专利名称:一种5－氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法
技术领域：
本发明涉及一种5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，具体的说涉及一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法。
背景技术：
D-D4FC(β-D-2’，3’-双脱氢双脱氧-5氟胞嘧啶核苷)是一种新型抗HIV病毒的核苷类药物。以1次/天或2次/天的剂量服用，可有效地抑制HIV原生菌，抗AZT(齐多呋啶，3’-脱氧-3’-叠氮胸苷)菌株和抗3TC(拉米呋啶，3’-硫代胞苷)菌株及抗其它NRTIs(核苷逆转录酶抑制剂)，NNRTIs(非核苷逆转录酶抑制剂)，PIs(蛋白酶抑制剂)类药物的HIV变异菌株(AntimicrobAgents Chemother，2002，46(5)1394-1401.)。目前为止，在服用D-D4FC的病体内尚未发现新的HIV变异菌株。重要的是，D-D4FC与除DDI(2’，3’-双去氧肌苷)的其它病毒抑制剂联合用药无相互抑制作用，且几乎无细胞毒性，是一种极具潜力的抗HIV药物。目前，D-D4FC正在美国，法国和德国进行II期临床，其III期临床也正计划启动(CohenC，Katlama C，et al.3th IAS Conference，2005，Rio de Janeiro，Brazil.)。
到目前为止，D-D4FC多为有化学合成法的报道(J Org Chem，1992，57(14)3887；J MedChem，1999，42(5)859；Bioorg Med Chem Lett，1998，8(22)3245；J Med Chem，1999，42(5)859；Carbohydrate Res.1997，300(4)375；Tetrahedron Lett，2005，468099-8102.)，这些合成路线的收率都比较低，摩尔总收率都在10％左右；化学合成的条件比较苛刻，需在低温下操作，工业化难度比较大；在化学合成的过程中需要用不可回收的重金属催化剂，不仅对工人的身体有毒害，而且对环境也很不友好，不符合现在倡导的绿色友好化学的主题。
2006年，酶法合成D-D4FC的方法被报道，产率达到25％(Biocatal and Biotransform，2006，24(4)253-256.)。该方法可一步合成D-D4FC，产品光学纯度高，副产物少，反应无污染。然而，此方法受到酶的催化平衡的影响，产率只能达到25％。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶合成方法，以解决现有化学方法及酶法合成中总体产率低于25％，耗时长，且不利于工业化大规模连续生产的不足。
本发明的一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，包括如下步骤
将反应式中结构式1的胸腺嘧啶核苷在整细胞存在的缓冲液中与5-氟胞嘧啶进行碱基交换反应，37℃-50℃反应10-40小时，得到结构式2的含氟核苷类似物即5-氟胞嘧啶核苷。
其中反应式为 所述的缓冲液为KH2PO4缓冲液、NaH2PO4缓冲液、Tris缓冲液中的一种或几种的混合。反应过程中加入25 mmol/L D-D4T和50 mmol/L 5-FC，并加入含有N-脱氧核糖转移酶的整细胞3g；所述的含有N-脱氧核糖转移酶的整细胞是乳酸杆菌整细胞。
优选的合成方法为1mL 50mmol//L pH＝6～10的NaH2PO4缓冲液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)及0.1～3g乳酸杆菌于5mL的锥形瓶中，以多层纱布封口。在37～50℃空气摇床中以120r/min振荡反应10～20h。反应结束，将反应体系冻存于-20℃终止。
本发明公开的方法使D-D4T到D-D4FC的转化率达到49.4％，相比于化学合成法约10％和酶法约25％的产率，该法使D-D4FC的产率得到了很大提高；该法在20小时内即可达到49.4％转化率，相比其它方法，时间大大缩短；并且该法中应用整细胞催化，回收方便，可连续应用，有利于工业化大规模生产。
具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求
书所限定的范围。
实施例11mL 50mmol//L pH＝8的NaH2PO4缓冲液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC 6.4mg(50mmol/L)，及1.2g乳酸杆菌于5mL的锥形瓶中，以多层纱布封口。在40℃空气摇床中以120r/min振荡反应12.5h。反应结束，将反应体系冻存于-20℃终止。样品解冻后以10000r/min，15min离心去除整细胞，所得清液过滤后，用于HPLC检测。
实施例21mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4缓冲液中，加入D-D4T 5.6 mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)，及2g乳酸杆菌于5mL的锥形瓶中，以多层纱布封口。在40℃空气摇床中以120r/min振荡反应12.5h。反应结束，将反应体系冻存于-20℃终止。样品解冻后以10000r/min，15min离心去除整细胞，所得清液过滤后，用于HPLC检测。
实施例31mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4缓冲液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)，及1.2g乳酸杆菌于5mL的锥形瓶中，以多层纱布封口。在40℃空气摇床中以120r/min振荡反应100h。反应结束，将反应体系冻存于-20℃终止。样品解冻后以10000r/min，15min离心去除整细胞，所得清液过滤后，用于HPLC检测。
实施例41mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4缓冲液中，加入D-D4T 11.2mg(50mmol/L)，5-FC12.8mg(100mmol/L)，及1.2g乳酸杆菌于5mL的锥形瓶中，以多层纱布封口。在40℃空气摇床中以120r/min振荡反应12.5h。反应结束，将反应体系冻存于-20℃终止。样品解冻后以10000r/min，15min离心去除整细胞，所得清液过滤后，用于HPLC检测。
反应过程中定性分析采用TLC法二氯甲烷-甲醇-水(8∶2∶0.25，v/v)为展开剂，紫外显色；反应混合物冻干后以甲醇萃取并减压蒸干，所得固体混合物过硅胶层析柱(20％CH3OH/CH2Cl2，v/v)纯化；反应混合物离心去除整细胞并过滤处理后，可用于HPLC定量检测。
权利要求
1.一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，包括步骤(1)1mL 50mmol缓冲液，加人25mmol/L胸腺嘧啶核苷，50-100mmol/L5-氟胞嘧啶，pH6～10进行碱基交换反应；(2)加人0.1～3g含有N-脱氧核糖转移酶的整细胞，37℃-50℃，反应10-40小时，结束后将反应体系冻存于-20℃终止。
2.根据权利要求
1所述的一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，其特征在于所述的缓冲液是KH2PO4缓冲液、NaH2PO4缓冲液或Tris缓冲液中的一种或几种的混合。
3.根据权利要求
1所述的一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，其特征在于所述的含有N-脱氧核糖转移酶的整细胞是乳酸杆菌整细胞。
4.根据权利要求
1所述的一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，其特征在于所述的1.2g乳酸杆菌于5mL的锥形瓶中，以多层纱布封口，在40℃空气摇床中以120r/min振荡反应12.5h。
5.根据权利要求
1所述的一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，其特征在于所述的50mmol/L5-氟胞嘧啶及2g乳酸杆菌。
6.根据权利要求
1所述的一种5-氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，其特征在于所述的100mmol/L5-氟胞嘧啶及1.2g乳酸杆菌。
专利摘要
本发明公开了一种5－氟胞嘧啶核苷的整细胞酶促合成方法，包括胸腺嘧啶核苷在整细胞(含有N－脱氧核糖转移酶)存在的缓冲液中与5－氟胞嘧啶进行碱基交换反应，37℃－50℃反应10－20小时，得含氟核苷类似物即5－氟胞嘧啶核苷。该方法中5－氟胞嘧啶核苷产率在20小时内可达到49.4％，相比于其它合成方法，产率提高，时间缩短，并且该法应用整细胞催化，回收方便，可连续应用，有利于工业化大规模生产。
文档编号C12P19/00GK1995370SQ200610118924
公开日2007年7月11日 申请日期2006年11月30日
发明者朱利民, 戚娜 申请人:东华大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan