隆生产，也可被合成。本发明所属领域的技术人员可容易地确定 可在本发明的背景下设计和使用的多种引物和探针。
[0107] 基因表达谱分析的方法包括基于寡核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的 方法和确定该寡核苷酸的蛋白水平的蛋白组学方法。本领域已知的定量样品中RNA表达的 示例性方法包括但不限于Southern印迹、Northern印迹、微阵列、聚合酶链式反应（PCR)、 NASBA 和 TMA。
[0108] 核酸序列可通过使用与互补序列（例如寡核苷酸探针）的杂交检测（参见美 国专利号 5, 503, 980 (Cantor)、5, 202, 231 (Drmanac 等人）、5, 149, 625 (Church 等人）、 5, 112, 736(Caldwell 等人）、5, 068, 176(Vijg 等人）和 5, 002, 867(Macevicz))。杂交检 测方法可使用探针阵列（例如在DNA芯片上）以提供关于在一个碱基不同的一组四个相 关探针中选择性杂交于精确地互补的探针序列的靶标核酸的序列信息（参见美国专利号 5, 837, 832 和 5, 861，242 (Chee 等人））。
[0109] 检测步骤可使用任何已知方法通过与探针寡核苷酸杂交检测核酸的存在。检测 步骤的一个具体实例使用均质检测方法，例如先前在Arnold等人，Clinical Chemistry 35:1588-1594(1989)和美国专利号 5, 658, 737 (Nelson 等人）和 5,118,801 和 5, 312, 728 (Lizardi等人）中详细说明的。
[0110] 可使用探针的检测方法的类型包括Southern印迹（DNA检测）、点或槽印迹（DNA、 RNA)和Northern印迹（RNA检测）。经标记的蛋白也可用于检测其结合的特定核酸分子 (例如用 far western 技术检测蛋白：Guichet 等人，1997，Nature 385(6616) :548-552;和 Schwartz等人，2001，EMBO 20(3) :510-519)。其他检测方法包括含有在试纸（dipstick) 装置上的本发明的试剂的试剂盒等。当然，优选地使用适于自动化的检测方法。其非限制 性实例包括包括一个或多个（例如阵列）不同的探针的芯片或其他支撑物。
[0111] "标记"指可被检测或导致可检测信号的分子部分或化合物。标记可直接或间接地 与探针/引物或待检测的核酸（例如扩增的序列）结合。直接标记可通过连接该标记和该 核酸的键或相互作用（例如共价键或非共价键）进行，而间接标记可通过使用直接或间接 标记的"接头"或连接部分，例如额外的寡核苷酸进行。连接部分可放大可检测信号。标记 可包括任何可检测部分（例如放射性核素、配体例如生物素或亲和素、酶或酶底物、反应基 团、发色团例如染料或有色分子、发光化合物包括生物发光、磷光或化学发光化合物和荧光 化合物）。优选地，经标记的探针上的标记在均质测定系统中可检测，即在混合物中，结合的 标记与未结合的标记相比，表现可检测的改变。已知其他标记核酸的方法，其中标记作为其 片段附着在核酸链上，可用于标记待通过与固定化的DNA探针阵列杂交检测的核酸（例如 参见 PCT No. PCT/IB99/02073)。
[0112] 如本文所用，"寡聚核苷酸"或"寡核苷酸"定义具有两个或多个核苷酸（核糖核苷 酸或脱氧核糖核苷酸）的分子。寡核苷酸的大小将由具体条件决定，最终根据其具体用途， 由本领域技术人员相应地改变。寡核苷酸可化学地合成或根据众所周知的方法通过克隆获 得。尽管它们通常为单链的形式，它们可以是双链形式，甚至包括"调控区"。它们可含有天 然或合成核苷酸。它们可被设计以增强选定的标准，例如稳定性。脱氧核苷酸和核糖核苷 酸的嵌合物也在本发明的范围内。
[0113] 术语"微阵列"指附着于固体支撑物的可杂交分子（例如寡核苷酸或多肽）的有 序排列。使用微阵列技术作为基因表达谱分析工具的主要目的是同时研宄某些处理、疾病 和发育阶段对数以千计的基因的表达水平的影响。例如，基于微阵列的基因表达谱分析可 用于识别其表达与正常个体相比在肿瘤样品中上调或下调的基因。
[0114] "固定化探针"或"固定化核酸"指与固体支撑物的捕获寡聚体直接或间接结合的 核酸。固定化探针是与固体支撑物结合，促进样品中结合的靶标序列与未结合的材料分离 的寡聚体。可使用任何已知的固体支撑物，例如用任何已知材料（例如硝化纤维素、尼龙、 玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯硅烷和金属颗粒，优选地顺磁性颗粒）制 成的基质或溶液中游离的颗粒。优选的支撑物是单分散顺磁性球（即大小均一，土约5% )， 从而提供一致的结果，固定化探针稳定地直接（例如通过直接共价连接、螯合或离子相互 作用）或间接（例如通过一个或多个接头）地与其结合，允许与溶液中的另一核酸杂交。
[0115] "互补DNA (cDNA) "指通过逆转录RNA (例如mRNA)合成的重组核酸分子。
[0116] "扩增"或"扩增反应"指任何用于获得靶标核酸序列或其补体或者其片段的多个 拷贝（"扩增子"）的体外过程。体外扩增指可含有少于完整靶标区序列或其补体的扩增 的核酸的生产。体外扩增方法包括例如转录介导的扩增、复制酶介导的扩增、聚合酶链式 反应（PCR)扩增、连接酶链式反应（LCR)扩增和链取代扩增（SDA，包括多链取代扩增方法 (MSDA))。复制酶介导的扩增使用自身复制性RNA分子和复制酶例如Q0 -复制酶（例如 Kramer等人，美国专利号4, 786, 600)。PCR扩增众所周知，使用DNA聚合酶、引物和热循环 合成DNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝（例如Mullis等人，美国专利号4, 683, 195、 4, 683, 202和4, 800, 159)。LCR扩增使用至少4个单独的寡核苷酸通过使用多个杂交、连接 和变性的循环扩增靶标及其互补链（例如EP专利申请公开号0 320 308)。SDA是其中引物 含有限制性内切酶的识别位点，允许限制性内切酶切割半修饰的DNA双链的一条包括靶标 序列的链，然后在多个引物延伸和链取代步骤中扩增的方法（例如Walker等人，美国专利 号5, 422, 252)。其他两个已知的链取代扩增方法不需要内切酶切割（Dattagupta等人，美 国专利号6, 087, 133和美国专利号6, 124, 120 (MSDA))。本领域技术人员将理解，本发明的 寡核苷酸引物序列可容易地用于任何基于由聚合酶引起的引物延伸的体外扩增方法（总 体上参见 Kwoh 等人，1990, Am. Biotechnol. Lab. 8 :14 25 和（Kwoh 等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,1173 1177 ;Lizardi 等人，1988，BioTechnology 6:1197 1202 ;Malek 等 人，1994, Methods Mol. Biol.，28 :253 260 和 Sambrook 等人，2000, Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第三版，CSH Laboratories)。如本领域众所周知，寡核苷酸被设计以 在选择的条件下结合互补序列。
[0117] 如本文所用，"引物"定义能与靶标序列退火，从而产生可在适当条件下作为核酸 合成起点的双链区的寡核苷酸。引物可被例如设计为特异于某个等位基因以便用于等位基 因特异性扩增系统。例如，引物可被设计以便于与差异表达的与前列腺的恶性肿瘤状态相 关的RNA互补，而来自同一基因的另一差异表达的RNA与其非恶性肿瘤状态（良性）相关。 引物的5'区可与靶标氨基酸序列不互补并包括额外的碱基，例如启动子序列（称为"启动 子引物")。本领域技术人员将认识到，任何可起到引物功能的寡聚体可被修饰为包括5'启 动子序列，因而起到启动子引物的功能。类似地，任何启动子引物可独立于其功能启动子序 列起到引物的作用。当然，从已知核酸序列设计引物是本领域众所周知的。寡核苷酸可包括 多种类型的不同核苷酸。本领域技术人员可通过使用众所周知的数据库（例如Genbank?) 进行计算机比对/搜索容易地评估所选引物和探针的特异性。引物和探针可使用公众可 获得的序列数据库例如NCBI参考序列（RefSeq)数据库根据mRNA转录物中存在的外显子 或内含子序列设计。必要或希望时，引物和探针被设计为检测目的基因的最大转录物数量 而不检测具有相似序列的基因产物例如同系物。本领域技术人员将认识到，引物和探针设 计需要多个步骤例如将靶标序列定位到基因组、识别外显子-内含子结合处并在每个结合 处设计引物、识别可用一组引物同时或分别检测的SNP和转录物变体。影响引物设计的其 他因素包括但不限于：引物长度、熔化温度（Tm)、G/C含量、特异性、互补引物序列、引物二 聚体和3'序列。对于一般用途，最佳引物和探针可用任何市售或以其他方式可公开获得 的引物 / 探针设计软件例如 PrimerExpress?(Applied Biosyst em) Primer3?(http: // primer3. sourceforRe. net)设计。与本文公开的实施例相关的每个测定使用焚光标记的 TaqMan?lMinor Groove Binder(MGB)探针和两个未标记的PCR引物。由于被设计在 两步RT-PCR的通用热循环条件下工作，本文实施例中使用的引物一般长17-30碱基，含约 50-60%的G+C碱基，表现50至80°C的Tm。TaqMan?:测定使用5'核酸酶化学和整合MGB 技术的探针。MGB技术通过结合DNA双螺旋的小沟增强探针Tm。此Tm增强允许使用短达 13碱基的探针。更短的探针允许更好的特异性和更短的扩增子大小。表1、表2和表5提 供关于本发明的引物、探针和扩增子序列的更多信息。
[0118] 术语"扩增对"或"引物对"指本发明的一对寡聚核苷酸（寡核苷酸），其被选择以 共同用于通过多种扩增过程中的一种扩增选定的核酸序列（例如标志物）。
[0119] 以下技术包括在"扩增和/或杂交反应"的范围内。
[0120] 聚合酶链式反应（PCR)。聚合酶链式反应可根据已知技术进行。参见例如美国专利 号4, 683, 195 ;4, 683, 202 ;4, 800, 159和4, 965, 188 (以上3个美国专利的公开内容通过引 用并入本文）。通常PCR涉及在杂交条件下用用于待检测的具体序列的每条链的一个寡聚 核苷酸引物处理核酸样品（例如在热稳定性DNA聚合酶存在下）。合成的每个引物的延伸产 物与两条核苷酸链的每条互补，其中引物与与其杂交的具体序列的每条链充分地互补。从 每个引物合成的延伸产物也可作为用相同的引物进一步合成延伸产物的模板。在足够轮数 的延伸产物的合成后，分析样品以评估待检测的序列是否存在。扩增的序列的检测可通过 在电泳后用溴化乙锭（EtBr)染色对DNA可视化，或使用根据已知技术的可检测标记，等等。 关于 PCR 技术的综述（参见 PCR Protocols，A Guide to Methods and Amplifications， Michael 等人，编辑，Acad. Press，1990)。
[0121] 基于核酸序列的扩增（NASBA)。NASBA可根据已知技术进行（Malek等人，Methods Mol Biol，28 :253-260、美国专利号 5, 399, 491 和 5, 554, 516)。在一个实施方案中，NASBA 扩增以反义引物Pl (含有T7 RNA聚合酶启动子）与mRNA靶标的退火开始。逆转录酶（RTA 酶）随后合成互补DNA链。双链DNA/RNA杂交物被消化RNA链的RNA酶H识别，剩下单链 DNA，有义引物P2可与其结合。P2作为合成第二条DNA链的RTA酶的锚定点。获得的双链 DNA具有被相应的酶识别的功能T7 RNA聚合酶启动子。随后该NASBA反应可进入循环扩 增阶段，包括6个步骤：（1)用T7 RNA聚合酶合成短反义单链RNA分子（每个DNA模板101 至103个拷贝）；（2)引物P2与该RNA分子退火；（3)用RTA酶合成互补DNA链；（4)消化 DNA/RNA杂交物中的RNA链；（5)引物Pl与单链DNA退火；和（6)用RTA酶产生双链DNA分 子。由于NASBA是等温的（41°C)，如果在样品制备过程中防止了 dsDNA的变性，特异性扩 增ssRNA是可能的。因此可在dsDNA背景中获得RNA而不获得由基因组dsDNA导致的假阳 性结果。
[0122] 转录介导的扩增（TM)。TM是等温的基于核酸的方法，可在数小时内将RNA或 DNA靶标扩增十亿倍。TMA技术在Gen-Probe (例如参见美国专利号5, 399, 491、5, 480, 784、 5, 824, 818和5, 888, 779)，使用两个引物和两个酶：RNA聚合酶和逆转录酶。一个引物含有 RNA聚合酶的启动子序列。在扩增的第一步中，此引物与靶标rRNA在定义的位点杂交。逆 转录酶通过从该启动子引物的3'末端延伸产生靶标rRNA的DNA拷贝。获得的RNA :DNA双 链中的RNA被逆转录酶的RNA酶活性降解。然后，第二个引物与该DNA拷贝结合。由逆转 录酶从此引物的末端合成第二DNA链，产生双链DNA分子。RNA聚合酶识别该DNA模板中 的启动子序列并起始转录。每个新合成的RNA复制子重新进入TMA过程并作为新一轮复制 的模板。上述反应产生的扩增子由特异性基因探针在杂交保护测定（一种化学发光检测格 式）中或使用其他探针特异性技术（例如分子信标）检测。
[0123] 有或没有靶标序列