专利名称:一种载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能表达人胰岛素样生长因子-1的重组转基因载体，以及利用转基因家蚕丝腺生物工厂表达人胰岛素样生长因子-1的方法。
背景技术：
人胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)是一种受GH调节的单链多肽，由70个氨基酸组成，分子量为7 649 Da，其结构有45%与胰岛素相似。IGF-1有种系稳定性，所有哺乳类动物的IGF-1结构及组成基本相同。IGF-1具有多种生理功能，有促生长、促物质代谢、促细胞分裂增殖等作用。临床上可用于糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖症、分解代谢亢进性疾病、株儒症、肾功能不全和神经系统疾病等治疗。
目前，对于IGF-1的基因药物的开发研究，主要采用大肠杆菌表达系统或者酵母菌表达系统或昆虫细胞表达系统或人工提取(参见:[1]吴岚晓，李明，王萍，陈白虹，人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的表达，药物生物技术，2001，4:8-11 ; [2]Fischer B， Sumner Lj Goodenough P， et al; Isolation,renaturation and formationof disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli asinclusion bodies ;Biotechnology and Bioengineering; 1993 年；[3]赖心田，周鹏，洪葵；人胰岛素样生长因子I在毕赤氏酵母中的表达研究，药物生物技术；2002年03期；[4]赵红，汪承亚，昆虫细胞表达重组人胰岛素样生长因子I的研究，南京医科大学学报-2000，20 (4)243-245)ο
上述方法各有特点:
(I)酵母菌表达系统，表达量低，且存在酵母特异的碳水化合物分枝；而大肠杆菌表达系统对表达产物无 后加工修饰作用，表达产物的天然性差，工艺复杂，成本高；一般的昆虫细胞表达系统产物可能有杆状病毒的污染，大规模培养昆虫细胞的工艺还不成熟，且培养成本高；
(2)人工提取法:公开号为CN1603344、CN1757650的中国专利申请公布说明书公开了一种从鲜鹿茸提取胰岛素样生长因子(IGF-1)的方法，该方法的受到鲜鹿茸资源的限制；
(3)公开号为CN1384201的中国专利申请公布说明书公开了一种利用重组杆状病毒在昆虫体内特别在家蚕内表达、生产重组人类胰岛素生长因子一 I (IGF — I)，并用所生产的人类胰岛素生长因子制备口服降血糖的方法，该方法需构建带有IGF -1基因的重组杆状病毒，将该重组病毒通过人工接种方式感染家蚕从而实现IGF -1的表达。这种方式可以制备口服药物，但其工艺复杂，重组病毒需要通过人工皮下接种方式感染家蚕，处理工作量大，同时，获得的产物中存在残留重组杆状病毒的可能性，具有难以预测的风险性；
(4)公开号为CN101023778的中国专利申请公布说明书公开了一种制备富含IGF-1的柞蚕粉，并作为仔猪饲料添加剂的方法。公开号为CN101270367的中国专利申请公布说明书公开了一种家蚕丝腺生物工厂的建立方法，并用转基因丝腺冻干粉制作口服降糖药物的方法，但选用丝蛋白启动子不带有信号肽相应的DNA序列，外源基因在丝腺组织中的表达水平较低，用丝腺组织制成的冻干粉含有外源重组DNA的污染，具有难以预测的风险性。
因此，需要研发一种能提高外源基因IGF -1在家蚕丝腺中表达量的方法，同时能较少其他外源重组基因的污染，避免杆状病毒带来危险，提高安全性。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种能表达人胰岛素样生长因子-1的重组转基因载体。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体，所述重组转基因载体包括:外源基因人胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、启动子、增强子元件；其特征在于:构建所述重组转基因载体的转座子为piggyBAC转座子；所述启动子为丝素重链/从-H蛋白启动子，并且该启动子带有下游信号肽相应的DNA序列；所述的增强子为丝素轻链/i6-L基因第I内含子的部分序列；重组转基因载体还包括:丝素重链蛋白启动子下游信号肽相应的DNA序列、家蚕丝素轻链/^-LpolyA信号位点的序列。
上述技术方案中，所述重组转基因载体还包括:新霉素抗性基因。
上述技术方案中, 所述piggyBAC转座子载体优选为pigA3GFP转座子载体,因为所述pigA3GFP转座子载体带有荧光蛋白报告基因，方便筛选。
上述技术方案中，所述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体的制备方法为:通过基因工程操作将家蚕丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的人类胰岛素生长因子-1基因的表达盒、增强子元件和新霉素抗性基因表达盒克隆进piggyBAC转座子载体pigA3GFP构建重组转基因载体；具体包括以下步骤:
(I)制备 I 基因；
(2)将IGF-1基因克隆进过渡空质粒，制备载有IGF-1基因的过渡载体A ；
(3)制备丝素轻链基因的polyA信号序列，并克隆到过渡载体A中，得到过渡载体B ；
(4)制备丝重链基因启动子及其下游信号肽相应的DNA序列Fib-HS，并克隆进过渡空质粒，制备得到载有Fib-HS基因的过渡载体C ；
(5)以过渡载体B为模板，PCR扩增含有IGF-1基因和polyA信号序列的基因片段，然后克隆到过渡载体C中，得到过渡载体D ;
(6) PCR扩增得到丝素轻链基因第I内含子中具有增强子功能的的序列，构建带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体pigA3GFP-en ；
(7)酶切过渡载体D，回收丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因片段，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en获pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-p0lyA]，即得到带有增强子元件和丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因的转基因载体；
(8)制备家蚕核型多角体病毒见-2基因启动子，克隆进过渡空质粒，制得含家蚕核型多角体病毒见-7基因启动子的过渡载体E ;制备Neo基因的编码序列及其下游的PolyA信号序列，双酶切后克隆进同样双酶切的过渡载体E，制得带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因neo的重组载体，即过渡载体F ；
(9)过渡载体F酶切后回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]质粒，即制得有丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体，命名为pigA3-FibHS-1GF-en-ne0。
上述技术方案中，步骤(I)制备I基因的方法为:根据公开的人胰岛素样生长因子-1基因的CDNA序列，按常规人工合成人胰岛素样生长因子-1活性肽对应的DNA序列；优选地的技术方案中，为了便于克隆表达，在5'端引入起始密码子ATG和EcoR V的酶切位点，3'端引入终止密码子TAA和沿ο 1、III的酶切位点；
上述技术方案中，步骤(2)制备载有I基因的过渡载体A的方法为:将步骤⑴人工合成的I基因序列用V和通ο I双酶切，常规法回收酶切片段，与用
V和沿ο I双酶切的pBluescript II SK(+)质粒连接，得到连接产物；将连接产物转化到大肠杆菌TGl菌株中，通过蓝白斑培养筛选获得重组转化子，从阳性菌斑中提取质粒DNA,即得已成功克隆了 IGF-1基因的过渡载体A，过渡载体A又命名为pSK_IGF。
上述技术方案中，步骤(3)具体包括以下步骤:以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-3，TPFib-L-4为引物，扩增出丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经通ο I和命I双酶切后，与同样双酶切的pSK-1GF载体连接，获得重组载体pSK-1GF-polyA,即为过渡载体B ；
其中，引物TPFib-L-3 的序列如 SEQ ID N0.1 所示:ggc tcg age aaa ttg tgtttg cgt tag g ;弓丨物 TPFib-L-4 的序列如 SEQ ID N0.2 所不:gcg gta ccc act gtc caatcc acc gtc。
上述技术方案中，步骤⑷具体包括以下步骤:以家蚕皓月品种的基因组DNA为模板，以TS-Fib-H-1和Fib-HS-2为引物，通过常规PCR扩增丝重链基因启动子及其下游信号肽相应的DNA序列Fib-HS，Fib-HS用油a I和历./ (! III双酶切后定向克隆进用同样双酶切WpBluescriptII SK (+)载体，获得重组质粒pSK-FibHS，即为过渡载体C ;
其中，弓丨物TS-Fib-H-1 的序列如 SEQ ID N0.3 所示:gcTCTAGAgaattcgagaatgtctggacag (下划线示I位点，斜体部分示AF226688序列的61950至61965 位的核苷酸)；引物 Fib-HS-2 的序列如 SEQ ID N0.4 所示:CGAAGCTTGGATCCGACATkCTGCAGAGCGCAGCACAAGATCAC (下划线示历/ d III /Βαιπ I 位点，斜体部分为 AF226688 序列的62456至62479位的核苷酸的互补序列，下划线部分与斜体部分中间的“GACATA”为/YA-H基因的第二外显子5’端起始核苷酸的互补序列)。
上述技术方案中，步骤(5)具体包括以下步骤:以重组载体pSK-1GF-polyA为模板，以TS-1GF-1-2和TPFib-L-4为引物进行PCR扩增，PCR产物经奴111和命/ 1双酶切后，克隆进PSK-FibHS的位点获pSK-HS-1GF-polyA重组质粒；
其中，引物TS-1GF-1 -2 的序列如 SEQ ID N0.5 所示:TTAGATCTATGGGA CCGGAGACGCTC (下划线示奴7II酶切位点)，引物TPFib-L-4的序列如 SEQ ID N0.6 所示:5’-GCGGTACC CACTGTCCAATCCACCGTC-3’ (下划线元、KpnI位点)。
上述技术方案中，步骤(6)具体为:以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-5和TPFib-L-6为引物，常规PCR扩增得到丝素轻链基因第I内含子中具有增强子功能的的序列，经I和V双酶切后，克隆进经I和5)胳I双酶切的pigA3GFP质粒，获得带有增强子元件的基于PiggyBAC转座子的转基因载体，命名为pigA3GFP-en ；
其中，引物TPFib-L-5 的序列如 SEQ ID N0.7 所示:cgc tcg ag a tat cta tggget cca gta acc ;34ljTPFib-L-6 的序列如 SEQ ID N0.8所不:gcg tcg acg gtc agg ttagat taa egg g。
上述技术方案中，步骤(7)具体为:pSK-HS-1GF-polyA用&oRI和命/ 1酶切，回收丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因片段，克隆进同样酶切的 pigA3GFP-en 获 pigA3GFP-en-[FibHS_IGF-polyA]；
上述技术方案中，步骤⑶具体为:以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，用TiW基因启动子的特异性引物对IE-1-1和IE-1-2进行PCR扩增，PCR产物用I ,EcoR V双酶切后，克隆在pBluescript II SK(+)载体，获得带有家蚕核型多角体病毒TiW基因启动子的载体pSK-1E，即过渡载体E ；
以pCDNA3.1载体(Invitron公司产品)为模板，以Neol和Neo3为引物，PCR扩增出Neo基因的编码序列及其下游的polyA信号序列(约IlOObp),备Xho 1、EcoR V酶切消化后，克隆进经过同样处理的PSK-1E载体中，获得pSK-1E-Neo载体，即过渡载体F ；
其中，用TiW基因启动子的特异性引物IE-1-1序列如SEQ ID N0.9:5’TTCGAATTCGATTTGCAGTTCGGGAC3’，引物 IE-1-2 序列如 SEQ ID N0.10:5’ GCGGATATCAGTCGTTTGGTTGTTCA3’ ；
引物Neol 如 SEQ ID N0.11 所示:5' CTGATATCATGATTGAACAAGA TGG3/ ;引物Neo3 如 SEQ ID N0.12 所示:5' AGCTCGAGAATTCTAGCTAGAG GTC GAC3'。
上述技术方案中，步骤(9)具体为:pSK-1E-Neo载体用I酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]质粒，即制得带有丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体，命名为pigA3-FibHS-1GF-en-neo。
上述的技术方案中所述的荧光蛋白报告基因可以为绿色荧光蛋白基因，也可以是红色荧光蛋白基因。
进一步的技术方案中，将上述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体与辅助质粒作混合，导入初产卵，孵化，筛选获得带有新霉素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到I基因，育种制成转基因家蚕，得到一种家蚕丝腺生物反应器；优选地，所述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体为pigA3-FibHS-1GF-en_neo0
因此，本发明同时要求保护一种可以表达外源基因I的家蚕丝腺生物反应器，所述家蚕丝腺生物反应器以家蚕为载 体，反应器通过上述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体介导获得；所述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体优选为 pigA3-FibHS-1GF-en_neo。[0043]本发明的另一目的是提供一种制备口服降糖药物的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种采用上述家蚕丝腺生物反应器生产口服降糖药物的方法，采用上述技术方案获得的转基因家蚕的丝腺组织经冷冻干燥后制成药物。
或者，一种采用上述家蚕丝腺生物反应器生产口服降糖药物的方法，收集上述技术方案获得的转基因家蚕的蚕茧，粉碎后制成药物。
因此，本发明同时要求保护采用上述技术方案获得的转基因家蚕的丝腺组织的冷冻干燥物；采用上述技术方案获得的转基因家蚕的蚕茧。
本发明同时要求保护采用上述技术方案获得的转基因家蚕的丝腺组织的冷冻干燥物在制备降糖药物的应用；采用上述技术方案获得的转基因家蚕的蚕茧在制备降糖药物的应用。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:
1.本发明通过采用piggyBAC转座子可以获得丝素蛋白基因启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的IGF-1基因，并在后部丝腺组织特异性分泌表达的转基因家蚕，表达的重组IGF-1通过腺腔随着吐丝进入茧层。不仅用转基因家蚕丝腺组织制备的口服制剂有明确的药效，而且用转基因家蚕的蚕茧制成的口服制剂也有明确的药效。有关家蚕丝腺工厂分泌表达、生产I的转基因家蚕及转基因家蚕丝腺组织、蚕茧制备成口服制剂的方法是首创。
2.本发明由于采用转基因家蚕制备药物，获得的药物中不会有杆状病毒残留，生物安全性高。
3.本发明通过分泌表达可提高外源基因的表达水平。
`[0052]4.本发明通过分泌表达可简化转基因家蚕丝腺组织制药工艺。
5.本发明利用转基因家蚕蚕茧制药，可以避免外源重组DNA的污染，安全性更高，且蚕茧中的丝蛋白有辅助治疗作用。
图1为实施例一步骤7中的pigA3-FibHS-1GF-en_neo质粒的酶切鉴定；其中，M: DNA Marker; 1: pigA3-FibHS-1GF-en_neo 质粒用酶切；2:pigA3-FibHS-1GF-en_neo 质粒用酶切；用酶切可检测到 IE-Neo 片段(1.7kb)，用 EcoRl/Kpnl 酶切可检测到 IE-Neo 片段(1.7kb)和 FibHS-1GF-polyA 片段(1.1kb)；
图2为实施例一步骤8中筛选出的抗G418、带有荧光蛋白报告基因的家蚕；
图3为实施例一步骤9中G9、GlO和Gll代转基因蚕的IGF-1基因PCR检测；其中，M:DNA Marker ;泳道1、2和3分别为G9、GlO和Gll代的IGF-1基因PCR检测。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
实施例一:丝素重链蛋白基因启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的IGF-1基因的转基因家蚕的制备[0059]技术操作过程如下:
1.1GF-1基因的制备
根据业已公开的人胰岛素样生长因子-1基因的cDNA序列，按常规人工合成人胰岛素样生长因子-1活性肽对应的DNA序列(SEQ ID N0.15)，为了便于克隆表达，在5'端弓I入起始密码子ATG和&oR V的酶切位点，3'端引入终止密码子TAA和Xho 1、Hiη III的酶切位点。
SEQ ID N0.15:TGGATATCATGggaccggagacgctctgcggggctgagctggtg gatgctcttagttcgtgtgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtattgcgcacccctcaagcctgccaagtcagctTAAGCTT CTCGAGAT
2.构建带有cDNA基因的pBluescript II SK⑴重组质粒
将人工合成的DNA序列用V和通ο I双酶切，常规法回收酶切片段，与用EcoR V 和 Xho I 双酶切的 pBluescript II SK (+)质粒(Stratagene 公司产品)连接。T4 DNA连接酶为GIBCO BRL公司产品，连接条件为16°C，12小时。连接产物转化大肠杆菌TGl菌株，通过蓝白斑培养筛选获得重组转化子，小批量提取质粒DNA (参见《分子克隆》，1989，科学出版社)，用&01 V和Xho I酶切鉴定,有一条约230bp的片段被克隆,经测序证明已成功克隆了 IGF-1基因，所获得的重组质粒称之为pSK-1GF。
3.丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因的载体构建
以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-3 (SEQ ID N0.1 ggc tcgage aaa ttg tgt ttg cgt tag g), TPFib-L-4 (SEQ ID N0.2 gcg gta ccc act gtccaa tcc acc gtc)为引物,扩增出290bp的片段,测序证明为丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经通ο I和命/7 I双酶切后，与同样酶切的pSK-1GF载体连接，获得重组载体pSK-1GF-polyA。
参照GenBank中已公开的家蚕丝素重链基因/ifH (登录号:AF226688)的启动子及其下游序列设计引物 TS-Fib-H-1:SEQ ID N0.3:gcTCTAGAgaattccagaatstctsmcas:(下划线示油al/^boR I位点，斜体部分示AF226688序列的61950至61965位的核苷酸)和 Fib-HS-2: SEQ ID N0.4:CQkkQCTTQQkTCCQkCkTkCTGCAGAGCGCAGCACAAGATCAC(下划线元、HinA III /BamW I位点，下划线和斜体部分之间的部分表示fibi基因的第二外显子5’端起始核苷酸的互补序列，斜体部分为AF226688序列的62456至62479位的核苷酸的互补序列。
以家蚕皓月品种的基因组DNA为模板，以TS-Fib-H-1和Fib_HS_2为引物，通过常规PCR扩增获得550bp左右的片段(Fib-HS)，经序列测定证实为丝重链基因启动子及其下游序列；Fib-HS用I和"i/ d III双酶切后定向克隆进用同样的双酶切pBluescriptllSK (+)载体，获得重组质粒pSK-FibHS。
根据合成的IGF序列设计引物TS-1GF-1 _2:SEQ ID N0.5:TTAGATCTATGGGACCGGAGACGCTC (下划线示Bsl 11酶切位点)，参照GenBank中已公开的家蚕丝素轻链fib-L全序列(登录号:M76430)设计克隆/^-LpolyA加尾信号序列的PCR引物 TPFib-L-4:SEQ ID N0.6:5’ -GCGGTACCCACTGTCCAATCCACCGTC-3’ (下划线示 Kpn I 位点)，以重组载体pSK-1GF-polyA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经|111和治双酶切后，克隆进pSK-FibHS的位点获pSK-HS-1GF-polyA重组质粒。
4.带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体构建
以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-5 (SEQ ID N0.7:cgc tcg aga tat cta tgg get cca gta acc)和 TPFib-L-6 (SEQ ID N0.8:gcg tcg acg gtc aggtta gat taa egg g)为引物，常规PCR扩增，获得丝素轻链基因第I内含子中具有增强子功能的400bp左右的序列，Sal I和V双酶切后，克隆进经Sal I和Sma I双酶切的PigA3GFP 质粒(参见 Cary, L.C.et al.Transposon mutagenesis of baculoviruses:analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-1ocus ofnuclear polyhedrosis viruses.Virology, 1989, 172:1565.带有增强子元件和丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因的转基因载体的构建
pSK-HS-1GF-polyA用&0RI和命I酶切，回收丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因片段，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en获pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]
6.构建带有家蚕核型多角体病毒I·E-1基因启动子控制新霉素抗性基因neo的重组载体
以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，用TiW基因启动子的特异性引物对IE-1-1 (SEQ ID N0.9:5’TTCGAATTCGATTTGCAGTTCGGGAC3’)和 IE-1-2 (SEQ ID N0.10:5’ GCGGATATCAGTCGTTTGGTTGTTCA3’ )进行 PCR 扩增，PCR 产物用 &oR I ,BcoR V 双酶切后，克隆在pBluescript II SK(+)载体，获得带有家蚕核型多角体病毒见-2基因启动子的载体pSK-1E
以pcDNA3.1 载体(Invitron 公司产品)为模板，以 Neol (SEQ ID N0.11:5' CTGATATCATGATTGAACAAGATGG3')和 Neo3 (SEQ ID N0.12:5' AGCTCGAGAATTCTAGCTAGAGGTCGAC3 / )为引物，PCR扩增出Neo基因的编码序列及其下游的polyA信号序列(约IIOObp)，经通ο 1、FcoR V酶切消化后，克隆进经过同样处理的pSK-1E载体中，获得pSK-1E-Neo 载体。
7.构建带有丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体
pSK-1E-Neo载体用I酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-p0lyA]质粒，获的重质粒命名为pigA3-FibHS-1GF-en_neo0
8.精子介导法获得带有荧光报告基因GFP和新霉素抗性的转基因家蚕
家蚕品种为菁松品种，正常饲养至化蛾。
将pigA3-FibHS-1GF-en_neo 及辅助质粒(参见 Tamura Toshik1.et al.Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using a piggyBactransposon-derived vector.Nature Biotechnology, 2000，18:81-84)按 1:1 混合(混合浓度2 μ g/μ L)，用毛细管玻璃针以1.5^2.0 μ 7只注入处女蛾交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕(Gtl)连续添食10000 μ g/mL的G418至4龄眠，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出抗G418、带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕(转基因家蚕)，进后IGF-1基因检测和常规家蚕育种。
9.转基因家蚕的I基因PCR检测
针刺取少量荧光家蚕的血淋巴(约20 μ L血淋巴/每头)，加500 μ L TE缓冲液(ρΗ8.0)，加500 μ L过饱和苯酚(ρΗ8.0)作用10分钟，12 OOOrpm离心10分钟，取上清，再用过饱和酚提取一次，加氯仿:异戊醇(24:1)作用10分钟，12 OOOrpm离心10分钟，取上清加2倍体积无水冷乙醇，混合均匀，置_20°C，2小时后再用12 OOOrpm离心10分钟，弃上清，用70%乙醇洗沉淀，12 OOOrpm离心I分钟，弃上清，自然干燥，沉淀用10 μ L TE缓冲液溶解，获家蚕基因组总DNA。
以提取蚕血淋巴总DNA作为模板，用IGF-1基因的特异性引物T-1GFl(SEQ ID N0.13:TGGATATCATGGGACCGGAG ACGCTCTGC)和 T-1GF2 (SEQ ID N0.14:ATCTCGAGAAGCTTAAGCTGACTTGGCAGGCTTG)进行PCR检测，同时设正常家蚕为阴性对照，
pigA3-FibHS-1GF-en-neo 质粒 DNA 为阳性对照。PCR 检测显示，在 G。、G1' G2, G3、......Gll
等代均可扩增出230bp左右的I特异片段，阴性对照无该片段产生，表明I基因已进入家蚕基因组，并稳定遗传。
10.转基因 家蚕丝腺I表达产物检测
解剖取转基因家蚕，取新鲜后部丝腺组织，制成冻干粉。取适量的冻干粉组织裂解液(10 % 甘油，2.5% SDS，巯基乙醇 5%，625mmol/L Tris-Cl pH6.8)中，4°C 过夜。12000rpm，4°C离心lOmin，取上清，用ELISA法，按检测试剂盒(博士德，武汉博士德生物工程有限公司)说明书测定IGF-1的表达水平，同设正常家蚕后部丝腺对照，结果表明，家蚕后部丝腺冻干粉中hIGF-1的含量为19.18 μ g/g冻干粉。
取转基因家蚕蚕茧适量，采用碱性水脱胶法[张雨青.蚕丝脱胶方法的比较分析.蚕业科学，2002，28 (I): 75-79]，将蚕茧置于ρΗΙΟ.5的ddH20, IOO0C煮沸1-1.5h，脱胶，脱胶后的丝素，米用 Ajisawa’s 法溶解[Ajisawa A.Dissolution of silk fibroin withcalciumchloride/ethanol aqueous solution [J].Seric Sci >/ ，1998，67:91-94]。收集溶解液，透析48 h后，定容至100ml，稀释100倍后进行ELISA检测。结果显示转基因蚕茧中hIGF-Ι的水平为1.84 μ g/g蚕茧。
实施例二: 口服型丝腺冻干粉囊胶制备及生物活性试验
收集转I基因的家蚕的后部丝腺，经匀浆后，用纱布过滤去除粗杂质，冷冻干燥成粉剂原料，将原料粉按每kg加水IL的比例溶解，经18 000 rpm离心I小时，取上清，再经冷冻干燥后成精原料粉，原料粉装入胶囊，制成口服型丝腺冻干粉胶囊。口服型丝腺冻干粉胶囊经小鼠动物实验证明，口服家蚕后部丝腺冻干粉I周后可显著降低链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的血糖水平，下降幅度在13.43%-34.76%。且下降幅度呈现口服剂量依赖。
实施例三:口服型蚕茧粉囊胶制备及生物活性试验
转基因家蚕蚕茧削茧去蛹后，剪碎茧壳，磨碎成粉后装入胶囊，制成口服型蚕茧粉胶囊，口服型蚕茧粉胶囊经小鼠动物实验证明，口服蚕茧粉10天后可显著降低链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的血糖水平，下降幅度在49.66%左右。且下降幅度呈现口服剂量依赖。核苷酸和/或氨基酸序列表<110>苏州大学
〈120〉一种载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体及其应用〈160〉 15
<170> PatentIn version 3.5
〈210〉 I〈211〉 28〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 I
ggctcgagca aattgtgttt gcgttagg28
〈210〉 2〈211〉 27〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 2
gcggtaccca ctgtccaatc caccgtc27
〈210〉 3〈211〉 30〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 3
gctctagaga attcgagaat gtctggacag30
〈210〉 4〈211〉 44〈212〉 DNA〈213〉人工合成
〈400〉 4
cgaagcttgg atccgacata ctgcagagcg cagcacaaga tcac44
权利要求
1.一种载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体，所述重组转基因载体包括:外源基因人胰岛素样生长因子-1、启动子、增强子元件；其特征在于:构建所述重组转基因载体的转座子为PiggyBAC转座子；所述启动子为丝素重链fib-w蛋白启动子，并且该启动子带有下游信号肽相应的DNA序列，丝素重链fib-H蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列是以家蚕皓月品种的基因组DNA为模板，以TS-Fib-H-1和Fib_HS_2为引物，通过常规PCR扩增获得，TS-Fib-H-1的序列如SEQ ID N0.3所示，Fib-HS-2的序列如SEQID N0.4所示；所述的增强子为丝素轻链/从-L基因第I内含子的部分序列，是以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-5和TPFib_L_6为引物，通过常规PCR扩增获得，TPFib-L-5的序列如SEQ ID N0.7所示，TPFib-L-6的序列如SEQ ID N0.8所示；家蚕丝素轻链/从-LpolyA信号位点的序列、新霉素抗性基因；重组转基因载体带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因。
2.权利要求
1所述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体的制备方法，其特征在于:通过基因工程操作将家蚕丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的人类胰岛素生长因子-1基因的表达盒、增强子元件和带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制的新霉素抗性基因表达盒克隆进PiggyBAC转座子载体构建得到重组转基因载体。
3.根据权利要求
2所述制备载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体的方法，其特征在于:具体包括以下步骤: (1)制备I基因； (2)将I基因克隆进过渡空质粒，制备载有I基因的过渡载体A; (3)制备丝素轻链基因的polyA信号序列，并克隆到过渡载体A中，得到过渡载体B； (4)制备丝素重链基因启·动子及其下游信号肽相应的DNA序列Fib-HS，并克隆进过渡空质粒，制备得到载有Fib-HS基因的过渡载体C，所述Fib-HS是以家蚕皓月品种的基因组DNA为模板，以TS-Fib-H-1和Fib-HS-2为引物，通过常规PCR扩增获得，TS-Fib-H-1的序列如SEQ ID N0.3所示，Fib-HS-2的序列如SEQ ID N0.4所示； (5)以过渡载体B为模板，PCR扩增含有IGF-1基因和polyA信号序列的基因片段，然后克隆到过渡载体C中，得到过渡载体D ； (6)PCR扩增得到丝素轻链基因第I内含子中具有增强子功能的的序列，构建带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体pigA3GFP-en,所述序列是以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-5和TPFib_L_6为引物，通过常规PCR扩增获得，TPFib-L-5 的序列如 SEQ ID N0.7 所示，TPFib-L-6 的序列如 SEQ ID N0.8 所示； (7)酶切过渡载体D，回收丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制的 IGF-1 基因片段，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en获pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-polyA]，即得到带有增强子元件和丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因的转基因载体； (8)制备家蚕核型多角体病毒见-2基因启动子，克隆进过渡空质粒，制得含家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的过渡载体E ;制备Neo基因的编码序列及其下游的polyA信号序列，双酶切后克隆进同样双酶切的过渡载体E，制得带有家蚕核型多角体病毒见-1基因启动子控制新霉素抗性基因neo的重组载体，即过渡载体F ；(9)过渡载体F酶切后回收带有IE-1启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3GFP-en-[FibHS-1GF-p0lyA]质粒，即制得有丝素重链蛋白启动子及其下游信号肽相应的DNA序列控制IGF-1基因表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体，命名为pigA3-FibHS-1GF-en-ne0。
4.应用权利要求
1所述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体制备家蚕丝腺生物反应器的方法，其特征在于:将权利要求
1所述载有人胰岛素样生长因子-1基因的重组转基因载体与辅助质粒作混合，导入初产卵，孵化，筛选获得带有新霉素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到I基因，育种制成转基因家蚕，得到一种家蚕丝腺生物反应器。
5.一种生产口服降糖药物的方法，其特征在于，采用权利要求
4获得的转基因家蚕的丝腺组织经冷冻干燥后制成药物。
6.—种生产口服降糖药物的方法，其特征在于，收集权利要求
4获得的转基因家蚕的蚕茧，粉碎后制成药物。·
专利摘要
本发明公开了一种载有人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的重组转基因载体，所述重组转基因载体包括外源基因人胰岛素样生长因子-Ⅰ、启动子、增强子元件；构建所述重组转基因载体的转座子为piggyBAC转座子；所述启动子为丝素重链蛋白启动子；所述重组转基因载体还包括丝素重链蛋白启动子下游信号肽相应的DNA序列、家蚕丝素轻链fib-LpolyA信号位点的序列。应用该重组转基因载体制备得到生产IGF-Ⅰ的转基因家蚕，可以提高IGF-Ⅰ的表达水平，并且避免外源基因和杆状病毒的不安全性。
文档编号A61P3/10GKCN102250935 B发布类型授权 专利申请号CN 201110142537
公开日2013年9月4日 申请日期2011年5月30日
发明者贡成良, 曹广力, 薛仁宇, 郑小坚, 潘中华 申请人:苏州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),