓶(7)进行混合，终浓度分别为15mg/kg、2mg/kg ；
3)筛选干细胞加入混合后的筛选试剂，在37°C，5% CO2含细胞因子的条件下培养6小时后，收集细胞；
4)计算细胞存活率低温以800g离心3min 5min,丢弃上清,称重细胞的重量，再加入试剂瓶(5)中的细胞洗涤液生理盐水重悬细胞沉淀，计算细胞存活率；
5)混合细胞标记把识别试剂瓶(4)中所包含的细胞标记试剂BrdU，用混合试剂瓶(7)进行混合，终浓度为2. 5mg/kg细胞重量；
6)识别干细胞加入细胞标记试剂瓶⑷中的细胞标记，在371，5%0)2含细胞因子的条件下培养，标记每隔6h加入一次，共加入4次，总计24h，收集细胞，其中，所述细胞因子包括EGF、B27、bFGF、Heparin, N2所组成的组合，进一步，所述EGF在干细胞培养时添加，至终浓度为10ng/mL,所述bFGF在干细胞培养时添加,至终浓度为10ng/mL。所述Heparin在干细胞培养时添加，至终浓度为g/mL，所述B27、N2为细胞培养添加剂，在干细胞培养时添加，至终浓度为5ng/mL，所述LIF在干细胞培养时添加，至终浓度为800U/mL ；
7)低温以800g离心3min 5min，丢弃上清，再加入细胞洗涤试剂生理盐水重悬细胞沉淀；
8)重复上述步骤各2次，获得稳定数量的肠干细胞群。
根据本发明的试剂盒筛选的肠干细胞，可作为临床、基础与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复受损组织等领域的应用工具。
实施例8使用试剂盒从表皮组织中筛选干细胞
本发明用于从表皮组织中筛选干细胞的试剂盒由如下组成
I)化疗药物为博来霉素、氟尿嘧啶；
2)细胞洗涤液为PBS ；
3)细胞标记；
4)细胞因子组合；
5)描述使用方法的说明书，以及；
6)混合容器。
上述试剂液体在无菌条件下配制，测试内毒素含量< 0. 5EU/mL，之后，保存于无菌的容器和或装置内。
其中，所述细胞标记优先选择为BrdU ；
其中，所述细胞因子优先选择82736 4 6 、吧、11印&1^11、1正的组合；
其中，所述描述使用方法的说明书包括制备本发明的标记的干细胞的方法。
采用上述试剂盒操作的方法包括以下步骤
I)细胞预处理常规方法获得表皮组织，预处理为单细胞悬液后，台盼蓝染色计算细胞存活率，随后，低温以800g离心3mim 5min，丢弃上清，称重细胞重量；
2)混合筛选试剂把筛选试剂瓶(3)中所包含的试剂化疗药物博来霉素、氟尿嘧唳，浓度分别为3mg/kg、10mg/kg ；
3)筛选干细胞加入混合后的筛选试剂，在37°C，5% CO2含细胞因子的条件下培养8小时后，收集细胞；
4)计算细胞存活率低温以900g离心3min 5min，丢弃上清，称重细胞的重量，再加入试剂瓶(5)中的细胞洗涤液PBS缓冲液重悬细胞沉淀，计算细胞存活率；
5)混合细胞标记把识别试剂瓶(4)中所包含的细胞标记试剂BrdU，用混合试剂瓶(7)进行混合，终浓度为4. 5mg/kg细胞重量；
6)识别干细胞加入细胞标记试剂瓶⑷中的细胞标记，在37°C，5% CO2含试剂5细胞因子的条件下培养，标记每隔6h加入一次，共加入8次，总计48h，收集细胞，其中，所述细胞因子包括EGF、B27、bFGF、Heparin, N2所组成的组合，进一步，所述EGF在干细胞培养基时添加，至终浓度为12ng/mL，所述bFGF在干细胞培养时添加，至终浓度为12ng/mL。所 述Ifeparin在干细胞培养时添加，至终浓度为8 y g/mL，所述B27、N2为细胞培养添加剂，在干细胞培养时添加，至终浓度为10ng/mL，所述LIF在干细胞培养时添加，至终浓度为900U/mL ；
7)低温以900g离心3min 5min，丢弃上清，再加入试剂6细胞洗搽液PBS缓冲液重悬细胞沉淀；
8)重复上述步骤各2次，获得稳定数量的肠干细胞群。
根据本发明的试剂盒筛选的表皮干细胞，可作为临床、基础与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复受损组织等领域的应用工具。
显然在不违反本发明的领域及范畴下，可以对上述用于筛选新型干细胞的试剂盒进行成分的修饰及或增加，本发明是以上述实施例进行试剂盒的说明，并不是用于限制试剂盒的使用，对此进行的任何等同替换、修改、增加均属于本发明试剂盒的保护范畴内。
权利要求
1.一种新型干细胞，其特征在于干细胞群来源于啮齿动物、人及其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体样品组织、细胞系，通过化疗药物联合细胞标记筛选而获得，其中该新型干细胞群可长期保留细胞标记。
2.根据权利要求
I所述的一种筛选新型成体干细胞的方法，其特征在于，所述筛选、识别方法具有通用性，包括 采用化疗药物对细胞群中的成体干细胞进行筛选，之后再采用细胞标记对筛选后的干细胞群进行识别的步骤， 所述化疗药物预先加入所述细胞群中，直接清除其中的增殖性细胞群，从而筛选、富集其中的干细胞群， 所述干细胞群经耐受性筛选后激活进入细胞周期，之后，加入细胞标记对筛选后激活的所述干细胞群和或其子代进行识别， 其中，所述化疗药物选择具有清除增殖性细胞并激活干细胞群作用的试剂或物质，其中，包括已知的抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合一种或两种以上的组合，或选择以所述抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物任一一种的组合，其中，所述使用的化疗药物的浓度约lmg/kg-100mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间范围为O. lh-72h，或选择使用所述的化疗药物的浓度约10mg/kg-50mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间为O. 5h_36h。
其中，所述标记细胞的标记选择BrdU、氣标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基_2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质，其中，所述使用的标记浓度约O. lmg/kg-15mg/kg细胞重量，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为O. 01h-96h,或者,所述使用的标记浓度约O. 5mg/kg-10mg/kg细胞重量,所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为O. 05h-72h。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于，所述标记能够识别经耐受筛选的干细胞和或其子代的个数为一个或两个以上，其中，干细胞和或其子代可长期保留标记。
4.根据权利要求
I或2所述的方法，其特征在于，所述干细胞群和或其子代源自啮齿动物、人类或其他哺乳动物活检/离体的正常肝脏组织、肾脏组织、心脏组织、胰腺组织、肠组织、表皮组织、卵巢组织、睾丸组织、神经组织、胃组织、肺组织、乳腺组织、脂肪组织、肌肉组织、甲状腺、间充质、脾脏组织、骨髓组织、外周血、脐带血、经血、胎盘、牙组织、眼组织和脑组织中的一种或两种以上所组成的组中。
5.根据权利要求
I或2所述的方法，其特征在于，所述筛选分离的干细胞群和或其子代源自介于正常与癌/肿瘤性之间的肿瘤/癌前病变组织、肝癌、肾癌、胰腺癌、肠癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、肺癌、肝部转移瘤、肺转移瘤、肿瘤细胞系和或肿瘤/癌离体组织等的一种或两种以上所组成的组中。
6.根据权利要求
I至5中任意一项所述法获得的正常干细胞、肿瘤干细胞和或其子代。
7.一种制备权利要求
6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 1)化疗药物； 2)细胞洗涤液；3)细胞标记； 4)细胞因子组合； 5)描述使用方法的说明书，以及任选的； 6)混合容器和装置。
其中，所述化疗药物包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸钼、钼类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合； 其中，所述化疗药物选择以抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合钼类化疗药物任一一种的组合； 其中，所述细胞洗涤试液可为生理盐水、PBS、或其他缓冲液； 其中，所述标记细胞的标记选择BrdU、氣标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5_乙炔基_2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质； 其中，所述细胞因子组合包括EGF、B27、bEGF、N2、Heparin, LIF为基础的细胞因子组合，所述EGF在干细胞培养时添加，至终浓度为5ng/mL-100ng/mL,优选10ng/mL-50ng/mL,所述bFGF在干细胞培养时添加，至终浓度为5ng/mL-100ng/mL,优选10ng/mL-50ng/mL,所述Heparin在干细胞培养时添加，至终浓度为2 μ g/mL-40 μ g/mL,所述B27、N2在干细胞培养时添加，至终浓度为2ng/mL-50ng/mL,优选10ng/mL-30ng/mL,所述LIF(白血病抑制因子)在干细胞培养时添加，至终浓度为100U/mL-1500U/mL，优选500U/mL-1000U/mL ; 其中，所述描述使用方法的说明书包括权利要求
I至7中任意一项所述的方法。
8.根据权利要求
7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的标记干细胞携带的标记也可选择为磁性氧化铁标记、量子点标记、GFP标记、RFP标记或其他任何可以让所述筛选的干细胞和或子代携带的标记。
9.根据权利要求
7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒筛选、识别的干细胞群来自啮齿动物、人类及其他哺乳动物的正常离体或活检组织、细胞系、癌前组织、癌/肿瘤性组织、转移瘤/癌组织的一种或两种以上的组合。
10.根据权利要求
I至9所述，其特征在于，所述新型干细胞、其后代和或筛选新型干细胞的方法、试剂盒有益于基础、临床与应用研究、组织工程、治疗、药物筛选、修复和再生受损或患病组织等领域的应用。
专利摘要
本发明属于细胞技术领域：
。本发明公开一种新型成体干细胞、其筛选方法、试剂盒及其用途，特别是涉及一种从啮齿动物、人类或其他哺乳动物的正常、肿瘤/癌前、肿瘤/癌性、转移瘤/癌组织的活检、离体组织样品、细胞系样品中通过化疗药物联合细胞标记筛选获得的干细胞群。此外，本发明也公开一种从混合细胞群中筛选、识别干细胞的方法及试剂盒，该方法和试剂盒特异性强、简便快捷，实用有效的优点。本发明公开的新型干细胞、筛选方法及试剂盒有益于临床、基础与应用研究、治疗、组织工程、药物筛选、修复和再生失去功能的病变组织或器官中的应用，前景广泛。
文档编号C12Q1/02GKCN102796699SQ201110149653
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月25日
发明者李福生, 卢磊磊, 卢淼淼, 卢晶晶 申请人:李福生, 卢磊磊导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan