专利名称:一种采用分段梯度供氧方式发酵生产l-谷氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及一种发酵生产L-谷氨酸的方法。
背景技术：
目前发酵法是生产谷氨酸的主要方法，其生产菌种主要包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)、纯齿棒杆菌(Corynebaclerium crenalum)、北京棒杆菌(Corynebaclerium pekinense)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)以及它们的突变株等。然而,谷氨酸发酵的生产水平除了取决于菌种本身的性能外，还必须给予其合适的环境条件才能够更加充分地发挥及表现出它们优良的生产能力，如培养基组成、温度、溶氧、补料等。
申请号为91107357.4的中国发明专利公开了一种L-谷氨酸发酵新工艺，为了同时提高L-谷氨酸发酵的产酸率及转化率，将发酵过程分割为菌体生长和产酸两个阶段，并用不同浓度的营养液(有机氮源和无机盐)分别加以控制，使菌体生长所消耗的糖尽量降低，使糖代谢的流向尽量转向有利于L-谷氨酸的合成，并使细胞透性增大，使产酸率达到
9-11%，总投入糖的转化率达到58-64%，然而其产酸率相对较低。
亚适量指微生物所处生长素浓度比其正常成长需要的浓度略低，但却对大量合成工艺需求产品有益的现象，亚适量工艺被广泛应用到谷氨酸发酵中。生物素作为生长因子主要影响细胞膜通透性和菌体的代谢途径，而生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累均有影响。由于大量合成谷氨酸需要菌体代谢异常化，实际所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低，因此通过限制培养基中生物 素的浓度(亚适量)，使磷脂合成不足，细胞膜通透性提高，有利于谷氨酸的分泌。
授权公告号为CN1049689C的中国发明专利公开了一种更经济和更有效地通过发酵工业制备L-谷氨酸的方法，其在含有浓度为10至1000 μ g/1的生物素而不加入抑制生物素活性的物质的液体营养培养基中培养能产生L-谷氨酸的短杆菌属和棒状杆菌属的微生物的突变株，在培养液中产生并大量积累L-谷氨酸。
除了采用亚适量工艺外，影响谷氨酸分泌的方法还包括:在培养基中添加表面活性剂或饱和脂肪酸可抵制脂肪酸的合成，从而影响磷脂合成；采用温度敏感型突变株，使其细胞膜的结构基因发生改变，使细胞膜不完整；添加青霉素、抗生素抵制糖肽转肽酶的合成，从而影响细胞壁糖肽的生物合成，形成不完全的细胞壁，增加膜的渗透性等。
如公开号为CN101457243A的中国发明专利公开了一种提高L-谷氨酸发酵产率的新工艺，根据甜菜碱具有提供甲基、调节体内渗透压、促进脂肪代谢和蛋白质合成等作用，提高酶活，促进菌体生长，实现产物在发酵液中的更大程度蓄积从而提高产率的原理，采用在发酵培养基中添加甜菜碱的方法来有效提高L-谷氨酸发酵产率。
谷氨酸生产菌为好氧菌，其对培养基中的溶解氧浓度有一个最低的要求，在此溶解氧浓度以下，其呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降。由于氧难溶于水，从而使谷氨酸发酵过程中氧的利用率低，仅为40%-60%。因此，氧的供应对谷氨酸发酵来说是一个关键因素，其不仅对菌体的生长和代谢产物的积累都有很大的影响，还直接关系到谷氨酸发酵的成败，研究供氧问题，对谷氨酸发酵工艺管理的最佳化和工艺过程的放大具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种采用分段梯度供氧方式控制谷氨酸发酵过程中溶氧浓度来发酵生产L-谷氨酸的方法。本发明发酵过程中氧的传递速率和利用率有所提高，并且发酵后L-谷氨酸的产量和糖酸转化率均有所提高，而发酵副产物乳酸大幅度下降。
为了达到上述目的，本发明一方面提供一种发酵生产L-谷氨酸的方法，将谷氨酸生产菌接种至发酵培养基中进行发酵，采用分段梯度供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，制得L-谷氨酸。
其中，所述分段梯度供氧方式具体包括:控制所述谷氨酸生产菌在其生长抑制期至对数生长期发酵液中的溶氧浓度为25-50%，优选为25-40%，进一步优选为25-35% ;所述谷氨酸生产菌在其转型期发酵液中的溶氧浓度为10-25%，优选为10-20%，进一步优选为
10-15%;所述谷氨酸生产菌在其产酸期发酵液中的溶氧浓度为1-10%，优选为1-5%，进一步优选为2-5%。
特别是，所述生长抑制期至对数生长期为发酵0_6h，此阶段菌体大量生长，所需溶氧浓度大；所述转型期为发酵6-10h，此阶段生长菌体和产酸，耗氧量大，但溶氧要开始降低，防止菌体过快衰老；所述产酸期为发酵IOh至发酵终止，此阶段用于产酸，含氧量明显降低，溶氧控制在较低水平，可维持较长时间的产酸期。
尤其是，在发酵过程中通过调节通气量和搅拌转速来进行所述分段供氧，其中控制初始通气量为l_2L/min，搅拌转速为500r/min_880r/min。
其中,所述 谷氨酸生产菌选自天津短杆菌(Corynebacterium tianjin)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、纯齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)中的一种。
特别是，所述谷氨酸生产菌优选为谷氨酸棒杆菌GKG-9、北京棒杆菌ASl.299、钝齿棒杆菌ASl.542、天津短杆菌T613中的一种；进一步优选为谷氨酸棒杆菌GKG-9，其保藏于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可以购买获得。
其中，所述发酵培养基的配方为:葡萄糖70_90g/L，Na2HPO4.12H201_5g/L，VB10.1-lmg/L, MgSO4.7Η200.5_2g/L，MnSO4.H201_3mg/L，FeSO4.7H201_3mg/L，KCll_3g/L，玉米浆l_5mL/L，糖蜜0.5-2g/L，发酵培养基的pH值为7.0-7.2。
特别是，所述发酵培养基的配方优选为:葡萄糖80g/L，Na2HPO4.12H202.5g/L，VB10.4mg/L, MgSO4.7H201g/L, MnSO4.H202mg/L, FeSO4.7H202mg/L, KCll.3g/L,玉米浆 3mL/L，糖蜜 1.lg/Lo
其中，所述发酵为补料分批发酵；采用补料分批发酵可以避免在分批发酵中因一次投料过多而产生的底物抑制、产物反馈抑制及分解代谢物阻遏等作用，从而减少菌体生
长量及提高糖酸转化率。
特别是，所述补料分批发酵具体包括:视所述发酵的发酵液中残留葡萄糖的情况来流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1.0-2.0%，其中所述葡萄糖溶液的浓度为80-90wt%。较低的残糖浓度可使发酵液具有低的渗透压，从而有利于谷氨酸向胞外分泌。
尤其是，自发酵液中残留葡萄糖的浓度为5-2%时开始流加所述葡萄糖溶液，优选自发酵液中残留葡萄糖的浓度为3-2%时开始流加所述葡萄糖溶液。
其中，采用间隔升温方式控制所述发酵的温度，所述间隔升温具体包括:控制发酵的起始温度为34°C，并且自发酵开始后每间隔4h使发酵温度升高0.5°C。由于谷氨酸发酵属于II型，而谷氨酸棒杆菌GDK-9为温度敏感型菌种，因此温度的控制既是菌体生长所需，也是细胞转型和产酸的关键。本发明采用间隔升温，使细胞逐渐从生长型转变为产酸型，从而避免了因原料的影响而造成产酸不稳定的现象，有利于L-谷氨酸的大量积累。
其中，所述发酵还包括:流加一定浓度的氨水，使发酵液的pH维持在7.0-7.4。特别是，所述氨水的浓度为20-30%，优选为25%。
特别是，所述发酵还包括:根据发酵罐中的泡沫情况流加15-25%，优选为20%的泡敌进行消泡。
其中，所述方法具体包括:先将所述谷氨酸生产菌接种于斜面培养基上活化12-16h至长出菌苔，然后 将所述菌苔接种于种子培养基中培养至对数生长中后期，得到种子液；再将所述种子液以一定的接种量接种至发酵培养基中，并在搅拌的方式下进行发酵，采用分段梯度供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，制得L-谷氨酸。
特别是，所述种子培养基的配方为:葡萄糖20_40g/L，玉米浆30_50mL/L，豆柏水解液 5-15mL/L, K2HPO4.3Η200.5_2g/L，MgSO4.7Η200.1-lg/L，尿素 l_5g/L，pH7.0-7.2 ;优选为葡萄糖 30g/L，玉米浆 40mL/L，豆柏水解液 10mL/L，K2HPO4.3Η201.0g/L, MgSO4.7H200.5g/L，尿素3g/L ;所述接种量为5-15%，优选为10% ;所述搅拌的速度为500r/min-880r/min，优选为 500-600r/min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点:
1、本发明的发酵方法只需设置溶氧梯度，发酵过程中的其它相关参数均可以由发酵罐控制器进行自动控制，操作不仅简单易行，而且有利于发酵工艺的放大以及实现谷氨酸工业化大规模生产；
2、本发明的发酵过程中氧的传递速率和利用率高、发酵所需的周期短，从而有利于降低动力费和操作费，提高经济效率；
3、本发明根据谷氨酸生长菌的生长和代谢特性来控制其发酵工艺，在菌体生长期的供氧不仅满足菌体生长，还有效避免了乳酸等副产物的积累及菌体老化速率的加快，发酵后谷氨酸的产量高、糖酸转化率高，副产物乳酸含量低。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、培养基配制[0033]斜面培养基(g/L):蛋白胨10，酵母粉 5，NaC12.5，琼脂 30，pH7.0-7.2,0.1MPa 灭菌 30min ；
种子培养基:葡萄糖30g/L，玉米浆40mL/L，豆柏水解液10mL/L，K2HPO4.3Η201.0g/L, MgSO4.7Η200.5g/L，尿素 3g/L, ρΗ7.0-7.2,0.1Mpa 灭菌 15min ；
发酵培养基:葡萄糖80g/L，Na2HPO4.12H202.5g/L，VB10.4mg/L，MgSO4.7H201g/L,MnSO4.H202mg/L, FeSO4.7H202mg/L, KCll.3g/L,玉米浆 3ml/L,糖蜜 1.1 g/L,培养基 pH 值为 7.0 7.2,0.1Mpa 灭菌 15min ；
2、发酵
将谷氨酸棒杆菌GKG-9接种于上述斜面培养基中进行活化，于32°C下培养20h长出菌苔；
从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于37°C、200r/min下振荡培养7-8h，制得种子液；
以10%的接种量将上述种子液接种至装有发酵培养基的5L发酵罐中，控制发酵罐起始培养温度为34°C，之后间隔4h升温0.5°C，采用分段梯度供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，设置初始通气量为1.5L/min，初始搅拌转速为600r/min，并且通过控制通气量(l_2L/min)和搅拌速度(500_880r/min)使谷氨酸棒杆菌GKG-9在其生长抑制期至对数生长期发酵液中的溶氧浓度为30-35%，所述谷氨酸生产菌在其转型期发酵液中的溶氧浓度维持在10-15%，所述谷氨酸生产菌在其产酸期发酵液中的溶氧浓度为2-5%，发酵过程中自动流加25%的氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2，根据发酵罐中的泡沫情况流加20%的泡敌进行消泡，当发酵液中的残糖含量降至2%左右时流加80%的葡萄糖溶液，使发酵液中葡萄糖浓度维持在1.0-2.0%的范围内；
·[0040]采用SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪测定葡萄糖、L-谷氨酸及L-乳糖的含量，其中发酵培养28h后，L-谷氨酸的产量为158g/L，糖酸转化率为64.7%，副产物L-乳酸的产量为1.0g/L。
实施例2
斜面培养基和种子培养基配方同实施例1 ;
发酵培养基:葡萄糖75g/L，Na2HPO4.12Η202.5g/L，VBJmg/L, MgSO4.7Η201.5g/L，MnSO4.H201mg/L, FeSO4.7H203mg/L, KC12g/L，玉米浆 4ml/L，糖蜜 1.8g/L，培养基 pH 值为
7.0 7.2,0.1Mpa 灭菌 15min ；
发酵过程中除接种量为5%，采用分段梯度供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，设置初始通气量为lL/min，初始搅拌转速为500r/min，并且通过控制通气量(l-2L/min)和搅拌速度(500_880r/min)使谷氨酸棒杆菌GKG-9在其生长抑制期至对数生长期发酵液中的溶氧浓度为25-30%，所述谷氨酸生产菌在其转型期发酵液中的溶氧浓度维持在15-20%，所述谷氨酸生产菌在其产酸期发酵液中的溶氧浓度为1-5%外，其余均与实施例I相同；发酵30h后，L-谷氨酸的产量为155g/L，糖酸转化率为64.1%，副产物L-乳酸的产量为1.lg/L0
实施例3
斜面培养基和种子培养基配方同实施例1 ;
发酵培养基:葡萄糖90g/L，Na2HPO4.12H201g/L, VB10.lmg/L, MgSO4.7H200.5g/L，MnSO4.Η202.5mg/L, FeSO4.7Η201.5mg/L，KCllg/L，玉米浆 2ml/L，糖蜜 0.5g/L，培养基 pH 值为 7.0 7.2,0.1Mpa 灭菌 15min ；
发酵过程中除接种量为15%，采用分段梯度供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，设置初始通气量为2L/min，初始搅拌转速为800r/min，并且通过控制通气量(l-2L/min)和搅拌速度(500_880r/min)使谷氨酸棒杆菌GKG-9在其生长抑制期至对数生长期发酵液中的溶氧浓度为40-45%，所述谷氨酸生产菌在其转型期发酵液中的溶氧浓度维持在20-25%，所述谷氨酸生产菌在其产酸期发酵液中的溶氧浓度为5-10%外，其余均与实施例I相同；发酵28h后，L-谷氨酸的产量为160g/L，糖酸转化率为64.9%，副产物L-乳酸的产量为1.0g/L。
实施例4
除采用天津短杆菌T613 (购自天津工业微生物研究所)进行发酵外，其余均与实施例I相同，发酵培养28h后，L-谷氨酸的产量为152g/L，糖酸转化率为63.5%，副产物L-乳酸的产量为1.8g/L。
对照例1GKG-9高溶氧发酵
发酵过程中除通过控制通气量(l_2L/min)和搅拌速度(500_880r/min)使发酵液中的溶氧浓度维持在40-45%外，其它发酵工艺控制同实施例1，发酵28h后，L-谷氨酸的产量为140g/L，糖酸转化率为60.8%，副产物L-乳酸的产量为6.0g/L。
对照例2GKG-9低溶氧发酵
发酵过程中除通过控制通气量(l_2L/min)和搅拌速度(500_880r/min)使发酵液中的溶氧浓度维持在10 -15%外，其它发酵工艺控制同实施例1，发酵28h后，L-谷氨酸的产量为132g/L，糖酸转化率为58.0%，副产物L-乳酸的产量为9.0g/L。
对照例3T613高溶氧发酵
发酵过程中除通过控制通气量(l_2L/min)和搅拌速度(500_880r/min)使发酵液中的溶氧浓度维持在40-45%外，其它发酵工艺控制同实施例4，发酵28h后，L-谷氨酸的产量为137g/L，糖酸转化率为58.6%，副产物L-乳酸的产量为6.5g/L。
对照例4T613低溶氧发酵
发酵过程中除通过控制通气量(l_2L/min)和搅拌速度(500_880r/min)使发酵液中的溶氧浓度维持在10-15%外，其它发酵工艺控制同实施例4，发酵28h后，L-谷氨酸的产量为130g/L，糖酸转化率为57.1%，副产物L-乳酸的产量为9.2g/L。
对照例5 —次升温发酵
发酵过程中除升温方式采用一次升温(即初始发酵温度为34°C，在发酵24h时升温至37°C)外，其它发酵工艺控制同实施例1，发酵28h后，L-谷氨酸的产量为142g/L，糖酸转化率为61.0%，副产物L-乳酸的产量为5.0g/L。
由上述对照例结果可知:
1、采用本发明分段梯度供氧方式进行发酵，GKG-9发酵后L-谷氨酸的产量达到155g/L以上，糖酸转化率提高至64%以上，副产物乳酸产量低至1.0g/L。
2、与维持高溶氧发酵相比，L-谷氨酸的产量提高了 10.7-14.3%，糖酸转化率提高了 5.4-6.7%，副产物L-乳酸降低了约83.3% ;与维持低溶氧发酵相比，L-谷氨酸的产量提高了 17.4-21.2%，糖酸转化率提高了 10.5-11.9%，副产物L-乳酸降低了约88.9%。[0064]3、与一次升温发酵相比，L-谷氨酸的产量提高了 9.2-12.7%，糖酸转化率提高了 5.1-6.4%，副产物L-乳酸降低了约80%。
权利要求
1.一种发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，将谷氨酸生产菌接种至发酵培养基中进行发酵，采用分段梯度供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，制得L-谷氨酸。
2.如权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述分段梯度供氧方式具体包括:控制所述谷氨酸生产菌在其生长抑制期至对数生长期发酵液中的溶氧浓度为25-50%，所述谷氨酸生产菌在其转型期发酵液中的溶氧浓度为10-25%，所述谷氨酸生产菌在其产酸期发酵液中的溶氧浓度为1_10%。
3.如权利要求
2所述的方法，其特征在于，所述生长抑制期至对数生长期为发酵0-6h，所述转型期为发酵6-10h，所述产酸期为发酵IOh至发酵结束。
4.如权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸生产菌选自天津短杆菌、北京棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、黄色短杆菌中的一种。
5.如权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸生产菌为谷氨酸棒杆菌GKG-9。
6.如权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为:葡萄糖70-90g/L, Na2HPO4.12H201_5g/L，VB10.1-lmg/L，MgSO4.7H200.5_2g/L，MnSO4.H201_3mg/L，FeSO4.7H201-3mg/L, KCll_3g/L，玉米浆 l_5mL/L，糖蜜 0.5_2g/L，发酵培养基的 pH 值为7.0-7.2。
7.如权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵为补料分批发酵。
8.如权利要求
7所述的方法，其特征在于，所述补料分批发酵具体包括:视发酵液中残留葡萄糖的情况来流加葡萄糖溶液，使发酵液中的葡萄糖浓度维持在1.0-2.0%。
9.如权利要求
1或2所述的方法， 其特征在于，采用间隔升温方式控制所述发酵的温度，其中所述间隔升温具体包括:控制发酵的起始温度为34°C，并且自发酵开始后每间隔4h使发酵温度升高0.5°C。
10.如权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵还包括:流加一定浓度的氨水，使发酵液的PH维持在7.0-7.2。
专利摘要
本发明公开了一种发酵生产L-谷氨酸的方法，将谷氨酸生产菌接种至发酵培养基中进行发酵，采用分段梯度供氧方式控制所述发酵的发酵液中的溶氧浓度，制得L-谷氨酸。本发明方法通过在谷氨酸生产菌发酵的抑制期、对数生长期、转型期和产酸期分别采用不同的溶氧浓度进行控制，并且通过补料分批发酵，使L-谷氨酸的产量达到155g/L以上，糖酸转化率提高至64%以上，此外发酵过程中的副产物乳酸大幅度下降。
文档编号C12P13/14GKCN103215323SQ201310127511
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月12日
发明者邱博, 谢希贤, 张成林, 万红兵, 欧阳宇红, 曹文杰 申请人:北京轻发生物技术中心, 天津科技大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan