专利名称:重组人α1－胸腺肽生产方法及制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药技术领域：
，具体涉及重组人α1-胸腺肽的生产方法及制剂。
背景技术：
α1-胸腺肽(α1-thymosin，Tα1)是Goldstein等于1977年首次在胸腺组织中发现，在体内主要存在于胸腺细胞、T-淋巴细胞以及胸腺组织中，在肝、肾、心、肺、脾等器官也有分布，在体内它是由111个氨基酸组成的前体α1-胸腺肽原(prothymosin)经酶解加下产生。成熟的人α1-胸腺肽由28个氨基酸组成，分子量3.108KD，等电点4.2，其序列为Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-ILe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。
人α1-胸腺肽在人体血清中的正常浓度大约为540-670pg/mL，其主要生理功能为调节机体的免疫活性，包括刺激多能干细胞分化为胸腺细胞，促进T-细胞的分化和成熟，增强T细胞的功能，并使CD3+和CD4+等细胞的数量升高等。做为一种广谱免疫调节剂，α1-胸腺肽临床用途包括用于治疗乙型、丙型肝炎；作为免疫辅助药物；用于肿瘤和艾滋病治疗等。此外人α1-胸腺肽还与细胞周期的调控，血管生长，细胞迁移，组织修复以及精子的穿透能力等相关。
胸腺肽市场广阔，仅以治疗乙型肝炎为例，全球约有20亿人曾经感染过乙型肝炎病毒，其中有3.5亿患者转化为乙型肝炎病人。中国为乙型肝炎高发病率国家之一，估计约有1.2亿乙型肝炎病人。针对乙肝的治疗目前效果最显著的方法就是补充细胞因子，调节自身免疫力，α1-胸腺肽单独或联合其他药物共同作用是治疗病毒性肝炎的首选方法之一，每年将产生接近10亿元的市场销售。
目前国内生产的胸腺肽大多是从动物胸腺中提取，由于提取物为混合物，有效成分浓度低，疗效不够理想，且混合物中含动物蛋白，注射时可能会引起过敏反应。而且因为来源不够稳定，使得质量控制更为困难。目前美国等欧美国家已经禁止临床使用动物来源胸腺肽药品。
近年国外人α1-胸腺肽药品多采用化学合成方法制备，化学合成的优点是产物纯度与活性较高，但是传统的多肽合成方法一般只能合成10个氨基酸以下的多肽，对于28个氨基酸的α1-胸腺肽来说，合成难度非常大，产量较低，很难满足市场化需要。例如商品名为“日达仙”的胸腺肽药物每支含量为1.6mg，价格为800元以上，一个疗程为5万多元，价格昂贵，普通病人难以承受。
发明内容针对已有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种可以大规模、低成本生产人α1-胸腺肽的方法。
本发明的另一目的在于提供由该方法生产的人α1-胸腺肽制剂。
具体地说，本发明通过基因工程的手段，克隆得到人α1-胸腺肽基因并连接到表达载体，构建重组基因工程菌，通过高密度发酵与纯化，制备高纯度的重组人α1-胸腺肽多肽蛋白。
实现本发明发明目的的技术方案如下一种人α1-胸腺肽的生产方法，该方法依次包括如下步骤(1)人α1-胸腺肽基因工程菌的构建α1-胸腺肽基因通过化学方法合成或者通过PCR法从人cDNA文库中扩增得到，其合成基因包含SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点或化学裂解点—人α1-胸腺肽基因—终止的碱基序列，然后通过内切酶酶切，将人α1-胸腺肽基因克隆至表达载体中，表达载体转入宿主菌得到基因工程菌(2)将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵，通过IPTG诱导或温度诱导，表达大量的可溶性的重组人α1-胸腺肽；所述液体培养和发酵所使用的培养基为LB培养基及M9培养基中的一种或二者的混合物，二者的配比为LB∶M9＝1∶0.1-1∶10；(3)重组人α1-胸腺肽的纯化发酵生产的重组人α1-胸腺肽经过菌体破碎、离心、浓缩、层析手段得到融合蛋白，通过蛋白酶切、化学裂解方式，结合亲和层析及脱盐得到较高纯度的重组人α1-胸腺肽多肽；所述步骤(1)具体是a、按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，化学合成以下DNA片断5’-CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTT AAC TTT AAG AAG GAG ATATAC ATA TGT CTG GAT CAG GTC ATC ATC ATC ATC ATC ATT CTT CTG GTACCG ATG ACG ACG ACA AGA GCG ATG CCG CCG TGG ATA CCA GCA GCGAAA TTA CCA CCA AAG ATC TGA AAG AAA AAA AAG AAG TGG TGG AAGAAG CCG AAA ACT AAG ACT AGT GAA TTC AC-3’；b，将该片断用内切酶酶切，凝胶回收，构建PET系列表达载体或pGEM质粒，转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行重组质粒的序列测定；c、序列正确的表达载体转化宿主菌，得到基因工程菌；其中(1)步骤中所述的纯化标签为His-tag或GST，蛋白酶为肠激酶、凝血酶或Xa因子，所述的化学裂解试剂为溴化氰，所使用的表达载体包括PET系列、pGEM质粒，所述宿主菌为大肠杆菌，包括DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)。
所述步骤(3)中取菌体按比例加入咪唑-NaCl-PB破菌缓冲液中，进行高压匀浆破菌，破菌操作压力为70Mpa～80Mpa，离心收集上清液。将离心收集的上清液装入金属镍离子螯合亲和层析柱内，用缓冲液咪唑-NaCl-PB平衡至基线平稳，pH值为8.0，咪唑-NaCl-PB洗脱收集人α1-胸腺肽融合蛋白主峰；再使用Phenyl Sepharose进行疏水层析，收集穿透峰，SDS-PAGE检测；使用G-25脱盐，收集α1-胸腺肽融合蛋白主峰；10倍稀释溶解于含CaCl2的PB中，pH值为7.0，加入肠激酶进行酶解；酶解后使用Source 30RPC介质，在AKTA explorer上进行反相层析，梯度洗脱，收集主峰，并经G-25脱盐除去乙腈即得到高纯度的重组人α1-胸腺肽。
所述的菌体破碎方法包括溶菌酶裂解、化学裂解、超声破碎、高压匀浆，所述的层析方法包括亲和层析、疏水层析、反相层析、离子层析或几种方法的组合。
将得到的纯度较高的重组人α1-胸腺肽多肽原液，根据要求在无菌条件下加入注射用水配置的缓冲液和保护剂，进行稀释，并在分装密封以后进行冻干，制备注射用重组人α1-胸腺肽粉针剂；所述每只针剂中含重组人α1-胸腺肽0.5-30mg；所述保护剂包括甘露醇、甘油、甘氨酸、蔗糖、乳糖、葡萄糖的其中一种或几种。
本发明制备的重组人α1-胸腺肽，单独应用或与其它药物联合使用，用以治疗或者预防病毒性流行性感冒、非典型性肺炎(SARS)、肝炎、免疫功能低下、恶性肿瘤等疾病，或者作为辅助用药，用以肿瘤化疗后免疫功能的恢复。
本发明所述的人α1-胸腺肽制备方法具有可保证产品质量一致性，不受原料来源限制，且成本较低，可以大规模生产等许多优点，所生产的产品可以作为注射制剂，用于免疫功能低下等疾病的预防、治疗和辅助治疗。
下面的附图用于说明本发明的具体实施方案。
图1为表达质粒pET-32a-Tα1的构建过程图；图2为本发明的工艺流程图；图3重组人α1-胸腺肽的纯化工艺流程图。
具体实施方式下面结合具体实施例及附图1-图3，进一步详述本发明是如何实施的。实施例旨在举例阐述本发明的实施方式，而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均在本发明专利申请权利要求
的范围内。
说明书及以下实施例中所用质粒、菌体等，以及未注明具体条件的实验方法，可按本领域技术人员所掌握的常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1高表达人α1-胸腺肽的基因工程菌构建1、人α1-胸腺肽基因全长碱基序列获得按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，合成以下DNA片断5’-CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTT AAC TTT AAG AAG GAG ATA TACATA TGT CTG GAT CAG GTC ATC ATC ATC ATC ATC ATT CTT CTG GTA CCGATG ACG ACG ACA AGA GCG ATG CCG CCG TGG ATA CCA GCA GCG AAATTA CCA CCA AAG ATC TGA AAG AAA AAA AAG AAG TGG TGG AAG AAGCCG AAA ACT AAG ACT AGT GAA TTC AC-3’该片段依次包含SD序列、纯化标签His-tag、肠激酶酶切位点、全长人α1-胸腺肽基因和终止密码子。
2、将该片段在37℃水浴中用XbaI/EoRI双酶切，凝胶回收，与pET-32a(+)的XbaI/EoRI双酶切回收的大片段连接，构建表达载体pET-32a-Tα1(如图1所示)；转化大肠杆菌DH5α制备的感受态细胞；挑取阳性克隆，用酶切法、PCR法和测序法鉴定；3、序列鉴定正确的pET-32a-Tα1载体转化宿主菌，扩增培养，使用IPTG诱导，收集菌体，超声破碎，离心并收集上清液，SDS-PAFE电泳显示，诱导后有大量人α1-胸腺肽融合蛋白表达。
实施例2基因工程菌发酵1、将构建完成的基因工程菌取接种于100ml LB培养基中(含100ug/ml氨苄青霉素)，37℃摇瓶培养12-14h；按照10％接种量吸取菌液加入到500ml LB培养基中，37℃，230r/min摇瓶培养6h，完成种子液制备；2、在30升发酵罐(瑞士Bioengineering公司)中将种子液按5％接种量加入装有12L M9+LB培养基的发酵罐中，37℃，300r/min培养，通气量为10L/min，控制pH值在7.0左右，溶氧控制30％以上，培养至OD600约为12时，开始补加补料培养基，于第OD600约为18时，加入IPTG诱导，至终浓度为0.8mmol/L，控制溶氧曲线和pH基本平稳但略有下降，诱导4h后收菌，完成发酵。
实施例3重组人α1-胸腺肽纯化(参见附图2)1、收集菌体，6000～7000g连续流或分批离心，每批离心时间8～10分钟；沉淀菌体用破菌缓冲液[30mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)]悬浮，进行高压匀浆破菌，破菌时采用的操作压力为70Mpa～80Mpa，镜检破菌完成后离心除去杂质；2、制备金属镍离子螯合亲和层析柱，取Chelating Sepharose FF 180mL(Amersham Biosciences公司)装柱，用50mmol/L NiSO4溶液洗涤3个柱体积进行挂Ni2+；将上述离心上清液(或通过超滤浓缩的上清液)上样，用缓冲液[30mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)]平衡至基线平稳；60mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)淋洗杂蛋白至基线平衡，100mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)洗脱收集人α1-胸腺肽融合蛋白主峰；再使用Phenyl Sepharose(Amersham Biosciences公司)20ml进行疏水层析，收集穿透峰，SDS-PAGE检测；3、使用G-25 50mL脱盐，收集α1-胸腺肽融合蛋白主峰；10倍稀释溶解于含1mmol/L CaCl2的20mmol/L PB(pH7.0)中，加入肠激酶进行酶解；酶解后溶液上金属镍离子螯合亲和层析柱，80mmol/L咪唑-100mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)洗脱得到α1-胸腺肽多肽；使用Source 30RPC 20mL介质，在AKTA explorer上进行反相层析，梯度洗脱(流动相为A液20mmol/L KH2PO4(pH5.9)，B液乙腈；B液从0-30％)收集主峰，并经G-25脱盐除去乙腈即得到纯度＞95％的重组人α1-胸腺肽。
本发明得到的1-胸腺肽的主要技术指标及检测方法如下1、人α1-胸腺肽分子量测定采用三羟甲基甘氨酸-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)法测定，制备16％T，6％C的分离胶和6％T，3％C的浓缩胶(90mm×70mm×0.75mm)。先50V恒压约1.5小时，当样品进入分离胶后，电压升到70V约2小时，经0.2％考马斯亮兰R-250染色，与对照品和分子量标准比较。两者表观分子量相同，但因含有较多负电荷氨基酸，与理论值(3108)不符。
2、人α1-胸腺肽等电点测定等电聚焦—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，采用Pharmacia LKB公司仪器，玻璃纸作为支持膜，配制7.5％胶做凝胶膜片。将凝胶膜片铺在4℃的平板上，分别放上浸有电极液的阴、阳电极条，调节电压2000V，电流10mA，功率10W，进行预电泳10min，加样后调节电压2000V，电流15mA，功率15W，电泳80min，切断电源，结束聚胶，观察主区带位置。样品PI值为3.79，比对照品略小，是在N段缺少乙酰化的结果。
3、人α1-胸腺肽纯度测定以高压液相层析方法检测，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Hypersil BDS250mm×4.6mm，5μm)；以磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾9.5克，溶于1600mL水中，用1mol/L NaOH调pH值至5.7，加水稀释至2000m L)为流动相A，乙睛为流动相B，流速为1.0m L/min，按0-20min中流动相B从0-30％的梯度洗脱，检测波长为210mm，进样量为20μL，测得样品纯度为98.3％。
4、人α1-胸腺肽生物活性测定按照文献方法(“合成胸腺素α1的生物活性研究”，药物生物技术，1998，5(2)103)，生物活性以使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其E受体的功能的增高率为表示单位，在对照品和样品均在100μg/mL的浓度作用下，样品组增高率为24.39％，好于对照组19.17％。
SEQUENCE LISTING<110>上海华新生物高技术有限公司<120>重组人α1-胸腺肽生产方法及制剂<140>CurrentAppNumber200510112134.3<141>CurrentFilingDate2005-12-28<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>206<212>DNA<213>Human<400>1cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgtct ggatcaggtc 60atcatcatca tcatcattct tctggtaccg atgacgacga caagagcgat gccgccgtgg 120ataccagcag cgaaattacc accaaagatc tgaaagaaaa aaaagaagtg gtggaagaag 180ccgaaaacta agactagtga attcac 206
权利要求
1.一种人α1-胸腺肽的生产方法，该方法依次包括如下步骤(1)人α1-胸腺肽基因工程菌的构建α1-胸腺肽基因通过化学方法合成或者通过PCR法从人cDNA文库中扩增得到，其合成基因包含SD序列—纯化标签—蛋白酶切位点或化学裂解点—人α1-胸腺肽基因—终止的碱基序列，然后通过内切酶酶切，将人α1-胸腺肽基因克隆至表达载体中，表达载体转入宿主菌得到基因工程菌；(2)将构建完成的基因工程菌进行液体培养和发酵，通过IPTG诱导或温度诱导，表达大量的可溶性的重组人α1-胸腺肽；所述液体培养和发酵所使用的培养基为LB培养基及M9培养基中的一种或二者的混合物，二者的配比为LB∶M9＝1∶0.1-1∶10；(3)重组人α1-胸腺肽的纯化发酵生产的重组人α1-胸腺肽经过菌体破碎、离心、浓缩、层析手段得到融合蛋白，通过蛋白酶切、化学裂解方式，结合亲和层析及脱盐得到较高纯度的重组人α1-胸腺肽多肽。
2.根据权利要求
1所述的人α1-胸腺肽的生产方法，其特征在于所述步骤(1)具体是a、按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，化学合成以下DNA片断5’-CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTT AAC TTT AAG AAG GAG ATATAC ATA TGT CTG GAT CAG GTC ATC ATC ATC ATC ATC ATT CTTCTG GTA CCG ATG ACG ACG ACA AGA GCG ATG CCG CCG TGG ATACCA GCA GCG AAA TTA CCA CCA AAG ATC TGA AAG AAA AAA AAGAAG TGG TGG AAG AAG CCG AAA ACT AAG ACT AGT GAA TTC AC-3’；b，将该片断用内切酶酶切，凝胶回收，构建PET系列表达载体或pGEM质粒，转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆，进行重组质粒的序列测定；c、序列正确的表达载体转化宿主菌，得到基因工程菌。
3.根据权利要求
1或2任意一项权利要求
所述的人α1-胸腺肽的生产方法，其特征在于其中(1)步骤中所述的纯化标签为His-tag或GST，蛋白酶为肠激酶、凝血酶或Xa因子，所述的化学裂解试剂为溴化氰，所使用的表达载体包括PET系列、pGEM质粒，所述宿主菌为大肠杆菌，包括DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)。
4.根据权利要求
1或2任意一项权利要求
所述的人α1-胸腺肽的生产方法，其特征在于所述步骤(3)中取菌体按比例加入咪唑-NaCl-PB破菌缓冲液中，进行高压匀浆破菌，破菌操作压力为70Mpa～80Mpa，离心收集上清液。
5.根据权利要求
4所述的人α1-胸腺肽的生产方法，其特征在于将离心收集的上清液装入金属镍离子螯合亲和层析柱内，用缓冲液咪唑-NaCl-PB平衡至基线平稳，pH值为8.0，咪唑-NaCl-PB洗脱收集人α1-胸腺肽融合蛋白主峰；再使用Phenyl Sepharose进行疏水层析，收集穿透峰，SDS-PAGE检测；使用G-25脱盐，收集α1-胸腺肽融合蛋白主峰；10倍稀释溶解于含CaCl2的PB中，pH值为7.0，加入肠激酶进行酶解；酶解后使用Source 30RPC介质，在AKTA explorer上进行反相层析，梯度洗脱，收集主峰，并经G-25脱盐除去乙腈即得到高纯度的重组人α1-胸腺肽。
6.将权利要求
1-5得到的高纯度重组人α1-胸腺肽原液，在无菌条件下加入注射用水配置的缓冲液和保护剂，进行稀释，并在分装密封以后进行冻干，制备出注射用重组人α1-胸腺肽粉针剂，每只针剂中含重组人α1-胸腺肽0.5-30mg。
7.根据权利要求
6所述的重组人α1-胸腺肽粉针剂，其特征在于所述保护剂包括甘露醇、甘油、甘氨酸、蔗糖、乳糖、葡萄糖的其中一种或几种。
专利摘要
本发明公开了生产人α1－胸腺肽的方法及由该方法生产的人α1－胸腺肽制剂，该方法包括人α1－胸腺肽基因工程菌的构建、基因工程菌的液体培养和发酵，重组人α1－胸腺肽的纯化等步骤。本发明所述的入α1－胸腺肽生产方法具有可保证产品质量一致性，不受原料来源限制，且成本较低，可以大规模生产等优点，所生产的产品可以作为注射制剂，用于免疫功能低下等疾病的预防、治疗和辅助治疗。
文档编号C12N15/12GK1990862SQ200510112134
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月28日
发明者常志远, 杨忠, 王伟 申请人:上海华新生物高技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan