专利名称:乙型肝炎病毒前s1区多表位抗原的基因克隆及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域：
，具体涉及一种乙型肝炎病毒前S1区(PreS1)多表位抗原的基因克隆pres1me及其编码蛋白PRES1ME与它们在乙肝疫苗制备及乙型肝炎病毒前S1抗体或抗原诊断中的应用。
背景技术：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)的感染是一个很严重的全球性的健康问题。在中国、东南亚及非洲等高发地区，约有10％人口感染或曾经感染过HBV。HBV基因组包括4个互相具有不同程度重叠的开放阅读框架(ORF)。ORF-S编码乙肝表面抗原主蛋白、中蛋白和大蛋白，它们分别由同一阅读框内的3个不同部位的ATG起始编码，因而具有相同的C末端。大蛋白在中蛋白起始密码子上游开始翻译，它比中蛋白分子的N端多一段长度为119或108个氨基酸序列的PreS1区域。
乙肝PreS1区域为乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白的重要组成部分，主要存在于Dane颗粒和管型颗粒上，参与HBV的组装、分泌和侵入肝细胞的机制，在HBV感染肝细胞和机体免疫应答方面起重要作用[参见Ryu CJ.等人，JMed Virol，52(2)226-233(1997)]。有研究表明，PreS1抗体的产生对于乙肝急性感染的恢复和慢性乙肝患者病情的缓解具有重要意义[分别参见Wei J.等人，World J Gastroenterol，8(2)276-281(2002)；Wei J.等人，Clin ChimActa，317(1-2)159-169(2002)；Budkowska A.等人，Hepatology，6(3)360-383(1986)]。PreS1区域高度亲水，不含Cys残基，不存在二硫键，因此用PreS1部分序列的合成肽或基因表达产物来研究该区域表位及其相关抗体成为可能。PreS1(21～47aa)肽段是HBV特异性结合肝细胞的主要位点，同时，PreS1序列中含有丰富的T细胞与B细胞表位，其中相当一部分位于21～47aa区域，因而PreS1(21～47aa)区段具有良好的免疫原性，在HBV感染早期就能诱导产生相应抗体[分别参见Neurath AR.等人，Cell，46(3)429-436(1986)；Hui J.等人，Vaccine，17(13-14)1711-1718(1999)]。抗PreS1(21～47aa)抗体参与病毒的清除和中和，具有保护作用，被认为是预示乙肝患者康复的重要标志，因此，抗PreS1(21～47aa)抗体的检测具有重要的临床诊断意义。
除此之外，众多文献也对PreS1中的抗原表位进行了报道，其中ad型PreS1中可能含B细胞表位的区段主要有preS1(16-27)，preS1(32-53)，preS1(41-53)，preS1(94-105)和preS1(106-117)[参见Milich DR.等人，JImmunol，138(12)4457-4465(1987)]，pres1(30-35)[参见Kuttner G.等人，Mol Immunol，36(10)669-683(1999)]，preS1(19-26)和preS1(37-45)[参见Maeng CY.等人，Virology，270(1)9-16(2000)]，preS1(37-43)[参见Pizarro JC.等人，FEBS Lett，509(3)463-468(2001)]，preS1(12-52)[参见Petre J.等人，Arch Virol Suppl，4137-141(1992)]，preS1(1-42)[参见Prange R.等人，J Gen Virol，76(Pt 9)2131-2140(1995)]，preS1(27-35)和preS1(72-78)[参见Kuroki K.等人，Virology，176(2)620-624(1990)]，preS1(34-59)[参见Hu WG.等人，Acta Biochimica et BiophysicaSinica，36(6)397-404(2004)]，ay型Pres1中可能含B细胞表位的区段主要有preS1(37-43)[参见Pizarro JC.等人，FEBS Lett，509(3)463-468(2001)]，这些表位均被尝试用于新型乙肝疫苗的研制以及PreS1抗体的检测等研究中。
抗PreS1抗体检测的方法已有相关文献报道[分别参见Theilmann L.等人，Hepatology，6(2)186-190(1986)；Alberti A.等人，Hepatology，12(2)199-203(1990)]，基本上是以人工合成PreS1肽段作为包被抗原的间接ELISA，但往往在灵敏度、稳定性等方面尚有不足之处。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计更有效的乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原的基因克隆及其编码序列。
本发明提供一种乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原的基因克隆pres1me及其编码序列PRES1ME。
本发明构建的pres1me包含了HBV基因组Pres1区中B细胞表位基因4条。各表位的氨基酸序列见序列表1(SEQ ID NO.1)。
1.本发明将各表位之间以七个氨基酸的编码序列为接头，通过PCR方法合成由上述4条表位基因串联而成的多表位抗原的基因克隆。但各表位抗原基因的设计，是采用大肠杆菌偏性密码子并适当应用毕赤酵母偏性密码子，以便既可在原核细胞中表达，也可在真核细胞中表达。表位之间接头的设计，采用各表位之间为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸，以使各表位相对独立。
pres1me的核苷酸序列如下atgccattaggtttcttcccagaccaccaattagacccagctttcggtgctaactctaacaacccagacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccccattaggtttcttcccagaccaccaattcgacccagctttcaaagctaactctgacaacccagactccgacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccggtggtttattaggttggtctggtgccggtgcctcttcctccttcggtgctaactctaacaacccagactgggacttcaacttcaacaaagaccactggccagaagctaaccaagttggttag。
本发明的另一目的是提供了乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原基因克隆pres1me的构建，采用混合PCR合成基因和酶切、连接相结合的方法，包括如下步骤1、合成相应的9条寡核苷酸片段，这26条寡核苷酸片段中分别有相应片段在5′端和3′端彼此互补。其中5′端互补的片段编号分别为2号和3号、4号和5号、6号和7号、8号和9号；3′端互补的片段编号分别1号和2号、3号和4号、5号和6号、7号和8号；9条寡核苷酸片段的核苷酸序列见序列表2(SEQ ID NO.2)，该9条寡核苷酸片段既是引物也是模板。
2、用混合PCR方法，将序列表2中9条寡核苷酸片段合成本发明全长基因克隆pres1me；将pres1me与原核或真核重组表达载体连接并转化相应菌株或细胞后，可表达pres1me编码的蛋白PRES1ME。
PRES1ME的氨基酸序列如下METProLeuGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerProLeuGlyPhePheProAspHisGlnPheAspProAlaPheLysAlaAsnSerAspAsnProAspSerAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerGlyGlyLeuLeuGlyTrpSerGlyAlaGlyAlaSerSerSerPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTrpAspPheAsnPheAsnLysAspHisTrpProGluAlaAsnGlnValGly。
本发明的乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原基因克隆pres1me及其编码蛋白PRES1ME具有如下特点1、应用大肠杆菌偏性密码子并兼顾应用毕赤酵母偏性密码子来设计基因，使pres1me基因在原核和真核细胞中都能得到有效表达，为规模型生产奠定基础。
2、各表位之间用甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸分开，为各表位都能被有效提呈提供了条件。
3、利用乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原基因克隆，可以研制多种乙肝肝病毒前S1区抗体或抗原的检测试剂，用于HBV患者的诊断，可以研制多种形式、兼有防治功能的乙型肝炎侯选疫苗，用于HBV感染的防治。
图1.pMD-PRES1ME重组质粒结构示意图图2.pres1me基因合成示意图图3.重组质粒pMD-PRES1ME的构建流程图图4.原核融合表达质粒pGEX-PRES1ME的构建流程图图5.鼠抗GST-PRES1ME血清与4条Pres1区表位合成肽及基因工程表达的乙肝前S1蛋白的交叉反应性图具体实施方式
乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原基因克隆(pres1me)的具体构建方法如下一、合成pres1me基因所需的9条寡核苷酸片段(见SEQ ID NO.2，由上海申能博彩生物技术公司合成)。
二、9条寡核苷酸片段既是引物也是模板，经PCR反应合成乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原基因，PCR合成和拼接反应均应用ExpandTM Long TemplatePCR系统。
pres1me基因的合成(图2)1-9号寡核苷酸片段(30μM) 各0.5μldNTP(10mM) 2.0μl10×PCR buffer 5.0μlDNA聚合酶混合液(10单位/μl) 1.0μl灭菌重蒸水 35μl按下述条件进行PCR反应94℃30秒、65℃30秒、74℃1分钟，进行35个循环，然后74℃延伸10分钟。
三、按常规将PCR合成后纯化的pres1me基因与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布Amp+琼脂培养平板，37℃过夜，挑取8个克隆进行小量质粒抽提，所得质粒经酶切及1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认获得阳性克隆。重组质粒命名为pMD-PRES1ME。(图3)四、取pMD-PRES1ME质粒进行核苷酸序列测定。结果表明，pres1me基因全长324bp，其核苷酸序列及相应的氨基酸序列分别见序列表3和序列表4(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，与所设计的序列相同。
乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原基因(pres1me)同gst基因融合表达一、构建原核融合表达质粒pGEX-PRES1ME重组质粒pMD-PRES1ME经BamHI/SalI双酶切后，回收目的片段。原核融合表达载体pGEX-4T-1经BamHI/SalI双酶切后，回收载体片段。两个片段在DNA连接酶作用下于16℃连接过夜，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布Amp+琼脂培养平板，37℃过夜，挑取16个克隆进行小量质粒抽提，用BamHI/SaI酶切及1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定出阳性克隆。重组质粒命名为pGEX-PRES1ME。(图4)二、筛选高效表达克隆从上述鉴定出的pGEX-PRES1ME阳性克隆中挑取6株菌，用转入空白载体pGEX-4T-1的2株菌作对照，分别在3mL的LB培养基中37℃扩增12h，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mmol/L诱导3h。诱导结束后各取1mL菌液，常规处理及7.5％PAGE电泳检测，根据肉眼观察电泳条带中目的蛋白条带浓度来筛选高效表达克隆。
三、优化诱导表达条件用上述筛选获得的高效表达株进一步实验优化诱导表达条件。首先，确定诱导的菌液浓度，在3mL的LB培养基中，新鲜过夜培养菌液按1∶100接种，于37℃培养，高速振摇280rpm/min，取不同时间点测定OD600值，在不同OD600值下以0.1mmol/L IPTG诱导3h，收集菌液1mL，检测蛋白表达情况。而后，确定IPTG诱导的温度，以菌液OD600约为1.0时开始诱导，分别在20℃、25℃、28℃、30℃及37℃诱导3h，收集菌液1mL，检测蛋白表达量。而后，在菌液OD600约为1.0，诱导温度28℃，IPTG浓度0.1mmol/L条件下，确定诱导时间，取诱导1h、2h、3h及4h的菌液1mL，检测蛋白表达量。最终确定菌液OD600＝1.0、温度为28℃、IPTG浓度为0.1mmol/L、诱导时间为3h为最佳诱导表达条件。
四、融合蛋白GST-PRES1ME的大量表达和亲和层析纯化应用上述确定的诱导表达条件，并优化超声破碎条件和洗脱条件来大量获得融合蛋白GST-PRES1ME。具体步骤将重组菌划Amp+琼脂培养平板，37℃过夜。挑取单克隆菌落在10mL的LB培养基中37℃扩增12h，而后，按1∶100接种稀释接种于预热的LB培养基中，高速振摇2h，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于28℃诱导3h。用8000rpm/min×10min 4℃离心收集菌体，对应1mL菌液用50μL冰预冷的1×PBS悬浮细菌，在冰浴中进行超声破碎，取少量尝试在破碎时分别加入溶菌酶或加入TritonX-100或加入DTT辅助破碎。而后，破碎液内加入20％的TritonX-100至终浓度1％，室温下低速振荡30min，溶解蛋白。用12000rpm/min×10min 4℃离心后将上清转移到干净的器皿中，即为胞浆蛋白提取液。用1×PBS平衡10mL的Glutathione SepharoseTM 4B后，加入上述胞浆蛋白提取液，控制流速1mL/min，用10倍柱床体积的1×PBS洗至基线后，用10mmol/L的还原性谷胱甘肽(溶于50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，洗脱GST-PRES1ME蛋白。蛋白经透析除盐、冷冻干燥后，用纯水溶解，用Bradford法测定浓度pres1me同gst基因融合表达产物GST-PRES1ME的免疫原性研究一、GST-PRES1ME与乙肝前S1抗原ELISA检测试剂盒的反应性所用乙肝前S1抗原ELISA检测试剂盒为上海复星长征医学科学有限公司产品。将GST-PRES1ME蛋白用PBS稀释为1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml三种不同浓度，用乙肝前S1抗原ELISA检测试剂盒进行检测，同时选用1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml三种不同浓度的GST蛋白为对照。具体操作步骤见试剂盒说明书。
结果见表1表1、GST-PRES1ME与乙肝前S1抗原ELISA检测试剂盒的反应结果
二、GST-PRES1ME与乙肝患者血清的反应性用ELISA方法检测。方法是以纯化的GST-PRES1ME包被酶标板，检测160例临床血清标本。具体步骤如下1、包被纯化的GST-PRES1ME用包被液稀释为0.5mg/ml，加100μg/孔，于4℃包被过夜。
2、封闭弃掉包被液，拍干，加封闭液200μl/孔，4℃封闭过夜。
3、准备弃掉封闭液，将板条置于室温干燥过夜。
4、加样用样品稀释液按1∶10稀释待测血清，按100μl/孔加入检测孔中，以样品稀释液作为空白对照，所有检测均设复孔。
5、孵育粘上封板纸，置37℃恒温反应30分钟。
6、洗板用洗板机洗板五次，拍干。
7、酶标每孔加酶标二抗工作液(HRP-羊抗人IgG 1∶1000稀释)100μl，粘上封板纸，置37℃恒温反应30分钟。
8、洗板同前(6)。
9、显色每孔加TMB显色剂A、B各50μl，37℃避光显色10-15分钟。
10、终止每孔中加终止液50μl，轻轻混匀，终止反应。
11、比色测双波长OD450nm/630nm，空白孔校零，酶标检测仪测光吸收值。
12、结果判定OD待测样本≥0.105时为阳性；反之为阴性。
结果见表2表2、GST-PRES1ME与乙肝患者血清的反应性
由表2数据计算可知用GST-PRES1ME进行血清中前S1抗体检测时，在乙肝患者血清(以乙肝两对半五项指标出现任何一项阳性为标准)中的检出率为41.1％，在非乙肝患者(以乙肝两对半五项指标全阴为标准)中的检出率为0，具有良好的灵敏度和特异性。
三、抗GST-PRES1ME与4条Pres1区表位合成肽及基因工程表达的Pres1蛋白的反应性1、动物免疫及免疫血清的收集①制备GST-PRES1ME乳化液将纯化的GST-PRES1ME经干燥后用纯水溶解，调整蛋白浓度为0.2μg/μ1，加入等体积的完全弗氏佐剂(首次接种时)和不完全弗氏佐剂(加强免疫时)后，用超声破菌器在100w功率下，冰水浴中多次乳化(一次乳化2mL，共需10次左右)，取乳化后液体5～10μl滴入冷水中，油滴浮于水面而不分散者为乳化完全。
②免疫动物免疫用BALB/c小鼠购于上海第二军医大学实验动物中心，雄性，健康6周龄。将小鼠背部皮肤酒精消毒，选择3～4个部位分别注射乳化液0.1～0.5ml/处，接种剂量为首次注射0.1mg/只·次，加强注射为0.04mg/只·次，0、3、6周各接种一次，同时设PBS免疫对照组，每组小鼠各为6只。分别于0、2、5、8、11、14、20、40周采血，血液置室温中凝固约1h，然后置4℃过夜进一步收缩血块，第2天4℃下10000rpm/min×10min，收集上清液即为血清，并及时分装冻存。
2、鼠抗GST-PRES1ME血清与Pres1区表位合成肽及基因工程表达的Pres1蛋白的反应性以4条不同的Pres1区合成肽[氨基酸序列见(SEQ ID NO.4)]及原核表达的Pres1蛋白分别包被Immunuoplate Maxisorp检测板，应用ELISA方法检测免疫小鼠血清中是否含有特异识别4条Pres1区表位合成肽及Pres1蛋白的特异性抗体(结果见图5)。由图可以看出，4条肽及Pres1蛋白均可被鼠抗GST-PRES1ME血清识别。此结果提示，GST-PRES1ME中所包含的4条表位均能诱导机体产生相应的抗体，此抗体能特异识别前S1抗原，预示其作为疫苗应用时，可能具有诱导保护性抗体的能力。
由以上结果表明，本发明乙型肝炎病毒多表位抗原的基因克隆pres1me及其编码的蛋白PRES1ME，可用于制备HBV前S1抗体或抗原的检测试剂，也可用于制备HBV核酸疫苗及多肽疫苗。
SEQUENCE LISTING<110>上海复星长征医学科学有限公司<120>SEQ ID NO.1<130>书<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>27<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>1Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala1 5 10 15Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro20 25<210>2<211>27<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>2
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<110>上海复星长征医学科学有限公司<120>SEQ ID NO.4<130>书<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>107<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>1Met Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly1 5 10 15Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Phe Asn Phe Gly Ala Gly Ala Ser Ser20 25 30Ser Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Phe Asp Pro Ala Phe Lys35 40 45Ala Asn Ser Asp Asn Pro Asp Ser Asp Phe Asn Phe Gly Ala Gly Ala50 55 60
Ser Ser Ser Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ala Gly Ala Ser Ser65 70 75 80Ser Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Phe Asn85 90 95Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly100 105
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原的基因克隆pres1me，其特征在于它包含了HBV基因组前S1区中B细胞表位区段4段，各表位区段基因之间以甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸的编码序列为接头串联而成，pres1me的核苷酸序列如下atgccattaggtttcttcccagaccaccaattagacccagctttcggtgctaactctaacaacccagacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccccattaggtttcttcccagaccaccaattcgacccagctttcaaagctaactctgacaacccagactccgacttcaacttcggtgccggtgcctcttcctccggtggtttattaggttggtctggtgccggtgcctcttcctccttcggtgctaactctaacaacccagactgggacttcaacttcaacaaagaccactggccagaagctaaccaagttggttag。
2.根据权利要求
1所述的一种乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原的基因克隆pres1me，其特征在于其编码蛋白PRES1ME的氨基酸序列如下METProLeuGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerProLeuGlyPhePheProAspHisGlnPheAspProAlaPheLysAlaAsnSerAspAsnProAspSerAspPheAsnPheGlyAlaGlyAlaSerSerSerGlyGlyLeuLeuGlyTrpSerGlyAlaGlyAlaSerSerSerPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTrpAspPheAsnPheAsnLysAspHisTrpProGluAlaAsnGlnValGly。
3.根据权利要求
1所述的一种乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原的基因克隆pres1me在制备HBV核酸疫苗或多肽疫苗中的应用。
4.根据权利要求
2所述的一种乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原的基因克隆pres1me的编码蛋白在制备HBV前S1抗体或抗原的检测试剂中的应用。
5.根据权利要求
2所述的一种乙型肝炎病毒前S1区多表位抗原的基因克隆pres1me的编码蛋白在制备HBV多肽疫苗中的应用。
专利摘要
本发明涉及生物工程技术领域：
，本发明公开了乙型肝炎病毒前S1区(PreS1)多表位抗原的基因克隆pres1me及其编码序列PRES1ME。pres1me包含了HBV基因组前S1区中B细胞表位区段4段，经研究表明，它与gst基因的原核融合表达产物GST－PRES1ME与乙肝前S1抗原ELISA检测试剂盒的反应结果为阳性，用其制备ELISA板后可在乙肝血清中检测出乙肝前S1抗体，GST－PRES1ME免疫小鼠后的血清能特异识别四条Pres1表位合成肽及前S1全长蛋白。因此，pres1me及其表达产物PRES1ME可用于制备HBV前S1抗体或抗原的检测试剂及乙肝疫苗。
文档编号A61P31/00GK1990874SQ200510112382
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日
发明者龚育平 申请人:上海复星长征医学科学有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan