与mcl1相互作用的重要调控激酶vrk2的制作方法

专利名称:与mcl1相互作用的重要调控激酶vrk2的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种激酶，更具体的，本发明涉及一种与MCL1相互作用的重要调控激酶VRK2，以及涉及筛选调节VRK2与MCL1相互作用的调节剂的方法。
背景技术：
所谓细胞凋亡是细胞主动死亡过程，在细胞的发育和疾病的发生中起重要作用。对于细胞凋亡信号传导途径的研究，近年来一直是生命科学领域的研究热点。2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。
细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化可以将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。对哺乳动物细胞凋亡的基因凋控过程目前还不十分清楚，研究表明与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因都参于对细胞凋亡的凋控。其中研究较多的就有bcl-2、c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。MCL1L是bcl-2家族成员之一，Bcl-2亦被称为细胞凋亡抑制基因，名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2，bcl-2)，最早由Tsujimoto(1985)从伴有14、18染色体易位的淋巴瘤细胞中发现，Bcl-2是目前发现的与凋亡关系密切的原癌基因之一。bcl-2家族包括bcl-2、bax、bad、bcl-x和MCL1(骨髓白细胞分化蛋白1，myeloid cell leukemia proteinl)等。MCL1被认为升高能促进细胞的发育和生存，MCL1降低能导致细胞的死亡。
“高质量”的药物靶点基因(简称药靶)是新药开发的源头。人类基因组计划的完成虽然为人类带来了治疗疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白药外，基因本身并不一定是药靶。从基因到新药，这一链条仍然缺少许多必不可少的环节。其中，基因功能研究，因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘，寻找出最重要的致病基因，而成为确定基因能否成为药靶的关键步骤。国外大型制药厂已发现，单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大量潜在药物靶点基因，但这类基因只能被归类为“低质量”药靶。药物开发人员面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从，迫切需要大量的基因功能研究加以验证，才能筛选出新药开发可以依赖的“高质量”靶点。所以，功能基因组学研究蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。
在目前可以作为靶点的5,000个基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性，是公认的药物筛选基因靶点，与磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各类受体统称为一类靶点。磷酸激酶(kinase)将ATP或GTP位的磷酯基转移到底物蛋白质氨基酸残基上，催化蛋白质磷酸化。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是蛋白质调节其功能/活性的一种重要方式。如MAPK和转录因子CREB，Jun等，在磷酸化状态时具有活性，而在非磷酸化状态时没有活性；而转录因子IκBα等则相反，在磷酸化状态时没有活性，而在非磷酸化状态时具有活性。
蛋白质的磷酸化-去磷酸化是细胞信号转导过程中的重要环节。细胞信号转导是指细胞通过位于胞膜或胞内的受体，感受细胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换，发挥生物学效应，进而几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。人类很多疾病都与信号转导通路密切相关，如在肿瘤坏死因子(TNF)导致的炎症(inflammation)反应中，肿瘤坏死因子通过结合受体激活一系列蛋白磷酸激酶之间的相互作用，最终激活NF-κB而引起炎症反应。生物化学家以及不少公司都在通过研究蛋白之间的相互作用来揭示信号传递通路的关键部位，并开发影响信号传递的药物，以达到治疗疾病的目的。信号转导过程的顺利进行有赖于多种蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化，而这个过程正是由磷酸激酶催化完成的。
鉴于信号转导通路在细胞增殖、分化和多种疾病发生过程中的重要、甚至决定性的作用，以及磷酸激酶在信号转导通路极其重要的地位，设计和开发以磷酸激酶为靶点的新药，通过调节、控制信号转导通路治疗疾病，无疑是一种针对性强、高效的理想途径，具有治疗多种疾病的潜在前景。目前针对激酶的药物包括PKC活性调节剂、PKA抑制剂、PTK抑制剂和受体介导的钙通道调节剂等，其中部分已经进入临床试验。
但现有的激酶药物靶点尚远远不能满足人类战胜疾病、攻克肿瘤的需求，本领域仍需更特异、更有效的新的激酶作为药靶，从而有效拓宽治疗疾病的途径，增进人类的健康。

发明内容本发明的目的在于提供一种与MCL1相互作用的重要调控激酶VRK2，其在药物筛选方面具有重要的用途。
在本发明的一个方面，提供一种磷酸激酶VRK2或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调控细胞凋亡的制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的制剂是含有磷酸激酶VRK2或其激动剂或拮抗剂的药物组合物。
在本发明的第二方面，提供一种筛选调节VRK2与MCL1相互作用的化合物的方法，包括步骤(a)在测试组中，向VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的反应体系中添加待筛选的候选物，并检测VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的反应体系中，检测RK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况；(b)将步骤(a)测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况与对照组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况进行比较，如果测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于；更优选的，测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用比对照组弱20％或更弱；最优选的测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用比对照组弱40％或更弱)对照组，就表明该候选物是抑制VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的抑制剂，如果测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用在统计学上强于(优选显著强于；更优选的，测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用比对照组强20％或更强；最优选的测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用比对照组强40％或更强)对照组，就表明该候选物是促进VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的促进剂。
在本发明的一个优选例中，所述的VRK2与MCL1相互作用选自(a)VRK2蛋白磷酸化MCL1蛋白；(b)VRK2蛋白与MCL1蛋白相互结合，形成复合物。
在本发明的一个优选例中，所述的VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的反应体系为免疫共沉淀体系；或为含有重组的VRK2蛋白与MCL1蛋白的溶液。
在本发明的一个优选例中，还提供了一种筛选调节VRK2激酶活性的调节剂的方法，包括以下步骤(a)在测试组中，向表达VRK2蛋白的细胞中添加待筛选的候选物，并检测细胞的凋亡情况；(b)将步骤(a)测试组中细胞的增殖情况与未添加候选物的对照组中细胞的凋亡情况进行比较，如果测试组中细胞的凋亡情况在统计学上低于(优选显著低于；更优选的，测试组中细胞的凋亡情况比对照组低20％或更低；最优选的，测试组中细胞的凋亡情况比对照组低40％或更低)对照组，就表明该候选物是促进VRK激酶活性的抑制剂；如果测试组中细胞的凋亡情况在统计学上高于(优选显著高于；更优选的，测试组中细胞的凋亡情况比对照组高20％或更高；最优选的，测试组中细胞的凋亡情况比对照组高40％或更高)对照组，就表明该候选物是抑制VRK2激酶活性的促进剂。
在本发明的第三方面，提供一种抑制VRK2与MCL1相互作用的抑制剂的用途，用于制备促进细胞凋亡的药物。
在本发明的第四方面，提供一种促进VRK2与MCL1相互作用的促进剂的用途，用于制备抑制细胞凋亡的药物。
在本发明的第五方面，提供一种用所述的方法获得的调节VRK2与MCL1相互作用的物质。
在本发明的第六方面，提供一种药物组合物，含有有效量的促进或抑制VRK2与MCL1相互作用的促进剂或抑制剂，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第七方面，提供一种VRK2蛋白的用途，用于筛选调节VRK2与MCL1相互作用的调节剂。
在本发明的一个优选例中，所述的相互作用选自(a)VRK2蛋白使MCL1蛋白磷酸化；(b)VRK2蛋白与MCL1蛋白相互结合，形成复合物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1.VRK2的结构域扫描结果。VRK2编码一个由508个氨基酸组成的蛋白质，其中，35-61位的氨基酸构成ATP结合位点，29-319位氨基酸构成其激酶结构域。
图2.将智人(Homo sapiens)VRK2的编码区与小鼠基因序列进行同源性比对，可见同源性达69％。
图3.VRK2与MCL1的免疫共沉淀(CO.IP)结果图。在293T细胞进行转染和免疫共沉淀后，可以看见VRK2和MCL1之间存在明显的相互作用。
图4.将VRK2的野生型和突变型构建到带有flag tag的哺乳动物表达载体，转染至293T细胞后，裂解细胞液。用Anti-Flag的抗体免疫沉淀后，进行磷酸化实验。可见Flag-VRK2能够自身磷酸化，而Flag-VRK2的ATP结合位点突变型(VRK2mut)则不能。
具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，成功地验证了VRK2(牛痘相关激酶2，vaccinia related kinase 2)的激酶活性，并且运用酵母双杂交和免疫共沉淀技术进一步证明了磷酸激酶VRK2与MCL1具有直接的相互作用。由于MCL1是bcl-2(又称细胞凋亡抑制基因)家族的一个成员，因此这一结果提示，VRK2与细胞凋亡的过程有着密切的关系，并且VRK2通过对MCL1L的相互作用，进一步抑制了细胞凋亡。
VRK2是一个现有技术中功能未明的激酶，它是VRK家族的3个成员之一。VRK家族被认为可能是一些转录因子的上游调节因子，除了已知VRK1能磷酸化P53的Thr18，从而抑制P53与mdm2相结合之外，这些蛋白的功能几乎都是未知的。本发明人采用酵母双杂交技术，以VRK2为诱饵，筛选Hela细胞、淋巴细胞、胎脑组织cDNA文库。结果筛选到bcl-2家族成员之一-MCL1。
为了排除酵母双杂交技术可能引起的假阳性，本发明人又运用PCR技术获得VRK2和MCL1基因。将这些基因分别与含Flag、Myc等tag的真核表达载体连接，然后共转染哺乳动物细胞293T，24-48h后，破碎细胞，用Flag、Myc等tag的抗体确定它们是否有共沉淀。实验结果再次证实了VRK2和MCL1之间确实存在着相互作用关系。
VRK2和MCL1基因的研究有着多方面的用途，这些用途包括(但不限于)筛选调节(促进或抑制)VRK2和MCL1蛋白相互作用的调节剂(促进剂或抑制剂)、从而达到控制细胞凋亡的目的。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节细胞凋亡有用的药物。
所述的VRK2蛋白和MCL1蛋白相互作用的促进剂或抑制剂，可以施用于个体，调节细胞的凋亡。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a)VRK2蛋白和MCL1蛋白相互作用的调节剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可以用于调节细胞凋亡。
通常，这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。
目前，已知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载体)和细胞中是本领域中的常规技术，一般人员只要根据本发明的提示，都可以方便的进行操作。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的多肽。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。在本发明的一个优选例中，采用了酵母双杂交系统来筛选与VRK2相互作用的蛋白。更具体的，在酵母细胞中，一种与DNA-结构域融合的诱饵蛋白与一种与活化域融合的猎物蛋白相互作用，所述猎物蛋白可以是已知的，也可以是从cDNA文库中选出来的。相互作用的成对分子结合于专一的序列模式，从而活化两个独立的报道基因的转录。
在本发明的一个优选例中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。免疫共沉淀技术的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。
本发明的主要优点在于(1)首次发现磷酸激酶VRK2与MCL1具有直接的相互作用，证明了VRK2与细胞凋亡的过程有着密切的关系，有利于开发通过调节VRK2来调节细胞凋亡的药物。
(2)有利于对现有技术中功能未明的磷酸激酶VRK2进行深入研究，为明确细胞凋亡的作用机制、进而为开发出崭新的药物靶点提供了有效的工具，从而可为人类战胜肿瘤、延缓衰老带来突破性进展。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1VRK2基因的获得本发明人从已建立的由GenBank中的EST序列合成、没有任何功能注释或注释不完全的“新”基因的cDNA文库中，应用现代生物信息学PFAM/Profile模式对磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、单过膜受体进行优先筛选，得到一个没有功能注释的基因(GenBank登录号NM_006296)，含有磷酸激酶结构域，为VRK2。为了获得VRK2基因的全长，本发明人设计了如下引物，以人体组织混合RNA为模板，通过常规PCR方法进行扩增。
上游引物(SEQ ID NO3)5’GGCCAATCCGGCCATGCCACCAAAAAGAAATGAAAAATACAAAC 3’下游引物(SEQ ID NO4)5’GGCCTCTAACGGCCTCAGAGAAAAAATAAAGCAAGAAATACTAACATCAAAAGGA 3’该对引物含有SfiI穿梭克隆位点、起始密码子和终止密码子，在该酶切位点之间是VRK2的编码序列。利用该对引物PCR扩增获得了一个大小约为1.5kb的条带，将此片断回收、克隆入载体后测序得到VRK2基因的全长序列，共1527bp(SEQ ID NO1)。
除了采用上述步骤获得VRK2基因的全长，还可以根据GenBank中提供的序列，采用人工合成的方法获得VRK2基因的全长。
实施例2VRK2序列分析本发明人所克隆的1527bp的序列中包含VRK2基因的完整编码区，编码一个由508个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO2)。其中，35-61位的氨基酸构成ATP结合位点，29-319位氨基酸构成激酶结构域，具体见图1。
将人VRK2的编码区与小鼠基因序列进行同源性比对，同源性达69％，具体见图2。
实施例3筛选与VRK2相互作用的蛋白由于蛋白才是生命活动的直接体现者，为了明确VRK2的功能，本发明人必须确定与其具有相互作用的蛋白。
采用Clontech公司的Gal4酵母双杂交系统进行筛选。将测序验证的VRK2基因通过SfiI克隆位点穿梭转移到改造过的融合质粒pGBKT 7载体(Clontech)上，以此作为诱饵(bait)，先后通过转化法(transformation)和点阵法(mating)对Hela、淋巴和胎脑文库(Clontech)进行大规模的筛选。
结果，获得了MCL1阳性克隆，即酵母双杂交方法筛选出与VRK2具有相互作用的蛋白MCL1。
实施例4用免疫共沉淀法验证VRK2与MCL1在哺乳动物细胞中的相互关系由于酵母双杂交系统本身可能产生假阳性，本发明人利用免疫共沉淀技术进一步在哺乳动物细胞中验证VRK2和MCL1的关系。
本发明人将VRK2基因通过SfiI位点克隆入已构建好的带有flag-tag的pcdef3真核表达载体，同时将MCL1通过SfiI位点克隆入已构建好的带有myc-tag的pcdef3真核表达载体(将myc全长基因克隆到pCDEF载体的BamHI和EcoRI酶切位点中，获得带有myc-tag的重组pCDEF真核表达载体，pCDEF载体参见美国专利US20020076415A1中所述)。分别利用anti-flag和anti-myc的单克隆抗体(购自Sigma)，通过Western-blot法(WB)检测VRK2和MCL1蛋白的表达情况。
结果见图3，从图中可以看出，Flag-VRK2和Myc-MCL1蛋白表达情况良好、表达量稳定。
为了明确VRK2和MCL1之间的关系，本发明人将VRK2和MCL1同时转染293T细胞。培养24小时后，裂解离心收集上清。用anti-flag抗体和Protein G(购自Sigma)免疫沉淀后，共沉淀产物经SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维膜上，用酶标anti-Myc抗体行蛋白免疫印迹杂交。
结果见图3，可以观察到VRK2和MCL1之间存在着相互作用。
另外，体外调亡实验表明，VRK2和MCL1的相互作用对细胞调亡有一定抑制作用。
实施例5用体外磷酸化技术研究VRK2的磷酸化作用为了确定VRK2确实具有激酶的活性，在本实施例中进行了VRK2的体外自身磷酸化实验。
首先用常规的定点诱变法构建了VRK2的ATP结合位点突变型VRK2mut(K61A)，即将SEQ ID NO2第61位的Lys置换为Ala，从而使SEQ ID NO2中的61位由K变为A。将VRK2及其突变型VRK2 mut都构建到带有Flag-tag的pcDNA3真核表达载体(将flag-tag基因克隆到pCDEF载体的BamHI和EcoRI酶切位点中，获得带有flag-tag的重组pCDEF真核表达载体)，转染293T细胞。培养24小时后，裂解细胞，收集上清。用带有anti-flag抗体的Protein G(购自Sigma)免疫沉淀后，取一半用于Western印迹法(WB)以鉴定VRK2的表达；另一半用激酶反应缓冲液(20mM Tris/HCL pH＝7.4，150mM NaCl，10mM MnCl2，50μM ATP，10mMMgCl2)平衡，然后加入10μCiγ-32P ATP，于30℃反应30min。加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，95℃变性5min后，离心将样品加入15％SDS-PAGE梯度胶电泳。电泳完毕，经干胶后，压X光片放射自显影。
结果见图4，显示VRK2具有激酶的活性，能够自身磷酸化，而当将它的ATP结合位点突变之后，其激酶的活性也消失了。
实施例6筛选调节VRK2与MCL1相互作用的化合物可通过免疫共沉淀的方法进行。VRK2与MCL1的反应体系的建立步骤参照实施例4。
建立对照组，即建立VRK2与MCL1相互作用的反应体系(建立方法参照实施例4)，其中不加入候选物质。
建立测试组，即建立VRK2与MCL1相互作用的反应体系(建立方法参照实施例4)，其中加入候选物质。
将测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况与未添加候选物的对照组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况进行比较，如果测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用在统计学上弱于对照组，就表明该候选物是抑制VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的抑制剂，如果测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用在统计学上强于对照组，就表明该候选物是促进VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的促进剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求
书所限定的范围。
序列表<110>上海睿星基因技术有限公司<120>与MCL1相互作用的重要调控激酶VRK2<130>053604<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1527<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgccaccaa aaagaaatga aaaatacaaa cttcctattc catttccaga aggcaaggtt 60ctggatgata tggaaggcaa tcagtgggta ctgggcaaga agattggctc tggaggattt 120ggattgatat atttagcttt ccccacaaat aaaccagaga aagatgcaag acatgtagta 180aaagtggaat atcaagaaaa tggcccgtta ttttcagaac ttaaatttta tcagagagtt 240gcaaaaaaag actgtatcaa aaagtggata gaacgcaaac aacttgatta tttaggaatt 300cctctgtttt atggatctgg tctgactgaa ttcaagggaa gaagttacag atttatggta 360atggaaagac taggaataga tttacagaag atctcaggcc agaatggtac ctttaaaaag 420tcaactgtcc tgcaattagg tatccgaatg ttggatgtac tggaatatat acatgaaaat 480gaatatgttc atggtgatat aaaagcagca aatctacttt tgggttacaa aaatccagac 540caggtttatc ttgcagatta tggactttcc tacagatatt gtcccaatgg gaaccacaaa 600cagtatcagg aaaatcctag aaaaggccat aatgggacaa tagagtttac cagcttggat 660gcccacaagg gagtagcctt gtccagacga agtgacgttg agatcctcgg ctactgcatg 720ctgcggtggt tgtgtgggaa acttccctgg gaacagaacc tgaaggaccc tgtggctgtg 780cagactgcta aaacaaatct gttggacgag ctcccccagt cagtgcttaa atgggctcct 840tctggaagca gttgctgtga aatagcccaa tttttggtat gtgctcatag tttagcatat 900gatgaaaagc caaactatca agccctcaag aaaattttga accctcatgg aataccttta 960
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权利要求
1.一种磷酸激酶VRK2或其激动剂或拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备调控细胞凋亡的制剂。
2.一种筛选调节VRK2与MCL1相互作用的化合物的方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的反应体系中添加待筛选的候选物，并检测VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的反应体系中，检测VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况；(b)将步骤(a)测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况与对照组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用情况进行比较，如果测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用在统计学上弱于对照组，就表明该候选物是抑制VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的抑制剂；如果测试组中VRK2蛋白与MCL1蛋白的相互作用在统计学上强于对照组，就表明该候选物是促进VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的促进剂。
3.如权利要求
2所述的方法，其特征在于，所述的VRK2与MCL1相互作用选自(a)VRK2蛋白磷酸化MCL1蛋白；或(b)VRK2蛋白与MCL1蛋白相互结合，形成复合物。
4.如权利要求
2所述的方法，其特征在于，所述的VRK2蛋白与MCL1蛋白相互作用的反应体系为免疫共沉淀体系；或为含有重组的VRK2蛋白与MCL1蛋白的溶液。
5.一种抑制VRK2与MCL1相互作用的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备促进细胞凋亡的药物。
6.一种促进VRK2与MCL1相互作用的促进剂的用途，其特征在于，用于制备抑制细胞凋亡的药物。
7.一种用权利要求
1-4任一所述的方法获得的调节VRK2与MCL1相互作用的物质。
8.一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的促进或抑制VRK2与MCL1相互作用的促进剂或抑制剂，以及药学上可接受的载体。
9.一种VRK2蛋白的用途，其特征在于，用于筛选调节VRK2与MCL1相互作用的调节剂。
10.如权利要求
9所述的用途，其特征在于，所述的相互作用选自(a)VRK2蛋白使MCL1蛋白磷酸化；或(b)VRK2蛋白与MCL1蛋白相互结合，形成复合物。
专利摘要
本发明提供了一种磷酸激酶VRK2(牛痘相关激酶2，vaccinia related kinase2)蛋白，所述的VRK2蛋白可以和凋亡相关蛋白MCL1发生直接的相互作用。本发明还提供了用重组技术产生这种蛋白的方法，并首次证实了VRK2的激酶活性，从而提示了通过调节VRK2与MCL1相互作用可调节细胞凋亡。
文档编号C12N9/12GK1990860SQ200510112075
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月27日
发明者孙筱清, 束放 申请人:上海睿星基因技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan